פיתחנו בעבר פרוטוקולים עבור Caenorhabditis elegans ליצירת זיכרונות אסוציאטיביים לטווח קצר וארוך על ידי אימון המוני ומרווח, בהתאמה. כאן מתוארים פרוטוקולים מפורטים להתניה של C. elegans על ידי זיווג 1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית כגירויים מותנים ובלתי מותנים, בהתאמה, ליצירת זיכרון אסוציאטיבי מרתיע.
הנמטודה Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר למידה וזיכרון ברמה המולקולרית והתאית בגלל הפשטות של מערכת העצבים שלה, שתרשימי החיווט הכימיים והחשמליים שלה שוחזרו לחלוטין ממיקרוגרפים אלקטרונים סדרתיים של חתכים דקים. כאן נתאר פרוטוקולים מפורטים להתניה של C. elegans על ידי אימון המוני ומרווח להיווצרות זיכרון לטווח קצר (STM) וזיכרון לטווח ארוך (LTM), בהתאמה. על ידי זיווג 1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית כגירויים מותנים ובלתי מותנים, בהתאמה, C. elegans אומן בהצלחה ליצור STM ו- LTM אסוציאטיביים מרתיעים. בעוד שבעלי חיים תמימים נמשכו ל-1-פרופנול, בעלי החיים המאומנים כבר לא נמשכו או באופן חלש מאוד ל-1-פרופנול. כמו באורגניזמים אחרים כמו אפלסיה ודרוזופילה, "גנים של למידה וזיכרון" ממלאים תפקידים חיוניים ביצירת זיכרון. במיוחד, קולטני גלוטמט מסוג NMDA, המתבטאים בשישה זוגות בלבד של אינטרנורונים ב- C. elegans, נדרשים להיווצרות STM ו- LTM, אולי כגורם צירוף מקרים. לכן, עקבות הזיכרון עשויים לשכון בין interneurons.
למידה וזיכרון חיוניים לבעלי חיים כדי לשרוד ולהתרבות על ידי ניווט יעיל בסביבות משתנות. C. elegans הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר למידה וזיכרון ברמה המולקולרית והתאית בגלל הפשטות של מערכת העצבים שלו, שתרשימי החיווט הכימיים והחשמליים שלו שוחזרו לחלוטין ממיקרוגרפים אלקטרונים סדרתיים של מקטעים דקים 1,2,3.
C. elegans לומד לקשר בין טמפרטורת הטיפוח לרעב ונודד הרחק מטמפרטורת הגדילה שלו עם זיכרון מרתיע שנמשך מספר שעות 4,5. התניה של C. elegans עם נתרן כלורי (NaCl) בהיעדר מזון מובילה לירידה בכימוטקסיס לכיוון NaCl 6,7,8. בשילוב עם אוכל, המשיכה של הבוטאנון משופרת כתוצאה מלמידה מעוררת תיאבון 9,10,11. למרות שתופעות אלה מתפרשות כלמידה אסוציאטיבית וזיכרון 10,12, ההבחנה בין למידה אסוציאטיבית לבין רגישות, הרגלה והסתגלות לא אסוציאטיבית אינה ברורה בפרדיגמת הלמידה והזיכרון של C. elegans 13,14. ואכן, בעלי חיים המותנים בבוטאנון ומניעת מזון (התניה מרתיעה) הראו צימוד מדוכא של נוירון החושים בוטנון AWC ON כדי לתקוף נוירונים על ידי אותות אינסולין מנוירונים אחרים, כולל AIA interneurons, בעוד שבעלי חיים מותנים עם בוטנון ומזון (התניה מעוררת תיאבון) הראו צימוד משופר של AWCON כדי לתקוף נוירונים15 . איתות האינסולין גורם לשינויים בביטוי גנים המושרים על ידי EGL-4 גרעיני ומווסתי שעתוק אחרים16,17. לפיכך, ללמידה ולזיכרון מרתיעים ומעוררי תיאבון אלה יש אנלוגיות עם הרגלה לא אסוציאטיבית ורגישות, בהתאמה, של נוירונים חושיים קדם-סינפטיים ברפלקס נסיגת הזימים באפלסיה18,19.
על ידי זיווג שני כימיקלים כגירוי מותנה (CS) וגירוי בלתי מותנה (US), אנו ואחרים פיתחנו פרוטוקולים להתניה של C. elegans ליצירת למידה וזיכרון אסוציאטיביים ללא שימוש במזון או ברעב כמו ארה"ב20,21,22,23. במחקר הנוכחי, הפרוטוקולים שונו כדי למצב בעלי חיים עם 1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית (HCl, pH 4.0) כמו CS ו- US, בהתאמה, עבור למידה מרתיעה וזיכרון לטווח קצר (STM) וזיכרון לטווח ארוך (LTM). C. elegans נאיבי נמשך על ידי 1-פרופנול24 ונדחה על ידי חומצה25. כאשר הותנה בתערובת של 1-פרופנול ו-HCl (pH 4.0), C. elegans כבר לא נמשך או חלש מאוד ל-1-פרופנול.
1. מתכונים
2. הכנת C מסונכרן. אלגנס
3. אימון המוני ללמידה אסוציאטיבית לטווח קצר וזיכרון
הערה: ראה איור 1 עבור זרימת העבודה של האימון ההמוני.
4. אימון מרווח ללמידה אסוציאטיבית ארוכת טווח וזיכרון
הערה: ראה איור 2 עבור זרימת עבודה מרווחת של אימון.
5. בדיקת כימוטקסיס
C. elegans הותנה על ידי אימון המוני ליצירת זיכרון אסוציאטיבי מרתיע לטווח קצר על ידי זיווג 1% 1-פרופנול מימי ו- HCl (pH 4.0) כמו CS ו- US, בהתאמה. על פי הפרוטוקול שתואר לעיל, בעלי חיים מסונכרנים טופחו על ספסל ב- RT של 18 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים ונשטפו בעדינות רבה פי 2 עם ddH2O ב- RT של 18 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בעלי החיים היו מותנים בתערובת של 1% 1-פרופנול מימי ו- HCl (pH 4.0) במשך 1 שניות. אימנו גם בעלי חיים עם ddH2O בלבד, 1% 1-פרופנול מימי בלבד, ו- HCl (pH 4.0) רק כהפניות. לאחר ההתניה, בעלי החיים נשטפו 1x עם ddH2O. חזרנו על ההתניה פי 10 ללא הפרעה (ללא ITIs). התניה מוצלחת הושגה על ידי חזרה על ההליך יותר מ 7x עד 10x. התניה של יותר מפי 10 הביאה ללמידה פחות יעילה21. לאחר האימון, בעלי החיים נחו על מזון חיידקי במשך 10 דקות ב- RT (18 מעלות צלזיוס). לאחר שנשטפו עם ddH2O 3x, בעלי החיים הועברו לצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי השעיה בג'לטין מימי של 0.25% והתיישבו לתחתית על ידי כוח הכבידה. לאחר הסרת הסופר-נטנט ככל האפשר, החיות עברו החייאה עדינה בחיץ בדיקה כימוטקסיס ולאחר מכן הורשו להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה.
לאחר הסרת כמה שיותר סופרנטנטים, ההשעיה של בעלי החיים זוהתה על המעגל המרכזי של צלחת בדיקה כימוטקסיס, אשר נשמרה ב- RT של 18 מעלות צלזיוס, ואז בעלי חיים הורשו לנוע בחופשיות על הצלחת במשך 10 דקות ב- RT של 18 מעלות צלזיוס. ערכי C.I. חושבו באמצעות המשוואה המוצגת באיור 3B. כפי שניתן לראות באיור 4A, בעלי חיים עם תערובת של 1% 1-פרופנול ו-HCl כבר לא נמשכו ל-5% 1-פרופנול שנצפו על צלחות אגר לצורך בדיקת כימוטקסיס, בעוד שבעלי חיים נאיביים ובעלי ייחוס נמשכו באופן דומה ל-5% 1-פרופנול. לאחר האימון ההמוני (שלב 3.), הזיכרון כבר לא נצפה תוך 3 שעות20. יתר על כן, הזיכרון שנוצר על ידי האימון ההמוני היה רגיש להלם קר20. תוצאות אלה מראות כי C. elegans הצליח ליצור STM מרתיע על ידי אימון המוני.
בעלי חיים היו מותנים גם על ידי אימון מרווח 10x עם ITI של 10 דקות בין שלבי האימון (שלב 4.). במהלך ITI, אספן עם בעלי חיים הונח על מדשאה חיידקית על צלחת 6 ס"מ NGM ב RT של 18 מעלות צלזיוס. בעלי חיים שהותנו על ידי אילוף מרווח עם תערובת של 1% 1-פרופנול מימי ו-HCl (pH 4.0) כבר לא נמשכו ל-5% 1-פרופנול בהשוואה לבעלי חיים שטופלו ב-1% 1-פרופנול בלבד, HCl (pH 4.0) בלבד, או ddH2O בלבד (איור 4B). לאחר האימון המרווח, בעלי החיים שמרו על הזיכרון במשך יותר מ-12 שעות ו-20,21. יתר על כן, הזיכרון לא נוצר כאשר בעלי חיים טופלו במעכבי תרגום או שעתוק והיה עמיד בפני הלם קר20,21. לכן, C. elegans בהצלחה יצר LTM מרתיע על ידי אימון מרווח.
בחנו גם את ההשפעות של מוטציות ב"גנים של למידה וזיכרון" על היווצרות STM ו-LTM. הגן crh-1 מקודד את גורם השעתוק cAMP-response חלבון קושר אלמנטים (CREB), glr-1 ו- nmr-1 מקודדים α-אמינו-3-הידרוקסיל-5-מתיל-4-איזוקסאזולפרופיונית (AMPA)-סוג ו-N-מתיל-D-אספרטט (NMDA)-סוג תת-יחידות קולטן גלוטמט, בהתאמה, ו stau-1 מקודד את איזופורם חלבון RNA קושר RNA דו-גדילי. גנים אלה ממלאים תפקידים חיוניים בהתניה קלאסית ב-C. elegans, Drosophila, Aplysia ועכברים. באמצעות תערובת של 1% 1-פרופנול מימי ו-HCl (pH 4.0), היווצרות STM ו-LTM הייתה תלויה בכל הגנים (איורים 5A,B).
איור 1: סכמת ניסויים של אימון המוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: סכמת ניסוי של אימון מרווח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: בדיקת כימוטקסיס ומדד כימוטקסיס . (A) ייצוג סכמטי של צלחת בדיקה כימוטקסית. צלחות פטרי (בקוטר 6 ס"מ) הופרדו לארבעה אזורים כפי שמוצג, ו-4 μL כל אחד של 5% 1-פרופנול מימי או ddH 2 O זוהו באלכסון בשני מקומות כל אחד, במרחק של2ס"מ מהמרכז. (B) ערכי מדד כימוטקסיס חושבו מהמשוואה המוצגת על ידי ספירת מספר בעלי החיים באזורים "a" ו- "b" לאחר השלמת הכימוטקסיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ערכי מדד כימוטקסיס של בעלי חיים המותנים בכימיקלים. חיות בר מסונכרנות מסוג N2 הותאמו בכימיקלים שצוינו על ידי (A) אימון המוני 10x או (B) אימון מרווח 10x. תרשימי זרימה של פרוטוקולי האימון ההמוני והמרווח שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. לאחר ההתניה, החיות היו חופשיות לנוע במשך 10 דקות על צלחת אגר בגודל 6 ס"מ לבדיקת כימוטקסיס ב- RT של 18 מעלות צלזיוס. ערכי C.I. חושבו באמצעות המשוואה המוצגת באיור 3B. הנתונים לנתון זה מופיעים בטבלה משלימה 1. נתונים מהחיות התמימות שוחזרו בשני לוחות האיורים. עלילת בר מציגה את הרבעון הראשון, החציון והרבעון השלישי. כוכביות (*P < 0.05) מצביעות על הבדלים מובהקים סטטיסטית שנקבעו על ידי ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של דנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: למידת ערכי אינדקס של חיות מוטנטיות מותנות. בעלי חיים מסונכרנים מסוג N2 ובעלי חיים מוטנטיים שצוינו הותנו בתערובת של 1% 1-פרופנול מימי ו-HCl (pH 4.0) על ידי (A) אימון המוני 10x או (B) אימון מרווח 10x. תרשימי זרימה של פרוטוקולי האימון ההמוני והמרווח שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. לאחר ההתניה, החיות היו חופשיות לנוע במשך 10 דקות על צלחת אגר בגודל 6 ס"מ לבדיקת כימוטקסיס ב- RT של 18 מעלות צלזיוס. הנתונים לנתון זה מובאים בטבלה משלימה 2. עלילת בר מציגה את הרבעון הראשון, החציון והרבעון השלישי. כוכביות (*P < 0.05) מצביעות על הבדלים מובהקים סטטיסטית שנקבעו על ידי ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של דנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: בעלי חיים בוגרים צעירים רגישים לטיפול כימי. יום 4 ויום 5 חיות N2 מסוג בר לאחר הבקיעה עברו הכשרה המונית של פי 10 עם HCl, pH 4.0, ללא הפרעה ולאחר מכן נבדקו עבור כימוטקסיס ל-5% 1-פרופנול מימי. ברים הם אמצעי ± S.E.M. (n = 19). כוכביות (*P < 0.05) מצביעות על הבדלים מובהקים סטטיסטית שנקבעו על ידי ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן טוקי-קרמר לאחר ההוק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 1: נתונים המתאימים לתרשים 4. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה משלימה 2: נתונים המתאימים לתרשים 5. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
במחקר הנוכחי, כל הריאגנטים הוחזקו ב-RT של ~18 מעלות צלזיוס בממוצע, ובעלי חיים טופחו על ספסל ב-RT כדי למנוע לחץ על בעלי החיים. יתר על כן, כל הליכי הניסוי בוצעו ב- RT. בעלי חיים טופחו בתחילה באינקובטור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הותנו על ספסל ב~ 24 מעלות צלזיוס באמצעות ריאגנטים ב- RT. בתנאים אלה, תוצאות ההתניה היו שונות מאוד. ב-RT הנמוך, C. elegans גדל לאט ויש לגדל אותו זמן רב יותר מאשר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שהחיות יגיעו לשלב הבגרות הבוגרת, שכן בעלי חיים בוגרים צעירים רגישים יותר לכימיקלים המשמשים לריכוך מאשר בעלי חיים בוגרים ועשויים להראות ערכי C.I. נמוכים יותר.
השלב הקריטי ביותר למיזוג מוצלח הוא שטיפת בעלי חיים עם ddH2O מיד לאחר כל טיפול כימי. לכן, יש למזער את הלחץ המכני ואת הלחץ הטמפרטורות על ידי שימוש בקצוות פיפט מנוסרים, שמירה על ריאגנטים ב- RT, ושטיפה עדינה מאוד של בעלי החיים על ידי הזזה איטית מאוד של אספן החיות למעלה ולמטה ב- ddH2O. שטיפה יסודית של בעלי החיים בכל פעם לאחר ההתניה עשויה להשפיע על הלמידה והזיכרון. גם התנאים של לוחות הבדיקה של כימוטקסיס משפיעים קשות על התוצאות. צלחות יבשות מדי או רטובות מדי מונעות תנועה חלקה של בעלי החיים. צלחות הוכנו כמתואר בשלב 1.; צלחת טובה היא אחת שעבורה 4 כתמי μL של ddH2O או 5% 1-פרופנול מימי נספגים לחלוטין על ידי האגר בערך 5 דקות לאחר ההמראה. כפי שתואר לעיל, גם גילאי בעלי החיים קריטיים להתניה מוצלחת. בעלי חיים בוגרים צעירים רגישים לטיפול מכני וכימי, וכתוצאה מכך לתוצאות משתנות, אם כי גם בעלי חיים מבוגרים מאוד עשויים שלא להתאים להתניה.
חיי המדף של 1-פרופנול תלויים במותגים ובמגרשים והוא פחות מ-3 חודשים ב-RT. כאשר ערכי ה- C.I. של בעלי חיים תמימים מחמירים, מומלץ להשתמש ב- 1-propanol טרי לבדיקת ההתניה והכימוטקסיס.
היווצרות הזיכרון על ידי אימון המוני לא הושפעה מהטיפול בבעלי חיים עם מעכבי תרגום (ציקלוהקסמיד ואניסומיצין) ומעכב שעתוק (אקטינומיצין D), בעוד שהיווצרות הזיכרון על ידי האימון המרווח עוכבה במידה ניכרת על ידי המעכבים20,21. יתר על כן, הזיכרון הראשון נרקב על ידי הלם קר, בעוד האחרון נשמר לתקופה ארוכה יותר מאשר הראשון והיה עמיד בפני הלם קר. תוצאות אלה מראות כי הראשון הוא STM והאחרון הוא LTM,בהתאמה 20,21. עם זאת, הזיכרון שנוצר על-ידי האימון ההמוני עשוי להיות מורכב מ-STM ומזיכרון לטווח בינוני (טווח ביניים) מאחר ש-STM תלוי במידה חלשה בגורם השעתוק של CREB (איור 5A). זה עולה בקנה אחד עם התוצאה כי STM נשמר במשך יותר מ 1 שעה20,21. היווצרותם של STM ו-LTM תלויה מאוד ב-nmr-1, המתבטא רק בשישה זוגות של נוירונים (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG ו-PVC) ב-C. elegans27,28. בתאי עצב אלה, אם כן, קולטני NMDA עשויים לפעול כגלאי צירוף מקרים מולקולרי של 1% אותות 1-פרופנול מימי ו-HCl (pH 4.0) לפלסטיות סינפטית, כאשר החיזוק הסינפטי הנדרש הן ל-STM והן ל-LTM יכול לנבוע מירי מקרי של נוירונים טרום-סינפטיים ואחריהם 29,30,31,32,33. לכן, הזיכרון האסוציאטיבי המרתיע עשוי להיווצר בקרב interneurons.
השיטות המתוארות במחקר הנוכחי צריכות להיות ישימות ללמידה מעוררת תיאבון של חוש הריח ולזיכרון אסוציאטיבי לטווח קצר וארוך באמצעות 1-נונול כ- CS ואשלגן כלורי כמו ארה"ב21. מעניין להשוות את המעגלים העצביים המעורבים בהיווצרות זיכרונות מעוררי תיאבון ומרתיעים.
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
אנו מודים לטקאשי מוריאמה, אי-איצ'ירו סאיטה, יו ון צ'אנג והיטומי אוהטאקי על עזרתם הטכנית והערותיהם על כתב היד. זנים סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, הממומן על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר של NIH (NCRR). עבודה זו נתמכה על ידי מימון מאוניברסיטת אוקינאווה למדע וטכנולוגיה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
500 mL beaker | HARIO | B-500-H32 | |
10 µL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-104-96RS-Q | |
0.2 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | TTW110RS-Q | |
1.0 mL pipette tips | Thermo Fisher Scientific | H-111-R100NS-Q | |
1.5 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
2 mL plastic tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
10 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-04 | |
50 mL Serological pipettes | As One | 2-5237-06 | |
6-well cell culture plate | Costar | 3516 | |
Aron Alpha (Glue for plastic) | Toagosei | High Speed EX | |
Autoclave | Tomy Digital Biology | SX-300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | |
Bacto peptone | BD | 211677 | |
Bottle top 0.2 µm filter units | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
Bunsen burner | EISCO | SKU CH0089A | |
Calcium chloride dihydrate | Nacalai Tesque | 06730-15 | |
C. elegans mutant strains | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Cholesterol | Wako Pure Chemical Industries | 034-03002 | |
Clear acrylic cylindrical pipe | Asahi Kasei | 3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness) | |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-80 | |
Dental burner | Phoenix-Dent | APT-3 | |
Di-potassium hydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28726-05 | |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | ||
Electric pipetter | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Gelatin | Wako Pure Chemical Industries | 073-06295 | |
Glass Petri dishes (10 cm in diameter) | As One | Trade FLAT Mark | |
Heating magnetic stirrer | Thermo Fisher Scientific | SP131324 | |
Hydrochloric acid | Nacalai Tesque | 37345-15 | |
Incubator | SANYO | MIR-553 | |
Kimwipes S-200 | Nippon Paper Crecia | 62011 | |
Laboratory coat | TOYO LINT FREE | FH240C | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Nacalai Tesque | 21002-85 | |
Magnetic stirrer bar | SANSYO | 93-5412 | |
Metal spatula | FUJIFILM Wako | 647-06531 | |
Nitrile gloves | Kimberly-Clark | KC100 | |
Nylon mesh (mesh size: 30 μm) | SEFAR | NY30-HD | |
P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
P200 pipetman | Gilson | F123600 | |
P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
pH meter | HORIBA | Navi F-52 | |
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter) | IWAKI | SH90-15E | |
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter) | SARSTEDT | 82.1194.500 | |
Plastic weighing boats | As One | 1-5233-01 | |
Platinum wire for a worm pick | Nilaco | PT-351265 | |
1-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 279544 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Nacalai Tesque | 28721-55 | |
Safety goggles | Kimberly-Clark | #25646 | |
Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-05 | |
Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
Tooth picks | |||
Water purification sysytem | Merck | Elix Essential 10 UV | |
Water urification sysytem | Merck | Milli-Q Synthesis A10 | |
Weighing balance | METTLER | TOREDO | |
Wild type C. elegans strain N2 | Caenorhabditis Genetics Center |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved