Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Tumörsfäroider används alltmer för att bedöma tumörcell-mikromiljöinteraktioner och terapisvar. Det nuvarande protokollet beskriver en robust men enkel metod för semi-high-throughput avbildning av 3D-tumörsfäroider med hjälp av snabb optisk clearing.

Abstract

Tumörsfäroider blir snabbt vanliga inom grundläggande cancerforskning och läkemedelsutveckling. Att få data om proteinuttryck i sfäroiden på cellulär nivå är viktigt för analys, men befintliga tekniker är ofta dyra, mödosamma, använder icke-standardutrustning, orsakar betydande storleksförvrängning eller är begränsade till relativt små sfäroider. Detta protokoll presenterar en ny metod för montering och rensning av sfäroider som tar itu med dessa problem samtidigt som det möjliggör konfokal analys av sfäroidernas inre struktur. I motsats till befintliga tillvägagångssätt möjliggör detta protokoll snabb montering och rensning av ett stort antal sfäroider med hjälp av standardutrustning och laboratorieutrustning. Montering av sfäroider i en pH-neutral agaros-PBS-gellösning innan en brytningsindexmatchad clearinglösning införs minimerar storleksförvrängning som är gemensam för andra liknande tekniker. Detta möjliggör detaljerad kvantitativ och statistisk analys där noggrannheten i storleksmätningar är av största vikt. Dessutom, jämfört med flytande clearinglösningar, håller agarosgeltekniken sfäroider fixerade på plats, vilket möjliggör insamling av tredimensionella (3D) konfokala bilder. Den här artikeln utvecklar hur metoden ger högkvalitativa två- och 3D-bilder som ger information om intercellvariabilitet och inre sfäroidstruktur.

Introduction

Tredimensionella (3D) cellkulturer, såsom sfäroider, ger biologiskt realistiska och reproducerbara modeller av aggregerad celltillväxt 1,2. Dessa modeller blir snabbt vanliga inom både grundforskning och läkemedelsutveckling, där skillnader i sfäroidstorlek och struktur undersöks mellan behandlingar för att fastställa läkemedelseffekt 3,4. I dessa sammanhang är förmågan att samla in detaljerad information från ett stort antal sfäroider mycket fördelaktig, både ur ett statistiskt maktperspektiv och för att möjliggöra snabb bedömning av cellbeteende över flera behandlingar.

Vanliga tekniker för att få detaljerade mikroskopibilder av sfäroidstruktur är antingen tidskrävande, dyra eller producerar bilder av dålig kvalitet som inte behåller viktiga kvantitativa funktioner som sfäroidstorlek 4,5. Till exempel kan histologiska tekniker baserade på kryosektion ge högkvalitativa bilder men är ofta tidskrävande, kräver skickligt arbete och skapar ofta sektioneringsartiklar 6,7, medan eleganta tekniker, såsom enkelplansbelysningsmikroskopi (SPIM)8 och multifotonmikroskopi9 kräver specialiserade mikroskop som inte är lättillgängliga. Modern mikroskopiteknik har nyligen möjliggjort den så kallade optiska sektionering, där sfäroider placeras i en brytningsindexmatchad clearinglösning och bilder erhålls med hjälp av konfokalmikroskopi 4,5. Även om dessa tekniker har potential att ge ett högt utbyte, inkluderar vanliga problem sfäroidrörelse under avbildning, storleksförvrängning under röjning och den höga kostnaden för proprietära clearinglösningar. Dessutom gäller många befintliga protokoll endast för relativt små sfäroider med mindre än 300 μm i diameter eller djup upp till 100 μm, vilket begränsar tekniken till de tidiga stadierna av tumörtillväxt 5,10,11.

Det nuvarande protokollet möjliggör semi-high-throughput, high-yield insamling av detaljerade sfäroidbilder med hjälp av en billig brytningsindexmatchad clearinglösning härledd från hela organrensningsförfaranden12,13. För att förhindra sfäroidrörelse under avbildning och ge strukturellt stöd för att minska storleksförvrängning, är sfäroiderna monterade i agaros-PBS-gel i en 24-brunns # 1.5 glasbottenplatta. Eftersom denna teknik gör det möjligt att montera flera sfäroider i varje brunn i en 24-brunnsplatta, kan upp till 360 sfäroider (15 sfäroider / brunn) snabbt monteras och avbildas under olika experimentella förhållanden. En brytningsindexmatchad röjningslösning konstruerad av lättillgängliga förbrukningsvaror används för att rensa monterade sfäroider och den omgivande gelén optiskt. Efter en sedimenteringsperiod på 24 timmar ger detta protokoll högkvalitativa 2D- och 3D-bilder av sfäroidstruktur, även för relativt stora sfäroider (cirka 700 μm i diameter), med mindre än 2% storleksförvrängning.

Protocol

Protokollet beskriver beredningen av en tillräcklig mängd tumörsfäroider för att montera en 24-brunnsplatta (cirka 240-360 sfäroider eller 10-15 sfäroider / brunn) vid 200 μL agarosgel per brunn och 500 μL clearinglösning per brunn. Hela proceduren illustreras i figur 1.

1. 2% agaros-PBS gelberedning

  1. Väg upp 0,5 g lågsmältande agaros (se materialtabell) i en glasflaska och tillsätt 25 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  2. Smält agarosen genom att koka lösningen i en mikrovågsugn i 30-60 s med locket stängt men inte förseglat och med konstant virvlande. Se till att agaros är helt upplöst och att lösningen inte kokar över.
    OBS: Gel kan förvaras vid rumstemperatur; kontrollera volymen före användning för att ta hänsyn till avdunstning. Ta till flytande tillstånd (mikrovågsugn; 20-60 s med virvling) innan du använder.

2. Förberedelse av clearinglösningen

  1. Väg upp 9 g N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxipropyl) etylendiamin, 22 g urea, 44 g sackaros, 0,1 g Triton X-100 och 24,9 g avjoniserat vatten (se materialtabell).
    OBS: Det är lättare att väga den ungefärliga mängden N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxipropyl)etylendiamin och justera vikten av andra komponenter för att erhålla önskad koncentration.
  2. Värm lösningen i ett 56 °C vattenbad med konstant blandning och fortsätt tills alla kristaller har lösts upp.
  3. Vila lösningen vid rumstemperatur så att bubblorna som bildas under blandningen kan stiga till ytan. Lösningen är stabil vid rumstemperatur i upp till 2 månader.

3. Sfäroid beredning

  1. Generera sfäroider med hjälp av agarosöverlagringsmetoden som tidigare beskrivits 1,3,14.
    OBS: Sfäroider som genereras av andra metoder är också kompatibla med detta bildprotokoll.
  2. Skär spetsen på en 1 ml pipettspets med en skalpell för att förstora öppningen.
    OBS: Alla sfäroider hanterades med 1 ml eller 200 μl pipetter med skärspetsar.
  3. Använd pipetten och aspirera sfäroiderna från brunnarna och överför dem till ett klart 1,5 ml koniskt rör. Flera sfäroider från samma förhållanden kan kombineras i samma rör.
    OBS: Låt alltid sfäroiderna sätta sig i botten av röret för att aspirera mediet.
  4. Tvätta sfäroiderna i 1 ml PBS två gånger, tillsätt neutral 4% förvärmd paraformaldehydlösning (PFA) och inkubera sfäroiderna vid 37 °C i 20 min.
  5. Ta bort PFA-lösningen och tvätta sfäroiderna två gånger med 1 ml PBS.

4. Sfäroid färgning

  1. Använd en pipett och överför upp till 15 sfäroider till ett 200 μL PCR-rör.
    OBS: För ömtåliga sfäroider, montera sfäroiderna i gel (steg 5.1-5.4) innan du fortsätter.
  2. Permeabilisera cellerna med 200 μL 0,5% Triton X-100 i PBS. Placera PCR-rören inuti 50 ml skruvlocksrör och inkubera sfäroiderna i 2 timmar vid rumstemperatur med mild omrörning.
    OBS: Alla inkubationer görs med omrörning på en rotor, rulle eller skakapparat (se materialtabell) om inte annat anges. Detta är viktigt för att uppnå enhetlig färgning. Fasta sfäroider i PBS kan ibland fastna på pipettspetsens sidor. Sköljning av spetsen i 0,5% Triton X-100 minimerar sfäroiderna från att fastna i spetsarna.
  3. Byt ut lösningen (steg 4.2) mot 200 μl antikroppsutspädningsbuffert (ABDIL)15 och inkubera över natten vid rumstemperatur.
  4. Ta bort ABDIL, tillsätt 75 μL primär antikropp i ABDIL och inkubera vid 4 °C i 2,5 dagar.
  5. Ta bort supernatanten och tvätta med 200 μL PBS med 0,1% Tween och 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) två gånger och inkubera med 200 μL PBS-TT i 4 timmar vid rumstemperatur.
  6. Ta bort PBS-TT, tillsätt 100 μl sekundär antikropp i ABDIL och inkubera vid 4 °C i 2,5 dagar.
    OBS: DAPI eller annat kärnfärgämne kan tillsättas i detta skede. De flesta färgämnen kräver mindre inkubationstid än antikroppar.
  7. Ta bort supernatanten och tvätta med 200 μL PBS-TT två gånger och inkubera med 200 μL PBS-TT i 4 timmar. Sfäroiderna är redo för montering.

5. Montering

  1. Använd en 200 μL pipett, överför fasta och färgade sfäroider till 500 μL PCR-rör vid ett rör per tillstånd (cirka 10-15 sfäroider).
  2. Byt ut lösningen mot 200 μl 2% (w/v) flytande agarosgel och centrifugera på snabbspinn (vid fast maxhastighet, se materialtabell) vid rumstemperatur i 30 s.
    OBS: Om du inte monterar omedelbart, placera i ett värmeblock vid 50 °C för att undvika gelhärdning.
  3. Aspirera sfäroiderna i ~ 50 μL flytande agarosgel och dispensera i brunnen på en 24-brunns glasbottenplatta.
  4. Innan gelén härdar, separera sfäroiderna med en pipettspets i den omgivande gelén och se till att sfäroiderna är täckta med gel. Placera eventuellt plattan på is för att snabbt ställa in gelén.
    OBS: Antalet sfäroider per brunn beror på storleken på sfäroiderna. Sfäroider placeras långt ifrån varandra så att endast en sfäroid kommer in i synfältet under avbildning. Detta är viktigt för automatiserad bildbehandling.
  5. Tillsätt 500 μL klareringslösning (steg 2) per brunn, så att gelén är nedsänkt. Inkubera vid rumstemperatur i minst 24 timmar och avbilda sfäroiderna i röjningslösningen. Sfäroider är stabila i denna lösning i upp till en månad vid rumstemperatur och när de skyddas mot avdunstning.

6. Bildbehandling

  1. Välj ett mål med ett arbetsavstånd som är tillräckligt långt för att omfatta hela sfäroiden, inklusive sfäroidens monteringshöjd i kärlet.
    OBS: Mål med ett arbetsavstånd på 3 mm eller längre krävs för att avbilda sfäroidernas ekvatorialplan. Högre förstoringsmål med högre NA kan möjliggöra bättre upplösning, men kommer att begränsa det maximala djupet vid vilket sfäroiderna kan avbildas.
  2. För att identifiera ekvatorialplanet, justera fokus tills den största ytan uppnås i XY-planet och bilden med önskad lasereffektprocent, detektorspänning, förstärkning och förskjutningsinställningar.
    OBS: Lasereffektprocenten, detektorspänningen, förstärkningen och förskjutningen varierar kraftigt beroende på fluorofor, färgningsintensitet, laserintensitet, detektorkänslighet etc.
  3. För 3D-bilder ställer du in början och slutet av sfäroiderna och väljer lämplig signalintensitet vid olika z-djup med hjälp av z-intensitetskorrigeringsinställningar före avbildning.
    OBS: För bästa bildupplösning, använd Nyquist samplingsfrekvens för x, y och z (för mer information, se referens16).

Representative Results

För att demonstrera förmågan hos denna clearingmetod att tillhandahålla högkvalitativa två- och tredimensionella bilder odlades sfäroider med diametrar på 300-600 μm från Fluorescent Ubiquitinationsbaserade Cell Cycle Indicator (FUCCI) transducerade melanomcellinjer FUCCI-WM164 och FUCCI-WM983b 9,17 , som uttrycker monomeriskt Kusabira Orange2 (mKO2) och monomert Azami Green (mAG) protein i Gap1 respektive tidig S-fas/Gap2/mitosfas i cellcykeln enligt de procedurer som anges i steg 3 1,3,14. Sfäroiderna fixerades sedan med 4% formaldehydlösning vid 37 ° C, permeabiliserades och färgades med anti-p27kip1 / anti-kanin Alexa Fluor 647 anti-pimonidazol / anti-mus Alexa Fluor 647, DAPI eller DRAQ7 (se materialtabell) (figur 2). Alla mikroskopifiler laddas upp till GitHub-lagringsplatsen (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). Jämfört med PBS-monterade sfäroider ger rensningslösningen bilder med hög klarhet med minimal storleksförvrängning (figur 2A). Protokollet möjliggör högupplöst avbildning av detaljer på cellnivå djupare in i sfäroiderna utan histologisk sektionering, och tvärsnittsbilden erhölls från ett 20x luftmål (0,7 NA) med en upplösning på 4096 x 4096 px utan sömmar (figur 2B). Med hjälp av en lägre förstoring och lägre numeriskt bländarmål med ett längre arbetsavstånd kan 3D-konfokalbilder som ger detaljer på cellnivå på ett djup av minst 200 μm erhållas (figur 2C). Sfäroider kryosektionerades och färgades också enligt protokollet av Spoerri et al.4 och jämfördes med helsfäroid färgning (figur 2D, E). Figur 2D visar den hypoxiska regionen av sfäroiden färgad av pimonidazol, och figur 2E visar p27kip1-färgning som markerar cellcykelstopp (gul) och DAPI-kärnfläck (grå). Proteinlokalisering och färgningsmönster är likartade mellan kryosektion och röjning och påverkas därför inte av denna rensningsmetod.

Signalintensitetskorrigering i z möjliggör avbildning av hela sfäroiden. Ljusspridning på grund av den nekrotiska kärnan begränsar emellertid förmågan att avbilda sfäroidens bortre sida. Djupare penetration och mindre spridning av en långröd fluorofor, såsom DRAQ7 kärnfläck, möjliggör ytterligare förbättrad 3D-sfäroidstrukturrepresentation (figur 3). Film 1 visar 3D-rendering av FUCCI-sfäroiderna färgade med DRAQ7. En tunnare z-skiva kan möjliggöra bättre z-upplösning, men detta ökar avsevärt avbildningstiden och fotoblekningen av fluoroforerna.

För att avgöra om clearinglösningen orsakar storleksförvrängning avbildades tolv sfäroider i 2% agaros-PBS-gel vid 6 timmar, 12 timmar, 24 timmar, 72 timmar och 168 timmar efter införandet av clearinglösningen. Bilderna sammanfattades genom att bestämma sfäroidens diameter, definierad baserat på en sfär med samma tvärsnittsarea som sfäroiden (figur 4A). Medan sfäroiderna observeras öka något i storlek under de första 6 timmarna, vilket indikeras av en diametervikningsförändring på mellan 2% och 6% (figur 4B), efter 24 timmar till 72 timmar, återgår sfäroiderna till en storlek som är ungefär lika med motsvarande storlek i PBS efter PFA-fixering (figur 4C).

figure-representative results-3833
Bild 1: Illustration av sfäroidmonterings- och rensningsprotokollet. Fasta och färgade sfäroider överförs till ett 500 μL rör; överskottsvätska ersätts med 200 μL agaros-PBS gel och centrifugeras. Sfäroider överförs sedan till en glasbottenbrunn i en 24-brunnsplatta. Efter att gelén har fått stelna tillsätts 500 μL clearinglösning och sfäroider får balansera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figure-representative results-4549
Figur 2: Jämförelse av rensade och oklara FUCCI humana melanomsfäroider. Färgning indikerar cellkärnor positiva för mKO2 (röd), vilket indikerar celler i gap 1; och cellkärnor positiva för mAG (grön), vilket indikerar celler i gap 2. (A) Sfäroider odlade från 5000 FUCCI-WM983b-celler, skördade vid dag 10 och avbildade i agaros-PBS-gel och 24 h efter att clearinglösning tillsatts. Att jämföra ljusfälts- och konfokalbilder före och efter rensningslösning visar minimal storleksförvrängning och en stor ökning av tydligheten. (B) Sfäroider odlade från FUCCI-WM164-celler permeabiliserade med Triton X-100 och färgade med DRAQ7, vilket färgar alla cellkärnor. Bilden erhålls med hjälp av ett 20x mål (0,75 NA), vilket visar att rensningslösningen möjliggör högupplöst avbildning av detaljer på cellnivå. Justering av lasereffekt, spänning och förskjutning vid olika z-plan möjliggör avbildning djupare inuti sfäroiden. (D,E) Jämförelse mellan kryosektion och rensad helsfäroid färgad för pimonidazol och p27kip1. (D) Pimonidazolfärgning i magenta visar den hypoxiska regionen i sfäroiderna. Rött och grönt indikerar FUCCI. (E) Kryosektioner och rensad sfäroid som visar DAPI (grå) och p27kip1 (gul). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figure-representative results-6227
Figur 3: Röjning möjliggör avbildning djupare in i sfäroiden med minimal ljusförlust. Konfokala mikroskopibilder av en FUCCI human melanomsfäroid vid 10x förstoring och lägre NA (0,4), vilket möjliggör avbildning vid högre z-djup med minimal signalförlust. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figure-representative results-6906
Figur 4: Röjningslösningen har minimal inverkan på sfäroidstorleken. (A) Fördelning av initial sfäroidstorlek (ekvivalent diameter) i PBS-gel (n = 12 sfäroider). (B) Diameterviktsförändring över tid sedan tillsats av clearinglösning. Vid 0 h är sfäroider endast i PBS-gel.

Film 1: 3D-rendering av en FUCCI-sfäroid färgad med DRAQ7. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Discussion

Ett protokoll för att erhålla högkvalitativa två- och tredimensionella bilder av tumörsfäroider presenteras här. Befintliga metoder, såsom CLARITY, See deep brain (SeeDB) och ScaleS, orsakar ofta storleksförvrängning med upp till 30%, medan tekniker som bensylalkohol / bensylbensoat (BABB) och 3D-avbildning av lösningsmedelsklarerade organ (3DISCO) kan släcka fluorescerande protein18. Många av dessa metoder är utformade för att rensa vävnad med strukturell integritet och förvränga storleken och strukturen när de appliceras på sfäroider18. Till skillnad från andra protokoll som använder kommersiellt tillgängliga dyra clearinglösningar, använder detta protokoll lättillgängliga förbrukningsvaror samtidigt som optisk klarhet och endogen fluorescens bibehålls och storleksförvrängning minimeras. Inbäddning av sfäroider i agaros-PBS-gel ger strukturellt stöd för sfäroider och minimerar osmotisk chock när röjningslösningen tillsätts. Detta är avgörande vid avbildning av ömtåliga sfäroider efter läkemedelsbehandling. Det antas att denna optiska clearingmetod är lämplig för sfäroider som bildas av vilken metod som helst eftersom detta protokoll är anpassat från helvävnadsrensning. Antagandet är baserat på likheten i sfäroiderna erhållna genom olika sfäroidbildningsmetoder. Valet av fixeringsmedel kan påverka sfäroidstorleken såväl som endogen fluorescens. Denna clearingmetod är lämplig för sfäroider fixerade med neutral 4% PFA-lösning. Ytterligare testning krävs för att kontrollera dess kompatibilitet med andra fixeringsmedel.

Med tanke på att denna teknik gör att flera sfäroider kan monteras samtidigt i en flerbrunnsplatta, är den väl lämpad för kvantitativa analysrörledningar som kräver sfäroidstrukturinformation från upp till 360 sfäroider per 24-brunnsplatta. Mikroskop med automatiserade scen- och plattkartläggningsfunktioner kan göra avbildning mindre manuell. Även om den här metoden är snabbare och enklare än sektionering, är den för närvarande olämplig för fullständig automatisering. Bilder som erhålls med denna metod är emellertid lämpliga för automatiserad bildbehandling 4,19, och den hastighet med vilken sfäroider kan monteras med detta protokoll ger kvantitativ analys av sfäroid inre struktur 20,21,22.

För färgning av hela sfäroider måste antikroppskoncentrationen, volymen och inkubationstiden optimeras för varje antikropp. Som vägledning, använd 2,5x av den rekommenderade 2D-immunofluorescensantikroppskoncentrationen och 100-200 μl antikropp, beroende på antalet sfäroider per rör. Se till att alla sfäroider är täckta med färgningslösning när de är på rotorn. Inkubationstiden beror på många faktorer, inklusive storleken och densiteten hos sfäroider och antikroppen, och kan sträcka sig från 16-72 h. Trots att metoden möjliggör signaldetektering djupare inuti sfäroiden orsakar fluoroforer upphetsade av UV betydande ljusspridning, vilket leder till ett lågt signal-brusförhållande. Försiktighet måste vidtas när du väljer fluoroforer för att visualisera målproteinet. Till exempel kommer färgning av mindre rikliga och strukturella proteiner med fluoroforer med längre våglängd och rikligare protein- eller kärnfläckar med fluoroforer med kortare våglängd att uppnå det bästa resultatet. Slutligen visar rensade sfäroider fortfarande ljusförlust på grund av spridning i den nekrotiska kärnan, vilket framgår av y / z-dimensionen av bilder som erhållits av 600 μm sfäroider (figur 2C).

Högre förstoringsavbildning med högre NA-mål är möjlig med sfäroider monterade och rensade med detta protokoll, men målets arbetsavstånd begränsar bilddjupet. För en oljedämpande lins är det viktigt att använda olja som har en RI på 1,51 för bästa resultat.

Sammanfattningsvis möjliggör den agarose-PBS gel inbäddade rensningsmetoden visualisering av celler djupt inuti sfäroider med hjälp av allmänt tillgängliga förbrukningsvaror. Sfäroider monterade och rensade med denna metod genomgår minimal storleksförvrängning och bibehåller sin strukturella integritet, vilket möjliggör insamling av högkvalitativa data relaterade till den inre sfäroidstrukturen och efterföljande automatiserad kvantifiering.

Acknowledgements

Denna forskning utfördes vid Translational Research Institute (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI stöds av ett bidrag från den australiska regeringen. Vi tackar prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, för att ha tillhandahållit FUCCI-konstruktionerna, prof. Meenhard Herlyn och Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, för att ha tillhandahållit cellinjerna. Vi tackar Dr Loredana Spoerri för att ha tillhandahållit C8161 kryosektionsbilder.

Detta arbete stöddes av projektbidrag till N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) och Meehan Project Grant (021174 2017002565).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#1.5 glass bottom 24-well plateCelvisP24-1.5H-N
500 µL clear PCR tubesSigmaHS4422
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson Immuno research715-605-151Dilution used 1:500
Bovine serum albuminSigmaA7906Final concentration 2% w/v
DAPISigmaD9542-10MGFinal concentration 5 µg/mL
Deionized waterMILLI Q
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647ThermofisherA-31573Dilution used 1:500
DRAQ7ThermofisherD15106Dilution used 1:250
Heating blockRatekDBH10or similar equipment
Hypoxyprobe KitsHypoxyprobeHP1-1000KitAntibody dilution used 1:500
Low-melting agarose powderSigmaA9414Final concentration 2% w/v
MicrowaveSharp
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamineSigma122262Final concentration 9% w/w
NaClSigmaS9888Final concentration 150 mM
NaN3SigmaS2002Final concentration 0.10% w/v
p27 Kip1 (D69C12) XPCell Signalling technology3686SDilution used 1:500
Paraformaldehyde solutionProscitechC004Final concentration 4% w/v
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermofisher18912014Final concentration 1x
PipetteEppendorf
Quickspin minifugeor similar equipment
RollerRatekBTR10-12Vor similar equipment
RotorRatekRSM7DCor similar equipment
ShakerRatekEOM5or similar equipment
SucroseSigmaS9378Final concentration 44% w/w
Tris-HCl pH 7.4SigmaT5941Final concentration 20 mM
Triton X-100SigmaX100Final concentration 0.10% v/v
Triton X-100SigmaX100Final concentration 0.1% v/v
Tween 20SigmaP1379Final concentration 0.1% v/v
UreaSigmaU5379Final concentration 22% w/w

References

  1. Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
  2. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  3. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2008).
  4. Spoerri, L., Gunasingh, G., Haass, N. K. Fluorescence-based quantitative and spatial analysis of tumour spheroids: A proposed tool to predict patient-specific therapy response. Frontiers in Digital Health. 3, 668390 (2021).
  5. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 20 (2020).
  6. Kabadi, P. K., et al. Into the depths: Techniques for in vitro three-dimensional microtissue visualization. BioTechniques. 59 (5), 279-286 (2015).
  7. Ivanov, D. P., Grabowska, A. M. Spheroid arrays for high-throughput single-cell analysis of spatial patterns and biomarker expression in 3D. Scientific Reports. 7, 41160 (2017).
  8. Spoerri, L., et al. Phenotypic melanoma heterogeneity is regulated through cell-matrix interaction-dependent changes in tumor microarchitecture. bioRxiv. , (2021).
  9. Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment Cell & Melanoma Research. 27 (5), 764-776 (2014).
  10. Ahmad, A., et al. Clearing spheroids for 3D fluorescent microscopy: combining safe and soft chemicals with deep convolutional neural network. bioRxiv. , 428996 (2021).
  11. Villani, T., Rossi, A. E., Sherman, H. Image-based characterization of 3-D cell culture models grown in spheroid microplates. American Laboratory. 50 (6), 12 (2018).
  12. Lloyd-Lewis, B., et al. Imaging the mammary gland and mammary tumours in 3D: optical tissue clearing and immunofluorescence methods. Breast Cancer Research. 18 (1), 127 (2016).
  13. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  14. Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-time cell cycle imaging in a 3D cell culture model of melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
  15. Cold Spring Harbor. Antibody Dilution Buffer (Abdil). Cold Spring Harbor Protocols. , (2018).
  16. Pawley, J. B., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 20-42 (2006).
  17. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  18. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
  19. Browning, A. P., Murphy, R. J. . Zenodo. , (2021).
  20. Browning, A. P., et al. Quantitative analysis of tumour spheroid structure. eLife. 10, 73020 (2021).
  21. Klowss, J. J., et al. A stochastic mathematical model of 4D tumour spheroids with real-time fluorescent cell cycle labelling. Journal of The Royal Society Interface. 19 (189), 20210903 (2022).
  22. Murphy, R. J., Browning, A. P., Gunasingh, G., Haass, N. K., Simpson, M. J. Designing and interpreting 4D tumour spheroid experiments. Communications Biology. 5 (1), 91 (2022).

Explore More Articles

Cancerforskningnummer 186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved