腫瘍スフェロイドの半ハイスループット分析のための迅速な光学的クリアリング

Summary

腫瘍スフェロイドは、腫瘍細胞と微小環境の相互作用および治療応答を評価するためにますます利用されつつある。本プロトコルは、迅速な光学的クリアリングを用いた3D腫瘍スフェロイドの半ハイスループットイメージングのための堅牢かつ簡単な方法を記載する。

Abstract

腫瘍スフェロイドは、がんの基礎研究や医薬品開発において急速に一般的になりつつあります。細胞レベルでのスフェロイド内のタンパク質発現に関するデータを得ることは、解析にとって重要であるが、既存の技術はしばしば高価で、面倒で、非標準機器を使用し、著しいサイズの歪みを引き起こし、または比較的小さなスフェロイドに限定される。このプロトコルは、回転楕円体の内部構造の共焦点解析を可能にしながら、これらの問題に対処する回転楕円体をマウントおよびクリアする新しい方法を提示する。既存のアプローチとは対照的に、このプロトコルは、標準的な機器および実験用品を使用して、多数のスフェロイドの迅速な取り付けおよび除去を提供する。屈折率一致クリアリング溶液を導入する前に、pH中性アガロース-PBSゲル溶液にスフェロイドをマウントすると、他の同様の技術に共通するサイズの歪みが最小限に抑えられます。これにより、サイズ測定の精度が最優先される詳細な定量的および統計的分析が可能になります。さらに、液体清澄化溶液と比較して、アガロースゲル技術はスフェロイドを所定の位置に固定し、3次元(3D)共焦点画像の収集を可能にする。本稿では、この方法が、細胞間変動性および内部スフェロイド構造に関する情報を提供する高品質の2Dおよび3D画像を生成する方法を詳述する。

Introduction

スフェロイドなどの三次元(3D)細胞培養物は、凝集細胞増殖の生物学的に現実的で再現可能なモデルを提供する^1,2。これらのモデルは、基礎研究と医薬品開発の両方で急速に一般的になりつつあり、スフェロイドのサイズと構造の違いが治療間で検査され、薬効を確認する^3,4。これらの文脈において、多数のスフェロイドから詳細な情報を収集する能力は、統計的検出力の観点から、およびいくつかの治療にわたる細胞挙動の迅速な評価を可能にすることの両方から、非常に有利である。

スフェロイド構造の詳細な顕微鏡画像を得るために一般的に使用される技術は、時間がかかるか、高価であるか、またはスフェロイドサイズ^4,5などの主要な定量的特徴を保持しない低品質の画像を生成する。例えば、凍結切断に基づく組織学的技術は、高品質の画像を提供することができるが、しばしば時間がかかり、熟練した労働力を必要とし、しばしば切片化アーティファクト^6,7を作成するが、単一平面照明顕微鏡(SPIM)⁸および多光子顕微鏡⁹などのエレガントな技術は、容易に入手できない特殊な顕微鏡を必要とする。現代の顕微鏡技術は最近、回転楕円体が屈折率一致したクリアリング溶液内に配置され、共焦点顕微鏡^4,5を使用して画像が得られる、いわゆる光学的切断を可能にした。これらの技術は高い歩留まりを生み出す可能性を秘めていますが、一般的な問題には、イメージング中の回転楕円体の動き、クリア中のサイズの歪み、独自のクリアリングソリューションの高コストなどがあります。さらに、多くの既存のプロトコルは、直径300μm未満または深さ100μmまでの比較的小さなスフェロイドにのみ適用され、この技術を腫瘍増殖の初期段階に限定している⁵、^10、11。

本プロトコルは、全臓器透明化手順に由来する低コストの屈折率整合クリアリング溶液を用いて、詳細な回転楕円体画像のセミハイスループット、高収率収集を可能にする^12、13。イメージング中のスフェロイドの動きを防ぎ、サイズの歪みを低減する構造的サポートを提供するために、スフェロイドは24ウェル#1.5ガラス底板のアガロース-PBSゲルに取り付けられています。この技術により、24ウェルプレートの各ウェルに複数のスフェロイドをマウントできるため、さまざまな実験条件で最大360個のスフェロイド(15個のスフェロイド/ウェル)を迅速にマウントしてイメージングできます。容易に入手可能な消耗品から構築された屈折インデックスマッチングクリアリングソリューションは、取り付けられたスフェロイドと周囲のゲルを光学的にクリアするために使用されます。24時間のセトリング期間の後、このプロトコルは、2%未満のサイズ歪みで、比較的大きなスフェロイド(直径約700μm)であっても、回転楕円体構造の高品質の2Dおよび3D画像を提供します。

Protocol

このプロトコールは、1つの24ウェルプレート(約240〜360個のスフェロイドまたは10〜15個のスフェロイド/ウェル)を、ウェルあたり200μLのアガロースゲルおよびウェルあたり500μLの透明化溶液でマウントするのに十分な量の腫瘍スフェロイドの調製を記載している。完全な手順を 図 1 に示します。

1. 2%アガロース-PBSゲル調製

1. ガラス瓶に0.5gの低融点アガロース( 材料表を参照)を計量し、25mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加える。
2. アガロースを溶かし、溶液を電子レンジで30〜60秒間沸騰させ、蓋は閉じたが密閉せず、一定の渦巻きを伴わない。アガロースが完全に溶解し、溶液が沸騰しないことを確認します。
   注:ゲルは室温で保存することができます。蒸発を説明するために使用前に容量を確認してください。液体の状態(マイクロ波、渦巻き状態で20-60秒)にしてから使用してください。

2. 清澄化液の調製

1. N,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミン9g、尿素22g、スクロース44g、トリトンX-1000000000g、脱イオン水24.9gを計量する(材料表参照)。
   注:N,N,N',N'-テトラキス(2-ヒドロキシプロピル)エチレンジアミンのおおよその量を計量し、所望の濃度を得るために他の成分の重量を調整する方が簡単です。
2. 溶液を56°Cの水浴中で一定の混合で加熱し、すべての結晶が溶解するまで続けます。
3. 混合中に形成された気泡が表面に上昇することができるように、溶液を室温で休ませる。この溶液は、室温で最大2ヶ月間安定である。

3. 回転楕円体調製

1. 前述のようにアガロースオーバーレイ法を用いてスフェロイドを生成する ^1,3,14.
   注: 他の方法で生成された回転楕円体も、このイメージング プロトコルと互換性があります。
2. メスを使用して1mLのピペットチップの先端を切断し、オリフィスを拡大します。
   注:すべてのスフェロイドは、カットチップを備えた1 mLまたは200 μLのピペットで処理しました。
3. ピペットを使用して、ウェルから回転楕円体を吸引し、透明な1.5mL円錐管に移す。同じ条件の複数の回転楕円体を同じチューブ内で組み合わせることができます。
   注:常に回転楕円体がチューブの底に沈み込み、媒体を吸引するようにしてください。
4. スフェロイドを1mL PBSで2回洗浄し、中性4%予熱パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を加え、スフェロイドを37°Cで20分間インキュベートする。
5. PFA溶液を除去し、1mLのPBSでスフェロイドを2回洗浄する。

4. 回転楕円体染色

1. ピペットを使用して、最大 15 個のスフェロイドを 200 μL PCR チューブに移します。
   注: 壊れやすいスフェロイドの場合は、先に進む前にスフェロイドをゲルにマウントしてください (手順 5.1 ~ 5.4)。
2. PBS中の0.5%Triton X-100の200μLを用いて細胞を透過除去する。PCR チューブを 50 mL スクリューキャップチューブ内に置き、スフェロイドを室温で軽度の攪拌で 2 時間インキュベートします。
   注:特に指定のない限り、すべてのインキュベーションは、ローター、ローラー、またはシェーカー( 材料表を参照)での攪拌で行われます。これは、均一な染色を達成するために重要である。PBS内の固定スフェロイドは、ピペットチップの側面にくっつくことがあります。先端を0.5%Triton X-100ですすぐと、回転楕円体が先端に付着するのを最小限に抑えます。
3. 溶液(ステップ4.2)を200μLの抗体希釈バッファー(ABDIL)¹⁵ に交換し、室温で一晩インキュベートします。
4. ABDILを除去し、ABDILに75 μLの一次抗体を加え、4°Cで2.5日間インキュベートした。
5. 上清を除去し、0.1% Tween および 0.1% Triton X-100 (PBS-TT) を含む 200 μL の PBS で 2 回洗浄し、200 μL の PBS-TT と共に室温で 4 時間インキュベートします。
6. PBS-TTを除去し、ABDILに100 μLの二次抗体を加え、4°Cで2.5日間インキュベートした。
   注:DAPIまたは他の核色素は、この段階で添加することができる。ほとんどの色素は、抗体よりもインキュベーション時間が少なくて済みます。
7. 上清を除去し、200 μL の PBS-TT で 2 回洗浄し、200 μL の PBS-TT で 4 時間インキュベートします。回転楕円体は取り付けの準備ができています。

5. 取り付け

1. 200 μL のピペットを使用して、固定および染色したスフェロイドを、条件ごとに 1 本のチューブ (約 10 ~ 15 個のスフェロイド) で 500 μL PCR チューブに移します。
2. 溶液を200 μLの2%(w/v)液体アガロースゲルと交換し、室温で30秒間、クイックスピン(固定された最高速度で、 材料表を参照)で遠心分離します。
   メモ: すぐに取り付ける場合を除き、ゲル硬化を避けるために 50 °C の加熱ブロックに入れてください。
3. スフェロイドを約50 μLの液体アガロースゲルで吸引し、24ウェルガラス底プレートのウェルに分注します。
4. ゲルが固まる前に、周囲のゲルのピペットチップを使用してスフェロイドを分離し、スフェロイドがゲルで覆われていることを確認します。任意選択で、プレートを氷の上に置き、ゲルを急速にセットする。
   注: ウェルあたりの回転楕円体の数は、回転楕円体のサイズによって異なります。回転楕円体は互いに遠くに配置され、イメージング中に1つの回転楕円体のみが視野に入るようにします。これは、自動画像処理にとって重要です。
5. 1ウェルあたり500μLの清澄溶液(ステップ2)を加え、ゲルが水没していることを確認する。RTで少なくとも24時間インキュベートし、クリアリング溶液中の回転楕円体をイメージングします。スフェロイドは、室温で最大1ヶ月間、蒸発から保護されている場合、この溶液中で安定である。

6. イメージング

1. 容器内の回転楕円体の取り付け高さを含む、回転楕円体全体を包括するのに十分な長さの作動距離を持つ対物レンズを選択します。
   注: 回転楕円体の赤道面をイメージするには、作動距離が 3 mm 以上の対物レンズが必要です。NAが高く、倍率の高い対物レンズは、より良い解像度を可能にすることができるが、回転楕円体を画像化できる最大深さを制限する。
2. 赤道面を識別するには、XY平面で最大の表面積に達するまで焦点を調整し、必要なレーザー出力の割合、検出器電圧、ゲイン、オフセット設定で画像を作成します。
   メモ:レーザー出力の割合、検出器の電圧、ゲイン、オフセットは、蛍光色素分子、染色強度、レーザー強度、検出器の感度などによって大きく異なります。
3. 3D 画像の場合は、回転楕円体の開始と終了を設定し、イメージング前に z 強度補正設定を使用して、さまざまな Z 深度で適切な信号強度を選択します。
   メモ: 最適な画像解像度を得るには、x、y、z にナイキストサンプリングレートを使用します(詳細については、リファレンス¹⁶ を参照してください)。

Discussion

腫瘍スフェロイドの高品質の2次元および3次元画像を得るためのプロトコルがここに提示される。CLARITY、See deep brain(SeeDB)、ScaleSなどの既存の方法は、しばしば最大30%のサイズ歪みを引き起こしますが、ベンジルアルコール/安息香酸ベンジル(BABB)や溶媒消去臓器の3Dイメージング(3DISCO)などの技術は蛍光タンパク質¹⁸を消光することができます。これらの方法の多くは、構造的完全性を有する組織を透明化するために設計されており、回転楕円体¹⁸に適用されたときにサイズおよび構造を歪める。市販の高価なクリアリングソリューションを使用する他のプロトコルとは対照的に、このプロトコルは、光学的透明度と内因性蛍光を維持し、サイズの歪みを最小限に抑えながら、容易に入手可能な消耗品を使用します。アガロース-PBSゲルにスフェロイドを埋め込むと、スフェロイドの構造的サポートが得られ、クリアリング溶液が添加されたときの浸透圧ショックが最小限に抑えられます。これは、薬物治療後の脆弱なスフェロイドをイメージングする際に重要です。このプロトコルは全組織透明化から適応されているため、この光学的清澄化方法は、任意の方法によって形成されたスフェロイドに適していると仮定される。この仮定は、異なる回転楕円体形成法によって得られた回転楕円体における類似性に基づいている。固定剤の選択は、回転楕円体サイズおよび内因性蛍光に影響を及ぼす可能性がある。この清澄化方法は、中性4%PFA溶液で固定されたスフェロイドに適している。他の固定剤との互換性をチェックするには、さらなるテストが必要です。

この技術により、複数のスフェロイドをマルチウェルプレートに同時に取り付けることができるため、24ウェルプレートあたり最大360個のスフェロイドからのスフェロイド構造情報を必要とする定量分析パイプラインに最適です。自動化されたステージおよびプレートマッピング機能を備えた顕微鏡は、イメージングを手作業でなくすることができます。この方法は、セクショニングよりも迅速かつ簡単ですが、現在のところ、完全な自動化には適していません。しかしながら、この方法により得られた画像は、自動画像処理^4,19に適しており、このプロトコルを用いて回転楕円体を搭載できる速度は、スフェロイド内部構造^20,21,22の定量的解析^{に役立つ。}

スフェロイド全体を染色するには、抗体濃度、体積、およびインキュベーション時間を抗体ごとに最適化する必要があります。ガイドとして、チューブあたりのスフェロイドの数に応じて、推奨される2D免疫蛍光抗体濃度の2.5倍と100〜200μLの抗体を使用してください。ローターに装着しているときに、すべての回転楕円体が染色液で覆われていることを確認します。インキュベーション時間は、スフェロイドおよび抗体のサイズおよび密度を含む多くの要因に依存し、16〜72時間の範囲であり得る。この方法はスフェロイドの奥深くでシグナル検出を可能にするにもかかわらず、UVによって励起された蛍光色素分子は大きな光散乱を引き起こし、シグナル対ノイズ比を低くします。蛍光色素を選択する際には、標的タンパク質を可視化するために注意が必要です。例えば、より長い波長の蛍光色素で豊富で構造的なタンパク質を染色し、より豊富なタンパク質または核染色を短波長の蛍光色素で染色すると、最良の結果が得られます。最後に、クリアされたスフェロイドは、600μmのスフェロイドで得られた画像のY / z次元に明らかなように、壊死コアの散乱による光損失を依然として示しています(図2C)。

このプロトコルを使用して回転楕円体を取り付けてクリアすると、より高いNA対物レンズでより高い倍率イメージングが可能ですが、対物レンズの作動距離によってイメージング深度が制限されます。オイル浸漬レンズの場合、最良の結果を得るためには、RIが1.51のオイルを使用することが重要です。

要約すると、アガロース-PBSゲル包埋クリアリング法は、一般的に入手可能な消耗品を使用して、スフェロイドの奥深くにある細胞を視覚化することを可能にする。この方法を使用して取り付けられ、除去された回転楕円体は、最小限のサイズの歪みを受け、その構造的完全性を維持するため、内部回転楕円体構造に関する高品質のデータを収集し、その後の自動定量化が可能になります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 glass bottom 24-well plate	Celvis	P24-1.5H-N
500 µL clear PCR tubes	Sigma	HS4422
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson Immuno research	715-605-151	Dilution used 1:500
Bovine serum albumin	Sigma	A7906	Final concentration 2% w/v
DAPI	Sigma	D9542-10MG	Final concentration 5 µg/mL
Deionized water	MILLI Q
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermofisher	A-31573	Dilution used 1:500
DRAQ7	Thermofisher	D15106	Dilution used 1:250
Heating block	Ratek	DBH10	or similar equipment
Hypoxyprobe Kits	Hypoxyprobe	HP1-1000Kit	Antibody dilution used 1:500
Low-melting agarose powder	Sigma	A9414	Final concentration 2% w/v
Microwave	Sharp
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine	Sigma	122262	Final concentration 9% w/w
NaCl	Sigma	S9888	Final concentration 150 mM
NaN3	Sigma	S2002	Final concentration 0.10% w/v
p27 Kip1 (D69C12) XP	Cell Signalling technology	3686S	Dilution used 1:500
Paraformaldehyde solution	Proscitech	C004	Final concentration 4% w/v
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher	18912014	Final concentration 1x
Pipette	Eppendorf
Quickspin minifuge			or similar equipment
Roller	Ratek	BTR10-12V	or similar equipment
Rotor	Ratek	RSM7DC	or similar equipment
Shaker	Ratek	EOM5	or similar equipment
Sucrose	Sigma	S9378	Final concentration 44% w/w
Tris-HCl pH 7.4	Sigma	T5941	Final concentration 20 mM
Triton X-100	Sigma	X100	Final concentration 0.10% v/v
Triton X-100	Sigma	X100	Final concentration 0.1% v/v
Tween 20	Sigma	P1379	Final concentration 0.1% v/v
Urea	Sigma	U5379	Final concentration 22% w/w