ניקוי אופטי מהיר לניתוח בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול

Summary

ספרואידים של גידולים הופכים להיות מנוצלים יותר ויותר כדי להעריך אינטראקציות בין תאים למיקרו-סביבה של הגידול ואת התגובה לטיפול. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חזקה אך פשוטה להדמיה בתפוקה גבוהה למחצה של כדוריות גידול תלת-ממדיות באמצעות ניקוי אופטי מהיר.

Abstract

ספרואידים של גידולים הופכים במהירות לדבר שבשגרה בחקר הסרטן הבסיסי ובפיתוח תרופות. קבלת נתונים לגבי ביטוי חלבונים בתוך הספרואיד ברמה התאית חשובה לניתוח, אך הטכניקות הקיימות הן לעתים קרובות יקרות, מייגעות, משתמשות בציוד לא סטנדרטי, גורמות לעיוות גודל משמעותי, או מוגבלות לספרואידים קטנים יחסית. פרוטוקול זה מציג שיטה חדשה להרכבה וניקוי של כדוריות המטפלות בבעיות אלה תוך מתן אפשרות לניתוח קונפוקלי של המבנה הפנימי של הספרואידים. בניגוד לגישות הקיימות, פרוטוקול זה מספק הרכבה מהירה וניקוי של מספר רב של ספרואידים באמצעות ציוד סטנדרטי ואספקת מעבדה. הרכבה של כדוריות בתמיסת ג'ל agarose-PBS ניטרלית pH לפני הצגת תמיסת סליקה המותאמת למקדם שבירה, ממזערת עיוות גודל המשותף לטכניקות דומות אחרות. זה מאפשר ניתוח כמותי וסטטיסטי מפורט שבו הדיוק של מדידות גודל הוא בעל חשיבות עליונה. יתר על כן, בהשוואה לתמיסות ניקוי נוזלי, טכניקת הג'ל האגרוז שומרת על כדוריות קבועות במקומן, ומאפשרת איסוף של תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות). המאמר הנוכחי מפרט כיצד השיטה מניבה תמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות באיכות גבוהה המספקות מידע על השתנות בין תאים ומבנה ספרואידי פנימי.

Introduction

תרביות תאים תלת-ממדיות (3D), כגון ספרואידים, מספקות מודלים מציאותיים מבחינה ביולוגית וניתנים לשחזור של צמיחת תאים מצטברת ^1,2. מודלים אלה הופכים במהרה לדבר שבשגרה הן במחקר בסיסי והן בפיתוח תרופות, שם נבחנים הבדלים בגודל ובמבנה הספרואידים בין הטיפולים כדי לוודא את יעילות התרופה ^3,4. בהקשרים אלה, היכולת לאסוף מידע מפורט ממספר רב של כדוריים היא בעלת יתרון רב, הן מנקודת מבט של כוח סטטיסטי והן כדי לאפשר הערכה מהירה של התנהגות התאים על פני מספר טיפולים.

טכניקות נפוצות לקבלת תמונות מיקרוסקופיה מפורטות של מבנה ספרואידי גוזלות זמן רב, יקרות, או מפיקות תמונות באיכות ירודה שאינן שומרות על תכונות כמותיות מרכזיות כגון גודל ספרואיד ^4,5. לדוגמה, טכניקות היסטולוגיות המבוססות על cryosectioning יכולות לספק תמונות באיכות גבוהה אך לעתים קרובות הן גוזלות זמן רב, דורשות עבודה מיומנת, ולעתים קרובות יוצרות חפצי חתך ^6,7, בעוד שטכנולוגיות אלגנטיות, כגון מיקרוסקופ תאורה במישור יחיד (SPIM)⁸ ומיקרוסקופיה מרובת פוטון⁹ דורשות מיקרוסקופים מיוחדים שאינם זמינים בקלות. טכנולוגיות מיקרוסקופיה מודרניות אפשרו לאחרונה את מה שמכונה חתך אופטי, שבו הספרואידים ממוקמים בתוך תמיסת סליקה מותאמת למקדם שבירה ותמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ^4,5. בעוד שלטכניקות אלה יש פוטנציאל לייצר תפוקה גבוהה, בעיות נפוצות כוללות תנועה כדורית תוך כדי הדמיה, עיוות גודל בזמן ניקוי, וההוצאה הגבוהה של פתרונות סליקה קנייניים. יתר על כן, פרוטוקולים קיימים רבים חלים רק על ספרואידים קטנים יחסית בקוטר או בעומק של פחות מ-300 מיקרומטר עד 100 מיקרומטר, ומגבילים את הטכנולוגיה לשלבים המוקדמים של צמיחת הגידול ^5,10,11.

הפרוטוקול הנוכחי מאפשר איסוף בתפוקה גבוהה למחצה ובעלת תפוקה גבוהה של תמונות ספרואידיות מפורטות באמצעות תמיסת סליקה תואמת מקדם שבירה בעלות נמוכה הנגזרת מהליכי ניקוי איברים שלמים^12,13. כדי למנוע תנועה כדורית במהלך ההדמיה ולספק תמיכה מבנית להפחתת עיוותי גודל, הספרואידים מותקנים בג'ל agarose-PBS בצלחת תחתונה מזכוכית #1.5 בעלת 24 בארות. מכיוון שטכניקה זו מאפשרת להרכיב מספר כדוריות בכל באר בצלחת של 24 בארות, ניתן להרכיב במהירות עד 360 ספרואידים (15 ספרואידים/באר) ולדמות אותם בתנאי ניסוי שונים. תמיסת סליקה תואמת-מדד שבירה הבנויה מחומרים מתכלים זמינים בקלות משמשת לפינוי כדוריות המותקנות ועל הג'ל שמסביב באופן אופטי. לאחר תקופת התיישבות של 24 שעות, פרוטוקול זה מספק תמונות דו-ממדיות ותלת-ממדיות באיכות גבוהה של מבנה ספרואידי, אפילו עבור ספרואידים גדולים יחסית (בקוטר של כ-700 מיקרומטר), עם עיוות בגודל של פחות מ-2%.

Protocol

הפרוטוקול מתאר את ההכנה של כמות מספקת של כדוריות גידול כדי להרכיב צלחת אחת של 24 בארות (כ-240-360 ספרואידים או 10-15 ספרואידים/באר) ב-200 μL של ג'ל אגרוז לבאר ו-500 μL של תמיסת ניקוי לכל באר. ההליך המלא מודגם באיור 1.

1. 2% הכנת ג'ל אגרוז-PBS

1. שוקלים 0.5 גרם של אגרוז נמס נמוך (ראו טבלת חומרים) בבקבוק זכוכית ומוסיפים 25 מ"ל של מי מלח עם מאגר פוספט (PBS).
2. ממיסים את האגרוס על ידי הרתחת התמיסה במיקרוגל במשך 30-60 שניות עם המכסה סגור אך לא אטום ועם מערבולת מתמדת. ודא שאגרוז מומס במלואו והתמיסה אינה רותחת.
   הערה: ניתן לאחסן ג'ל בטמפרטורת החדר; בדוק את אמצעי האחסון לפני השימוש כדי להסביר את האידוי. מביאים למצב הנוזלי (מיקרוגל; 20-60 שניות עם מערבולת) לפני השימוש.

2. הכנת פתרון הסליקה

1. שקלו 9 גרם של N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl) אתילנדיאמין, 22 גרם של אוריאה, 44 גרם סוכרוז, 0.1 גרם של טריטון X-100 ו-24.9 גרם של מים שעברו דה-יוניזציה (ראו טבלת חומרים).
   הערה: קל יותר לשקול את הכמות המשוערת של N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine ולהתאים את המשקל של רכיבים אחרים כדי להשיג את הריכוז הרצוי.
2. מחממים את התמיסה באמבט מים של 56 מעלות צלזיוס עם ערבוב מתמיד וממשיכים עד שכל הגבישים מתמוססים.
3. הנח את התמיסה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לבועות שנוצרו במהלך הערבוב לעלות אל פני השטח. הפתרון יציב בטמפרטורת החדר עד חודשיים.

3. הכנת ספרואידים

1. צור כדוריות בשיטת שכבת העל של אגרוז כפי שתואר קודם לכן ^1,3,14.
   הערה: ספרואידים הנוצרים בשיטות אחרות תואמים גם הם לפרוטוקול הדמיה זה.
2. חותכים את קצה קצה הפיפטה של 1 מ"ל באמצעות אזמל להגדלת הפתח.
   הערה: כל הספרואידים טופלו באמצעות פיפטות של 1 מ"ל או 200 μL עם קצוות חתוכים.
3. באמצעות הפיפטה, שאפו את הספרואידים מהבארות והעבירו אותם לצינור חרוטי שקוף של 1.5 מ"ל. ניתן לשלב מספר כדוריות מאותם תנאים באותו צינור.
   הערה: תמיד אפשרו לספרואידים להתיישב בתחתית הצינור כדי לשאוף למדיום.
4. שטפו את הספרואידים ב-1 מ"ל PBS פעמיים, הוסיפו תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) ניטרלית של 4% שחוממה מראש, והדגירו את הספרואידים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
5. הסר את תמיסת ה- PFA ושטף את הספרואידים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS.

4. צביעה כדורית

1. באמצעות פיפטה, מעבירים עד 15 ספרואידים לצינור PCR של 200 μL.
   הערה: עבור ספרואידים שבירים, הרכיבו את הספרואידים בג'ל (שלבים 5.1-5.4) לפני שתמשיכו.
2. חלחל את התאים באמצעות 200 μL של 0.5% Triton X-100 ב- PBS. הניחו צינורות PCR בתוך צינורות עם מכסה בורג של 50 מ"ל ודגרו את הספרואידים למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם תסיסה קלה.
   הערה: כל הדגירות נעשות תוך תסיסה על רוטור, רולר או שייקר (ראה טבלת חומרים) אלא אם כן צוין אחרת. זה חשוב כדי להשיג צביעה אחידה. כדוריות קבועות ב- PBS יכולות לפעמים להיצמד לדפנות קצה הפיפטה. שטיפת הקצה ב-0.5% טריטון X-100 ממזערת את הספרואידים מלהיצמד לקצוות.
3. החלף את התמיסה (שלב 4.2) ב- 200 μL של מאגר דילול נוגדנים (ABDIL)¹⁵ ודגירה לילה בטמפרטורת החדר.
4. הסר את ABDIL, הוסף 75 μL של נוגדן ראשוני ב- ABDIL, ודגירה בטמפרטורה של 4 °C (7 °F) למשך 2.5 ימים.
5. הסר את ה-supernatant ושטוף עם 200 μL של PBS עם 0.1% Tween ו-0.1% Triton X-100 (PBS-TT) פעמיים ודגרו עם 200 μL של PBS-TT למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר.
6. הסר PBS-TT, הוסף 100 μL של נוגדן משני ב- ABDIL, ודגירה בטמפרטורה של 4 °C (74 °F) למשך 2.5 ימים.
   הערה: ניתן להוסיף DAPI או צבע גרעיני אחר בשלב זה. רוב הצבעים דורשים פחות זמן דגירה מאשר נוגדנים.
7. הסר את ה-supernatant ושטף עם 200 μL של PBS-TT פעמיים ודגירה עם 200 μL של PBS-TT למשך 4 שעות. הספרואידים מוכנים להרכבה.

5. הרכבה

1. באמצעות פיפטה של 200 μL, מעבירים כדוריות קבועות ומוכתמות לצינורות PCR של 500 μL בצינור אחד לכל מצב (כ-10-15 ספרואידים).
2. החלף את התמיסה ב-200 μL של 2% (w/v) ג'ל וצנטריפוגה נוזלית בספין המהיר (במהירות המרבית הקבועה, ראה טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות.
   הערה: אלא אם כן הרכבה מיידית, הניחו בלוק חימום בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס כדי למנוע התקשות ג'ל.
3. שאפו את הספרואידים בג'ל אגרוז נוזלי של כ-50 μL והוציאו פנימה היטב צלחת תחתית זכוכית בעלת 24 בארות.
4. לפני שהג'ל מתקשה, מפרידים את הספרואידים באמצעות קצה פיפטה בג'ל שמסביב, ומוודאים שהספרואידים מכוסים בג'ל. לחלופין, הניחו את הצלחת על הקרח כדי להגדיר במהירות את הג'ל.
   הערה: מספר הספרואידים לכל באר תלוי בגודל הספרואידים. ספרואידים ממוקמים רחוק זה מזה, כך שרק ספרואיד אחד נכנס לשדה הראייה בזמן ההדמיה. זה חשוב לעיבוד תמונה אוטומטי.
5. מוסיפים 500 μL של תמיסת סליקה (שלב 2) לבאר, ומבטיחים שהג'ל שקוע. דגירה ב- RT למשך 24 שעות לפחות ותמונה את הספרואידים בתמיסת הסליקה. כדוריות יציבות בתמיסה זו עד חודש בטמפרטורת החדר וכאשר הן מוגנות מפני אידוי.

6. הדמיה

1. בחר מטרה עם מרחק עבודה ארוך מספיק כדי להקיף את כל הספרואיד, כולל גובה ההרכבה של הספרואיד בכלי.
   הערה: מטרות עם מרחק עבודה של 3 מ"מ או יותר נדרשות כדי לדמות את המישור המשווני של הספרואידים. יעדי הגדלה גבוהים יותר עם NA גבוה יותר יכולים לאפשר רזולוציה טובה יותר, אך יגבילו את העומק המרבי שבו ניתן לצלם את הספרואידים.
2. כדי לזהות את מישור קו המשווה, התאם את המיקוד עד שיגיע לשטח הפנים הגדול ביותר במישור XY ותמונה עם אחוז כוח הלייזר הנדרש, מתח הגלאי, הרווח והגדרות ההיסט הנדרשות.
   הערה: אחוז כוח הלייזר, מתח הגלאי, הרווח וההיסט ישתנו מאוד בהתאם לפלואורופור, עוצמת הכתם, עוצמת הלייזר, רגישות הגלאי וכו '.
3. עבור תמונות תלת-ממדיות, הגדר את ההתחלה והסוף של הספרואידים, ובחר את עוצמת האות המתאימה בעומק z שונים באמצעות הגדרות תיקון עוצמת z לפני ההדמיה.
   הערה: לקבלת רזולוציית התמונה הטובה ביותר, השתמש בקצב הדגימה של Nyquist עבור x, y ו-z (לפרטים, ראה הפניה¹⁶).

Discussion

פרוטוקול לקבלת תמונות דו ותלת מימדיות באיכות גבוהה של כדוריות גידול מוצג כאן. שיטות קיימות, כגון CLARITY, See Deep Brain (SeeDB) ו-ScaleS, גורמות לעיתים קרובות לעיוות גודל בשיעור של עד 30%, בעוד שטכניקות כגון בנזיל אלכוהול/בנזיל בנזואט (BABB) והדמיה תלת-ממדית של איברים המנוקים מממסים (3DISCO) יכולות להרוות חלבון פלואורסצנטי¹⁸. רבות משיטות אלה מיועדות לניקוי רקמות עם שלמות מבנית ומעוותות את הגודל והמבנה כאשר הן מיושמות על ספרואידים¹⁸. בניגוד לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בפתרונות סליקה יקרים הזמינים מסחרית, פרוטוקול זה משתמש בחומרים מתכלים זמינים בקלות תוך שמירה על בהירות אופטית ופלואורסצנציה אנדוגנית ומזעור עיוותי גודל. הטמעת כדוריות בג'ל אגרוז-PBS מספקת תמיכה מבנית לספרואידים וממזערת הלם אוסמוטי כאשר מוסיפים את פתרון הניקוי. זה חיוני כאשר הדמיה של כדוריות שבריריות לאחר טיפול תרופתי. ההנחה היא ששיטת סליקה אופטית זו מתאימה לספרואידים הנוצרים בכל שיטה שכן פרוטוקול זה מותאם מניקוי רקמות שלמות. ההנחה מבוססת על הדמיון בספרואידים המתקבלים על ידי שיטות שונות להיווצרות ספרואידים. הבחירה בקיבוע יכולה להשפיע על גודל הכדורית כמו גם על פלואורסצנציה אנדוגנית. שיטת סליקה זו מתאימה לספרואידים הקבועים בתמיסת PFA ניטרלית של 4%. בדיקה נוספת נדרשת כדי לבדוק את תאימותו עם מקבעים אחרים.

בהתחשב בכך שטכניקה זו מאפשרת להרכיב מספר כדוריות בו זמנית בלוח מרובה בארות, היא מתאימה היטב לצינורות אנליזה כמותיים הדורשים מידע מבנה ספרואידי מעד 360 ספרואידים לכל צלחת של 24 בארות. מיקרוסקופים עם פונקציות אוטומטיות של מיפוי שלבים ולוחות יכולים להפוך את ההדמיה לפחות ידנית. למרות ששיטה זו מהירה וקלה יותר מחתך, היא כרגע אינה מתאימה לאוטומציה מלאה. עם זאת, תמונות המתקבלות בשיטה זו מתאימות לעיבוד תמונה אוטומטי ^4,19, והקצב שבו ניתן להרכיב ספרואידים באמצעות פרוטוקול זה מתאים לניתוח כמותי של מבנה פנימי ספרואידי 20,21,22.

כדי להכתים ספרואידים שלמים, יש להתאים את ריכוז הנוגדנים, נפחם וזמן הדגירה לכל נוגדן. כמדריך, השתמש פי 2.5 מריכוז הנוגדנים הדו-ממדיים המומלץ של נוגדנים אימונופלואורסצנטיים ו-100-200 μL של נוגדנים, בהתאם למספר הספרואידים לכל צינור. ודא שכל הספרואידים מכוסים בתמיסת צביעה כאשר הם על הרוטור. זמן הדגירה תלוי בגורמים רבים, כולל גודל וצפיפות הספרואידים והנוגדן, ויכול לנוע בין 16-72 שעות. למרות השיטה המאפשרת זיהוי אותות עמוק יותר בתוך הספרואיד, פלואורופורים המתלהבים מ-UV גורמים לפיזור אור משמעותי, מה שמוביל ליחס אות לרעש נמוך. יש לנקוט בזהירות בעת בחירת פלואורופורים כדי לדמיין את חלבון המטרה. לדוגמה, צביעת חלבונים פחות שופעים ומבניים עם פלואורופורים באורך גל ארוך יותר וכתמי חלבון או גרעין שופעים יותר עם פלואורופורים באורך גל קצר יותר תשיג את התוצאה הטובה ביותר. לבסוף, ספרואידים מנוקים עדיין מראים אובדן אור עקב פיזור בליבה הנמקית, הניכר בממד y/z של תמונות המתקבלות של 600 מיקרומטר כדוריות (איור 2C).

הדמיית הגדלה גבוהה יותר עם מטרות NA גבוהות יותר אפשרית עם ספרואידים המותקנים ומנוקים באמצעות פרוטוקול זה, אך מרחק העבודה של המטרה מגביל את עומק ההדמיה. עבור עדשת טבילת שמן, חשוב להשתמש בשמן בעל RI של 1.51 לקבלת התוצאה הטובה ביותר.

לסיכום, שיטת הסליקה המוטבעת של ג'ל agarose-PBS מאפשרת הדמיה של תאים עמוק בתוך הספרואידים באמצעות חומרים מתכלים נפוצים הזמינים. ספרואידים המותקנים ומנוקים בשיטה זו עוברים עיוות גודל מינימלי ושומרים על שלמותם המבנית, ומאפשרים איסוף של נתונים באיכות גבוהה הנוגעים למבנה הספרואידי הפנימי ולכימות אוטומטי לאחר מכן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass bottom 24-well plate	Celvis	P24-1.5H-N
500 µL clear PCR tubes	Sigma	HS4422
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson Immuno research	715-605-151	Dilution used 1:500
Bovine serum albumin	Sigma	A7906	Final concentration 2% w/v
DAPI	Sigma	D9542-10MG	Final concentration 5 µg/mL
Deionized water	MILLI Q
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermofisher	A-31573	Dilution used 1:500
DRAQ7	Thermofisher	D15106	Dilution used 1:250
Heating block	Ratek	DBH10	or similar equipment
Hypoxyprobe Kits	Hypoxyprobe	HP1-1000Kit	Antibody dilution used 1:500
Low-melting agarose powder	Sigma	A9414	Final concentration 2% w/v
Microwave	Sharp
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine	Sigma	122262	Final concentration 9% w/w
NaCl	Sigma	S9888	Final concentration 150 mM
NaN3	Sigma	S2002	Final concentration 0.10% w/v
p27 Kip1 (D69C12) XP	Cell Signalling technology	3686S	Dilution used 1:500
Paraformaldehyde solution	Proscitech	C004	Final concentration 4% w/v
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher	18912014	Final concentration 1x
Pipette	Eppendorf
Quickspin minifuge			or similar equipment
Roller	Ratek	BTR10-12V	or similar equipment
Rotor	Ratek	RSM7DC	or similar equipment
Shaker	Ratek	EOM5	or similar equipment
Sucrose	Sigma	S9378	Final concentration 44% w/w
Tris-HCl pH 7.4	Sigma	T5941	Final concentration 20 mM
Triton X-100	Sigma	X100	Final concentration 0.10% v/v
Triton X-100	Sigma	X100	Final concentration 0.1% v/v
Tween 20	Sigma	P1379	Final concentration 0.1% v/v
Urea	Sigma	U5379	Final concentration 22% w/w