Osservazione profonda della fluorescenza nei germogli di riso tramite tecnologia di compensazione

La tecnologia di clearing recentemente sviluppata che elimina i disallineamenti dell'indice di rifrazione e diminuisce il materiale auto-fluorescente ha permesso di osservare i tessuti vegetali in tre dimensioni (3D) preservando le loro strutture interne. Nel riso (Oryza sativa L.), una pianta modello monocotiledone e una coltura importante a livello globale, la tecnologia di pulizia è stata riportata in organi relativamente facili da osservare, come le radici e le foglie. Sono state riportate anche applicazioni della tecnologia di clearing nel meristema apicale (SAM) e negli steli, ma solo in misura limitata a causa della scarsa penetrazione della soluzione di compensazione (CS) in questi tessuti. La limitata efficienza delle soluzioni di compensazione in questi tessuti è stata attribuita all'autofluorescenza, all'ispessimento e all'indurimento dei tessuti nello stelo mentre i fasci vascolari e l'epidermide si sviluppano e alla stratificazione del SAM con foglie idrorepellenti. Il presente protocollo riporta l'ottimizzazione di un approccio di clearing per l'osservazione continua e 3D dell'espressione genica dalla pannocchia SAM/giovane alla base dei germogli durante lo sviluppo. I campioni di tessuto fissi che esprimono un reporter proteico fluorescente sono stati tagliati in sezioni utilizzando una micro-affettatrice vibrante. Quando è stato raggiunto uno spessore appropriato, è stato applicato il CS. Prendendo di mira specificamente il tessuto centrale, il tasso di penetrazione e l'uniformità del CS sono aumentati e il tempo necessario per rendere il tessuto trasparente è diminuito. Inoltre, la pulizia delle sezioni tagliate ha permesso l'osservazione della struttura interna dell'intero servizio fotografico da una prospettiva macro. Questo metodo ha potenziali applicazioni nell'imaging profondo di tessuti di altre specie vegetali difficili da eliminare.