Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Tumorsfæroider blir stadig mer brukt til å vurdere tumorcelle-mikromiljøinteraksjoner og terapirespons. Den nåværende protokollen beskriver en robust, men enkel metode for semi-high-throughput avbildning av 3D tumor sfæroider ved hjelp av rask optisk clearing.

Abstract

Tumor sfæroider er raskt blitt vanlig i grunnleggende kreftforskning og narkotika utvikling. Innhenting av data om proteinuttrykk i sfæroiden på mobilnivå er viktig for analyse, men eksisterende teknikker er ofte dyre, arbeidskrevende, bruker ikke-standardutstyr, forårsaker betydelig størrelsesforvrengning eller er begrenset til relativt små sfæroider. Denne protokollen presenterer en ny metode for montering og rydding av sfæroider som adresserer disse problemene, samtidig som det muliggjør konfokal analyse av den indre strukturen til sfæroider. I motsetning til eksisterende tilnærminger sørger denne protokollen for rask montering og rydding av et stort antall sfæroider ved bruk av standardutstyr og laboratorieforsyninger. Montering av sfæroider i en pH-nøytral agarose-PBS gelløsning før innføring av en brytningsindeksmatchet clearingløsning minimerer størrelsesforvrengning som er vanlig for andre lignende teknikker. Dette muliggjør detaljert kvantitativ og statistisk analyse der nøyaktigheten av størrelsesmålinger er avgjørende. Videre, sammenlignet med væskeryddingsløsninger, holder agarosegelteknikken sfæroider fast på plass, noe som muliggjør innsamling av tredimensjonale (3D) konfokale bilder. Denne artikkelen utdyper hvordan metoden gir to- og 3D-bilder av høy kvalitet som gir informasjon om intercellevariabilitet og indre sfæroidstruktur.

Introduction

Tredimensjonale (3D) cellekulturer, som sfæroider, gir biologisk realistiske og reproduserbare modeller av samlet cellevekst 1,2. Disse modellene er raskt blitt vanlig i både grunnforskning og legemiddelutvikling, hvor forskjeller i sfæroid størrelse og struktur undersøkes mellom behandlinger for å fastslå legemiddeleffektivitet 3,4. I disse sammenhengene er evnen til å samle detaljert informasjon fra et stort antall sfæroider svært fordelaktig, både fra et statistisk kraftperspektiv og for å tillate rask vurdering av celleadferd på tvers av flere behandlinger.

Vanlige teknikker for å skaffe detaljerte mikroskopibilder av sfæroidstruktur er enten tidkrevende, dyre eller produserer bilder av dårlig kvalitet som ikke beholder viktige kvantitative trekk som sfæroidstørrelse 4,5. For eksempel kan histologiske teknikker basert på kryoseksjon gi bilder av høy kvalitet, men er ofte tidkrevende, krever faglært arbeidskraft og lager ofte seksjonsartefakter 6,7, mens elegante teknologier, som enkeltplansbelysningsmikroskopi (SPIM)8 og multifotonmikroskopi9 krever spesialiserte mikroskoper som ikke er lett tilgjengelige. Moderne mikroskopiteknologier har nylig muliggjort den såkalte optiske snittingen, der sfæroider plasseres i en brytningsindeksmatchet ryddeløsning og bilder oppnås ved hjelp av konfokal mikroskopi 4,5. Selv om disse teknikkene har potensial til å produsere et høyt utbytte, inkluderer vanlige problemer sfæroidbevegelse under avbildning, størrelsesforvrengning under rydding og høye utgifter til proprietære clearingløsninger. Videre gjelder mange eksisterende protokoller bare for relativt små sfæroider på mindre enn 300 μm i diameter eller dybde opp til 100 μm, og begrenser teknologien til de tidlige stadiene av tumorvekst 5,10,11.

Den nåværende protokollen tillater semi-high-throughput, high-yield samling av detaljerte sfæroidbilder ved hjelp av en billig brytningsindeks-matchet clearing løsning avledet fra hele organ clearing prosedyrer 12,13. For å forhindre sfæroidbevegelse under avbildning og gi strukturell støtte for å redusere størrelsesforvrengning, er sfæroidene montert i agarose-PBS gel i en 24-brønn #1.5 glassbunnplate. Siden denne teknikken gjør det mulig å montere flere sfæroider i hver brønn i en 24-brønns plate, kan opptil 360 sfæroider (15 sfæroider / brønn) raskt monteres og avbildes over ulike eksperimentelle forhold. En brytningsindeksmatchet ryddeløsning konstruert av lett tilgjengelige forbruksvarer brukes til å fjerne monterte sfæroider og den omkringliggende gelen optisk. Etter en sedimenteringsperiode på 24 timer gir denne protokollen høykvalitets 2D- og 3D-bilder av sfæroidstruktur, selv for relativt store sfæroider (ca. 700 μm i diameter), med mindre enn 2% størrelsesforvrengning.

Protocol

Protokollen beskriver fremstillingen av en tilstrekkelig mengde tumorsfæroider til å montere en 24-brønns plate (ca. 240-360 sfæroider eller 10-15 sfæroider/brønn) ved 200 μL agarosegel per brønn og 500 μL clearingoppløsning per brønn. Hele prosedyren er illustrert i figur 1.

1. 2% agarose-PBS gelpreparat

  1. Vei 0,5 g lavsmeltende agarose (se materialtabell) i en glassflaske og tilsett 25 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
  2. Smelt agarose ved å koke løsningen i en mikrobølgeovn i 30-60 s med lokket lukket, men ikke forseglet og med konstant virvling. Sørg for at agarose er fullstendig oppløst og løsningen koker ikke over.
    MERK: Gel kan lagres ved romtemperatur; kontroller volumet før bruk for å ta hensyn til fordampning. Bring til flytende tilstand (mikrobølgeovn; 20-60 s med virvling) før bruk.

2. Klargjøring av clearingløsningen

  1. Vei 9 g N, N, N′, N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) etylendiamin, 22 g urea, 44 g sukrose, 0,1 g Triton X-100 og 24,9 g avionisert vann (se materialtabell).
    MERK: Det er lettere å veie den omtrentlige mengden N, N, N′, N′-Tetrakis (2-Hydroxypropyl) etylendiamin og justere vekten av andre komponenter for å oppnå ønsket konsentrasjon.
  2. Varm løsningen i et 56 °C vannbad med konstant blanding og fortsett til alle krystallene er oppløst.
  3. Hvil løsningen ved romtemperatur slik at boblene som dannes under blanding stiger til overflaten. Løsningen er stabil ved romtemperatur i opptil 2 måneder.

3. Sfæroid forberedelse

  1. Generer sfæroider ved hjelp av agaroseoverleggsmetoden som tidligere beskrevet 1,3,14.
    MERK: Sfæroider generert av andre metoder er også kompatible med denne bildeprotokollen.
  2. Skjær spissen av en 1 ml pipettespiss med en skalpell for å forstørre åpningen.
    MERK: Alle sfæroider ble håndtert med 1 ml eller 200 μL pipetter med kuttspisser.
  3. Bruk pipetten til å aspirere sfæroidene fra brønnene og overføre dem til et klart konisk rør på 1,5 ml. Flere sfæroider fra de samme forholdene kan kombineres i samme rør.
    MERK: La alltid sfæroidene sette seg til bunnen av røret for å aspirere mediet.
  4. Vask sfæroidene i 1 ml PBS to ganger, tilsett nøytral 4 % forvarmet paraformaldehyd (PFA)-løsning og inkuber sfæroidene ved 37 °C i 20 minutter.
  5. Fjern PFA-oppløsningen og vask sfæroidene to ganger med 1 ml PBS.

4. Sfæroid farging

  1. Bruk en pipette til å overføre opptil 15 sfæroider til et 200 μL PCR-rør.
    MERK: For skjøre sfæroider, monter sfæroidene i gel (trinn 5.1-5.4) før du fortsetter.
  2. Permeabiliserer cellene ved hjelp av 200 μL på 0,5% Triton X-100 i PBS. Plasser PCR-rør inne i 50 ml skrukorkrør og inkuber sfæroidene i 2 timer ved romtemperatur med mild omrøring.
    MERK: Alle inkubasjoner gjøres med omrøring på en rotor, rulle eller shaker (se materialtabell) med mindre annet er spesifisert. Dette er viktig for å oppnå jevn farging. Faste sfæroider i PBS kan noen ganger feste seg til sidene av pipettespissen. Skylling av spissen i 0,5% Triton X-100 minimerer sfæroidene fra å feste seg til spissene.
  3. Erstatt oppløsningen (trinn 4.2) med 200 μL antistofffortynningsbuffer (ABDIL)15 og inkuber over natten ved romtemperatur.
  4. Fjern ABDIL, tilsett 75 μL primært antistoff i ABDIL, og inkuber ved 4 °C i 2,5 dager.
  5. Fjern supernatanten og vask med 200 μL PBS med 0,1 % tween og 0,1 % Triton X-100 (PBS-TT) to ganger og inkuber med 200 μl PBS-TT i 4 timer ved romtemperatur.
  6. Fjern PBS-TT, tilsett 100 μL sekundært antistoff i ABDIL, og inkuber ved 4 °C i 2,5 dager.
    MERK: DAPI eller annet nukleært fargestoff kan tilsettes på dette stadiet. De fleste fargestoffer krever mindre inkubasjonstid enn antistoffer.
  7. Fjern supernatanten og vask med 200 μL PBS-TT to ganger og inkuber med 200 μL PBS-TT i 4 timer. Sfæroidene er klare til montering.

5. Montering

  1. Ved hjelp av en 200 μL pipette, overfør faste og fargede sfæroider til 500 μL PCR-rør ved ett rør per tilstand (ca. 10-15 sfæroider).
  2. Erstatt oppløsningen med 200 μL av 2 % (w/v) flytende agarosegel og sentrifuge på hurtigspinn (ved fast maksimal hastighet, se materialtabell) ved romtemperatur i 30 s.
    MERK: Med mindre det monteres umiddelbart, plasser i en varmeblokk ved 50 °C for å unngå gelherding.
  3. Aspirer sfæroidene i ~ 50 μL flytende agarosegel og dispenser i brønn av en 24-brønns glassbunnplate.
  4. Før gelen herdes, separer sfæroidene ved hjelp av en pipettespiss i den omkringliggende gelen, og sørg for at sfæroidene er dekket med gel. Legg eventuelt platen på is for å sette gelen raskt.
    MERK: Antall sfæroider per brønn avhenger av størrelsen på sfæroidene. Sfæroider er plassert langt borte fra hverandre slik at bare en sfæroid kommer inn i synsfeltet mens du avbilder. Dette er viktig for automatisert bildebehandling.
  5. Tilsett 500 μL ryddeoppløsning (trinn 2) per brønn, slik at gelen er nedsenket. Inkuber ved RT i minst 24 timer og avbild sfæroidene i clearingløsningen. Sfæroider er stabile i denne løsningen i opptil en måned ved romtemperatur og når de er beskyttet mot fordampning.

6. Bildebehandling

  1. Velg et mål med en arbeidsavstand som er lang nok til å omfatte hele sfæroiden, inkludert monteringshøyden til sfæroiden i fartøyet.
    MERK: Mål med en arbeidsavstand på 3 mm eller lenger er nødvendig for å avbilde ekvatorialplanet til sfæroidene. Høyere forstørrelsesmål med høyere NA kan gi bedre oppløsning, men vil begrense den maksimale dybden som sfæroidene kan avbildes på.
  2. For å identifisere ekvatorialplanet, juster fokuset til det største overflatearealet er nådd i XY-planet og bildet med den nødvendige lasereffektprosenten, detektorspenningen, forsterkningen og offset-innstillingene.
    MERK: Lasereffektprosenten, detektorspenningen, forsterkningen og forskyvningen vil variere sterkt avhengig av fluorofor, fargeintensitet, laserintensitet, detektorfølsomhet osv.
  3. For 3D-bilder angir du start og slutt på sfæroidene, og velger passende signalintensitet ved forskjellige z-dybder ved hjelp av z-intensitetskorreksjonsinnstillinger før avbildning.
    MERK: For best bildeoppløsning, bruk Nyquist samplingsfrekvens for x, y og z (for detaljer, se referanse16).

Representative Results

For å demonstrere evnen til denne clearingmetoden til å gi to- og tredimensjonale bilder av høy kvalitet, ble sfæroider med diametre på 300-600 μm dyrket fra Fluorescent Ubiquitination-baserte Cell Cycle Indicator (FUCCI) transducerte melanomcellelinjer FUCCI-WM164 og FUCCI-WM983b 9,17 , som uttrykker monomert Kusabira Orange2 (mKO2) og monomert Azami Green (mAG) protein når det er i Gap1, og henholdsvis tidlig S-fase/Gap2/mitosefase i cellesyklusen i henhold til prosedyrer gitt i trinn 3 1,3,14. Sfæroidene ble deretter festet med 4% formaldehydoppløsning ved 37 ° C, permeabilisert og farget med anti-p27kip1 / antikanin Alexa Fluor 647 anti-pimonidazol / anti-mus Alexa Fluor 647, DAPI eller DRAQ7 (se materialtabell) (figur 2). Alle mikroskopifiler lastes opp til GitHub-repositoriet (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). Sammenlignet med PBS-monterte sfæroider gir ryddeløsningen bilder med høy klarhet og minimal størrelsesforvrengning (figur 2A). Protokollen tillater høyoppløselig avbildning av cellenivådetaljer dypere inn i sfæroidene uten histologisk snitting, og tverrsnittsbildet ble hentet fra et 20x luftmål (0,7 NA) med en oppløsning på 4096 x 4096 px uten søm (figur 2B). Ved å bruke et lavere forstørrelses- og lavere numerisk blenderåpningsmål med lengre arbeidsavstand, kan man få 3D-konfokale bilder som gir detaljer på cellenivå på en dybde på minst 200 μm (figur 2C). Sfæroider ble også kryoseksjonert og farget i henhold til protokollen av Spoerri et al.4 og sammenlignet med hele sfæroidfarging (figur 2D, E). Figur 2D viser den hypoksiske regionen av sfæroiden farget av pimonidazol, og figur 2E viser p27kip1-farging som markerer cellesyklusarrest (gul) og DAPI-kjerneflekk (grå). Proteinlokalisering og fargemønster er likt mellom kryoseksjonering og rydding og er derfor upåvirket av denne rensemetoden.

Signalintensitetskorreksjon i z tillater avbildning av hele sfæroiden. Lysspredning på grunn av den nekrotiske kjernen begrenser imidlertid evnen til å avbilde den fjerne siden av sfæroiden. Dypere penetrasjon og mindre spredning av en langt rød fluorofor, som DRAQ7 kjerneflekk, muliggjør enda bedre 3D sfæroidstrukturrepresentasjon (figur 3). Film 1 viser 3D-gjengivelsen av FUCCI-sfæroidene farget med DRAQ7. En tynnere z-skive kan gi bedre z-oppløsning, men dette øker bildetiden og fotoblekingen av fluoroforene betydelig.

For å avgjøre om clearingløsningen forårsaker størrelsesforvrengning, ble tolv sfæroider i 2% agarose-PBS gel avbildet ved 6 timer, 12 timer, 24 timer, 72 timer og 168 timer etter innføring av clearingløsningen. Bildene ble oppsummert ved å bestemme diameteren på sfæroiden, definert ut fra en kule med samme tverrsnittsareal som sfæroiden (figur 4A). Mens sfæroidene observeres å øke litt i størrelse i løpet av de første 6 timene, indikert ved en diameterfoldendring på mellom 2% og 6% (figur 4B), etter 24 timer til 72 timer, går sfæroidene tilbake til en størrelse omtrent lik den tilsvarende størrelsen i PBS etter PFA-fiksering (figur 4C).

figure-representative results-3792
Figur 1: Illustrasjon av sfæroidmonterings- og clearingprotokollen. Faste og fargede sfæroider overføres til et 500 μL rør; overflødig væske erstattes av 200 μL agarose-PBS gel og sentrifugert. Sfæroider overføres deretter til en glassbunnsbrønn i en 24-brønns plate. Etter at gelen får størkne, tilsettes 500 μL clearingoppløsning, og sfæroider får lov til å likevekte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

figure-representative results-4515
Figur 2: Sammenligning av klarerte og uklarerte FUCCI humane melanomsfæroider. Farging indikerer cellekjerner positive for mKO2 (rød), som indikerer celler i gap 1; og cellekjerner positive for mAG (grønn), som indikerer celler i gap 2. (A) Sfæroider dyrket fra 5000 FUCCI-WM983b-celler, høstet på dag 10 og avbildet i agarose-PBS gel og 24 timer etter at clearingoppløsningen er tilsatt. Sammenligning av brightfield og confocal bilder før og etter clearing løsning viser minimal størrelse forvrengning og en stor gevinst i klarhet. Bilder oppnås ved hjelp av et 10x mål. (B) Sfæroider dyrket fra FUCCI-WM164-celler permeabilisert ved bruk av Triton X-100 og farget med DRAQ7, og flekker alle cellekjerner. Bildet er oppnådd ved hjelp av et 20x objektiv (0,75 NA), som demonstrerer clearingløsningen tillater høyoppløselig avbildning av cellenivådetaljer. (C) 3D-bilder (10x, 0,4 NA) ble oppnådd av FUCCI-WM164 sfæroider i PBS, og 24 timer etter at clearingløsningen ble tilsatt. Justering av lasereffekt, spenning og forskyvning ved forskjellige z-plan gjør det mulig å avbilde dypere inne i sfæroiden. (D,E) Sammenligning mellom kryoseksjon og ryddet hel sfæroid farget for pimonidazol og p27kip1. (D) Pimonidazolfarging i magenta viser den hypoksiske regionen i sfæroidene. Rødt og grønt indikerer FUCCI. (E) Kryoseksjoner og ryddet sfæroid som viser DAPI (grå) og p27kip1 (gul). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

figure-representative results-6375
Figur 3: Clearing gjør det mulig å avbilde dypere inn i sfæroiden med minimalt lystap. Konfokale mikroskopibilder av en FUCCI human melanom sfæroid ved 10x forstørrelse og lavere NA (0,4), noe som tillater avbildning ved høyere z-dybde med minimalt signaltap. (A) 3,88 μm skiver av sfæroidkjerner farget med DRAQ7. (B-D) y / z-oppløsning i henholdsvis 488 (mAG), 568 (mKO2) og 647 nm (DRAQ7). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

figure-representative results-7188
Figur 4: Clearingoppløsning har minimal innvirkning på sfæroidstørrelsen. (A) Fordeling av innledende sfæroidstørrelse (ekvivalent diameter) i PBS gel (n = 12 sfæroider). (B) Diameter foldeendring over tid siden tilsetning av clearingoppløsning. Ved 0 timer er sfæroider kun i PBS gel. (C) Fordeling av diameter foldeendringer ved 12 timer, 24 timer og 72 timer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Film 1: 3D-gjengivelse av en FUCCI sfæroid farget med DRAQ7. Vennligst klikk her for å laste ned denne filmen.

Discussion

En protokoll for å oppnå to- og tredimensjonale bilder av tumorsfæroider av høy kvalitet presenteres her. Eksisterende metoder, som CLARITY, See deep brain (SeeDB) og ScaleS, forårsaker ofte størrelsesforvrengning med opptil 30%, mens teknikker som benzylalkohol/ benzylbenzoat (BABB) og 3D-avbildning av løsemiddelklarerte organer (3DISCO) kan slukke fluorescerende protein18. Mange av disse metodene er designet for å rydde vev med strukturell integritet og forvrenge størrelsen og strukturen når de brukes på sfæroider18. I motsetning til andre protokoller som bruker kommersielt tilgjengelige dyre clearingløsninger, bruker denne protokollen lett tilgjengelige forbruksvarer samtidig som den opprettholder optisk klarhet og endogen fluorescens og minimerer størrelsesforvrengning. Innebygging av sfæroider i agarose-PBS gel gir strukturell støtte til sfæroider og minimerer osmotisk støt når clearingløsningen tilsettes. Dette er avgjørende ved avbildning av skjøre sfæroider etter medikamentell behandling. Det antas at denne optiske clearingmetoden er egnet for sfæroider dannet ved en hvilken som helst metode siden denne protokollen er tilpasset fra helvevsrydding. Antagelsen er basert på likheten i sfæroider oppnådd ved forskjellige sfæroidformasjonsmetoder. Valget av fikseringsmiddel kan påvirke sfæroidstørrelsen så vel som endogen fluorescens. Denne clearingmetoden er egnet for sfæroider festet med nøytral 4% PFA-løsning. Ytterligere testing er nødvendig for å kontrollere kompatibiliteten med andre fikseringsmidler.

Gitt at denne teknikken gjør det mulig å montere flere sfæroider samtidig i en flerbrønnsplate, er den godt egnet til kvantitative analyserørledninger som krever sfæroidstrukturinformasjon fra opptil 360 sfæroider per 24-brønns plate. Mikroskoper med automatiserte scene- og platekartleggingsfunksjoner kan gjøre bildebehandling mindre manuell. Selv om denne metoden er raskere og enklere enn seksjonering, er den for tiden uegnet for fullstendig automatisering. Imidlertid er bilder oppnådd ved denne metoden egnet for automatisert bildebehandling 4,19, og hastigheten som sfæroider kan monteres ved hjelp av denne protokollen, gir kvantitativ analyse av sfæroid indre struktur 20,21,22.

For farging av hele sfæroider må antistoffkonsentrasjonen, volumet og inkubasjonstiden optimaliseres for hvert antistoff. Som en veiledning, bruk 2,5x av den anbefalte 2D immunfluorescens antistoffkonsentrasjonen og 100-200 μL antistoff, avhengig av antall sfæroider per rør. Sørg for at alle sfæroider er dekket av fargeløsning når de er på rotoren. Inkubasjonstiden avhenger av mange faktorer, inkludert størrelsen og tettheten av sfæroider og antistoffet, og kan variere fra 16-72 timer. Til tross for at metoden tillater signaldeteksjon dypere i sfæroiden, forårsaker fluoroforer begeistret av UV betydelig lysspredning, noe som fører til et lavt signal-til-støy-forhold. Det må utvises forsiktighet ved valg av fluoroforer for å visualisere målproteinet. For eksempel vil farging av mindre rikelige og strukturelle proteiner med lengre bølgelengdefluoroforer og mer rikelig protein- eller kjerneflekker med kortere bølgelengdefluoroforer oppnå det beste resultatet. Til slutt viser ryddede sfæroider fortsatt lystap på grunn av spredning i den nekrotiske kjernen, tydelig i y / z-dimensjonen av bilder oppnådd av 600 μm sfæroider (figur 2C).

Høyere forstørrelsesavbildning med høyere NA-mål er mulig med sfæroider montert og ryddet ved hjelp av denne protokollen, men målets arbeidsavstand begrenser bildedybden. For en olje nedsenking linse, er det viktig å bruke olje som har en RI på 1,51 for best resultat.

For å oppsummere, tillater agarose-PBS gel innebygd clearing metode for visualisering av celler dypt inne i sfæroider ved hjelp av allment tilgjengelige forbruksvarer. Sfæroider montert og ryddet ved hjelp av denne metoden gjennomgår minimal størrelsesforvrengning og opprettholder sin strukturelle integritet, noe som gjør det mulig å samle inn data av høy kvalitet knyttet til den indre sfæroidstrukturen og påfølgende automatisert kvantifisering.

Acknowledgements

Denne undersøkelsen ble utført ved Translational Research Institute (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI støttes av et tilskudd fra den australske regjeringen. Vi takker Prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-byen, Japan, for å gi FUCCI konstruksjoner, Prof. Meenhard Herlyn og Ms Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, for å gi cellen linjer. Vi takker Dr Loredana Spoerri for å gi C8161 cryosection bilder.

Dette arbeidet ble støttet av prosjektstipendier til N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) og Meehan Project Grant (021174 2017002565).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 glass bottom 24-well plateCelvisP24-1.5H-N
500 µL clear PCR tubesSigmaHS4422
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson Immuno research715-605-151Dilution used 1:500
Bovine serum albuminSigmaA7906Final concentration 2% w/v
DAPISigmaD9542-10MGFinal concentration 5 µg/mL
Deionized waterMILLI Q
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647ThermofisherA-31573Dilution used 1:500
DRAQ7ThermofisherD15106Dilution used 1:250
Heating blockRatekDBH10or similar equipment
Hypoxyprobe KitsHypoxyprobeHP1-1000KitAntibody dilution used 1:500
Low-melting agarose powderSigmaA9414Final concentration 2% w/v
MicrowaveSharp
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamineSigma122262Final concentration 9% w/w
NaClSigmaS9888Final concentration 150 mM
NaN3SigmaS2002Final concentration 0.10% w/v
p27 Kip1 (D69C12) XPCell Signalling technology3686SDilution used 1:500
Paraformaldehyde solutionProscitechC004Final concentration 4% w/v
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermofisher18912014Final concentration 1x
PipetteEppendorf
Quickspin minifugeor similar equipment
RollerRatekBTR10-12Vor similar equipment
RotorRatekRSM7DCor similar equipment
ShakerRatekEOM5or similar equipment
SucroseSigmaS9378Final concentration 44% w/w
Tris-HCl pH 7.4SigmaT5941Final concentration 20 mM
Triton X-100SigmaX100Final concentration 0.10% v/v
Triton X-100SigmaX100Final concentration 0.1% v/v
Tween 20SigmaP1379Final concentration 0.1% v/v
UreaSigmaU5379Final concentration 22% w/w

References

  1. Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
  2. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  3. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2008).
  4. Spoerri, L., Gunasingh, G., Haass, N. K. Fluorescence-based quantitative and spatial analysis of tumour spheroids: A proposed tool to predict patient-specific therapy response. Frontiers in Digital Health. 3, 668390 (2021).
  5. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 20 (2020).
  6. Kabadi, P. K., et al. Into the depths: Techniques for in vitro three-dimensional microtissue visualization. BioTechniques. 59 (5), 279-286 (2015).
  7. Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
  8. Spoerri, L., et al. Phenotypic melanoma heterogeneity is regulated through cell-matrix interaction-dependent changes in tumor microarchitecture. bioRxiv. , (2021).
  9. Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment Cell & Melanoma Research. 27 (5), 764-776 (2014).
  10. Ahmad, A., et al. Clearing spheroids for 3D fluorescent microscopy: combining safe and soft chemicals with deep convolutional neural network. bioRxiv. , 428996 (2021).
  11. Villani, T., Rossi, A. E., Sherman, H. Image-based characterization of 3-D cell culture models grown in spheroid microplates. American Laboratory. 50 (6), 12 (2018).
  12. Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
  13. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  14. Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-time cell cycle imaging in a 3D cell culture model of melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
  15. Cold Spring Harbor. Antibody Dilution Buffer (Abdil). Cold Spring Harbor Protocols. , (2018).
  16. Pawley, J. B., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 20-42 (2006).
  17. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  18. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  19. Browning, A. P., Murphy, R. J. . Zenodo. , (2021).
  20. Browning, A. P., et al. Quantitative analysis of tumour spheroid structure. eLife. 10, 73020 (2021).
  21. Klowss, J. J., et al. A stochastic mathematical model of 4D tumour spheroids with real-time fluorescent cell cycle labelling. Journal of The Royal Society Interface. 19 (189), 20210903 (2022).
  22. Murphy, R. J., Browning, A. P., Gunasingh, G., Haass, N. K., Simpson, M. J. Designing and interpreting 4D tumour spheroid experiments. Communications Biology. 5 (1), 91 (2022).

Explore More Articles

Kreftforskningutgave 186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved