למידה אסוציאטיבית מרתיעה ויצירת זיכרון על ידי זיווג שני כימיקלים ב- Caenorhabditis elegans

Summary

פיתחנו בעבר פרוטוקולים עבור Caenorhabditis elegans ליצירת זיכרונות אסוציאטיביים לטווח קצר וארוך על ידי אימון המוני ומרווח, בהתאמה. כאן מתוארים פרוטוקולים מפורטים להתניה של C. elegans על ידי זיווג 1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית כגירויים מותנים ובלתי מותנים, בהתאמה, ליצירת זיכרון אסוציאטיבי מרתיע.

Abstract

הנמטודה Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר למידה וזיכרון ברמה המולקולרית והתאית בגלל הפשטות של מערכת העצבים שלה, שתרשימי החיווט הכימיים והחשמליים שלה שוחזרו לחלוטין ממיקרוגרפים אלקטרונים סדרתיים של חתכים דקים. כאן נתאר פרוטוקולים מפורטים להתניה של C. elegans על ידי אימון המוני ומרווח להיווצרות זיכרון לטווח קצר (STM) וזיכרון לטווח ארוך (LTM), בהתאמה. על ידי זיווג 1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית כגירויים מותנים ובלתי מותנים, בהתאמה, C. elegans אומן בהצלחה ליצור STM ו- LTM אסוציאטיביים מרתיעים. בעוד שבעלי חיים תמימים נמשכו ל-1-פרופנול, בעלי החיים המאומנים כבר לא נמשכו או באופן חלש מאוד ל-1-פרופנול. כמו באורגניזמים אחרים כמו אפלסיה ודרוזופילה, "גנים של למידה וזיכרון" ממלאים תפקידים חיוניים ביצירת זיכרון. במיוחד, קולטני גלוטמט מסוג NMDA, המתבטאים בשישה זוגות בלבד של אינטרנורונים ב- C. elegans, נדרשים להיווצרות STM ו- LTM, אולי כגורם צירוף מקרים. לכן, עקבות הזיכרון עשויים לשכון בין interneurons.

Introduction

למידה וזיכרון חיוניים לבעלי חיים כדי לשרוד ולהתרבות על ידי ניווט יעיל בסביבות משתנות. C. elegans הוא אורגניזם מודל אטרקטיבי לחקר למידה וזיכרון ברמה המולקולרית והתאית בגלל הפשטות של מערכת העצבים שלו, שתרשימי החיווט הכימיים והחשמליים שלו שוחזרו לחלוטין ממיקרוגרפים אלקטרונים סדרתיים של מקטעים דקים ^1,2,3.

C. elegans לומד לקשר בין טמפרטורת הטיפוח לרעב ונודד הרחק מטמפרטורת הגדילה שלו עם זיכרון מרתיע שנמשך מספר שעות ^4,5. התניה של C. elegans עם נתרן כלורי (NaCl) בהיעדר מזון מובילה לירידה בכימוטקסיס לכיוון NaCl ^6,7,8. בשילוב עם אוכל, המשיכה של הבוטאנון משופרת כתוצאה מלמידה מעוררת תיאבון 9,10,11^. למרות שתופעות אלה מתפרשות כלמידה אסוציאטיבית וזיכרון 10,12, ההבחנה בין למידה אסוציאטיבית לבין רגישות, הרגלה והסתגלות לא אסוציאטיבית אינה ברורה בפרדיגמת הלמידה והזיכרון של C. elegans ^13,14. ואכן, בעלי חיים המותנים בבוטאנון ומניעת מזון (התניה מרתיעה) הראו צימוד מדוכא של נוירון החושים בוטנון AWC ON כדי לתקוף נוירונים על ידי אותות אינסולין מנוירונים אחרים, כולל AIA interneurons, בעוד שבעלי חיים מותנים עם בוטנון ומזון (התניה מעוררת תיאבון) הראו צימוד משופר של AWC^ON כדי לתקוף נוירונים¹⁵ . איתות האינסולין גורם לשינויים בביטוי גנים המושרים על ידי EGL-4 גרעיני ומווסתי שעתוק אחרים^16,17. לפיכך, ללמידה ולזיכרון מרתיעים ומעוררי תיאבון אלה יש אנלוגיות עם הרגלה לא אסוציאטיבית ורגישות, בהתאמה, של נוירונים חושיים קדם-סינפטיים ברפלקס נסיגת הזימים באפלסיה^18,19.

על ידי זיווג שני כימיקלים כגירוי מותנה (CS) וגירוי בלתי מותנה (US), אנו ואחרים פיתחנו פרוטוקולים להתניה של C. elegans ליצירת למידה וזיכרון אסוציאטיביים ללא שימוש במזון או ברעב כמו ארה"ב^20,21,22,23. במחקר הנוכחי, הפרוטוקולים שונו כדי למצב בעלי חיים עם 1-פרופנול וחומצה הידרוכלורית (HCl, pH 4.0) כמו CS ו- US, בהתאמה, עבור למידה מרתיעה וזיכרון לטווח קצר (STM) וזיכרון לטווח ארוך (LTM). C. elegans נאיבי נמשך על ידי 1-פרופנול²⁴ ונדחה על ידי חומצה²⁵. כאשר הותנה בתערובת של 1-פרופנול ו-HCl (pH 4.0), C. elegans כבר לא נמשך או חלש מאוד ל-1-פרופנול.

Protocol

1. מתכונים

1. לוחות אגר NGM (שלב 2.1.)
   1. כדי להכין צלחות NGM בקוטר 6 ס"מ, ממיסים 2.5 גרם פפטון, 3 גרם של NaCl ו-17 גרם של אגר ב-850 מ"ל של_H2O שעבר דה-יוניזציה כפולה (ddH₂O). הבא את הנפח הכולל ל 972 מ"ל עם ddH₂O.
   2. לאחר האוטוקלב, יש להתקרר ל~65°C ולהוסיף 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול מומס באתנול, 1 מ"ל כל אחד מ-1 M CaCl₂ ו-1 M MgSO₄, ו-25 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט (pH 6.0). לאחר ערבוב טוב, יש לפזר 8 מ"ל כל אחד עד 6 ס"מ (בקוטר) צלחות פטרי.
   3. שמור את הצלחות עם המכסים על ספסל בטמפרטורת החדר (RT) למשך יום אחד, ולאחר מכן שמור אותן בכלי פלסטיק בחדר קר עד לשימוש.
2. הכינו את Luria-Bertani (LB) בינוני (שלב 2.1.) על ידי המסת 10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים ו-10 גרם NaCl בליר אחד של ddH₂O. התאימו את ה-pH ל-7.0 עם 5 N NaOH (מספר טיפות) ועקרו על ידי אוטוקלבינג.
   1. הכינו צלחות LB על ידי הוספת 15 גרם אגר למדיום LB. לאחר ההרכבה האוטומטית, יש לקרר לטמפרטורה של ~60°C ולחלק 12 מ"ל כל אחד עד 9 ס"מ (בקוטר) צלחות פטרי. יש לשמור את הצלחות בכלי פלסטיק בחדר קר עד לשימוש.
3. כדי ליצור אספן בעלי חיים (שלב 2.4.), חברו רשת ניילון (גודל רשת של 30 מיקרומטר) לתחתית צינור גלילי אקרילי שקוף (3.5 ס"מ אורך, 3 ס"מ קוטר חיצוני, 2 מ"מ עובי דופן) עם דבק.
4. כדי לייצר תמיסת ג'לטין מימית של 0.25% (שלב 2.4.), יש להמיס 0.25 גרם ג'לטין ב-100 מ"ל של ddH₂O. לעקר על ידי אוטוקלבינג.
5. לוחות בדיקה של כימוטקסיס (שלב 5.1.)
   1. כדי להכין צלחות אגר לבדיקת כימוטקסיס, ממיסים 15 גרם אגר ב 993 מ"ל של ddH₂O על ידי אוטוקלב, ומקררים את התמיסה ל ~ 65 מעלות צלזיוס.
   2. לאחר מכן, הוסף 5 מ"ל של אוטוקלבלד 1 M אשלגן פוספט (pH 6.0), 1 מ"ל של 1 M CaCl₂, ו 1 מ"ל של 1 M MgSO₄ לתמיסת אגר. כל הפתרונות הללו מעוקרים בנפרד על ידי autoclaving.
   3. יש לחלק 10 מ"ל מהתמיסה המעורבת לצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ. הניחו את הצלחות האלה עם מכסים על ספסל ב-RT למשך יומיים, ולאחר מכן הניחו אותן על מגבות נייר רטובות בכלי פלסטיק ב-RT עד לשימוש. צלחות אלה ניתן להשתמש עד 10 ימים.
6. כדי ליצור חיץ בדיקת כימוטקסיס (שלב 5.4.), יש לערבב 5 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט (pH 6.0), 1 מ"ל של 1 M CaCl 2, 1 מ"ל של 1 M MgSO_4, ו-993 מ"ל של ddH₂O. לעקר בנפרד את כל הפתרונות הללו על ידי autoclaving.
7. כדי ליצור תמיסת תערובת של 40 mL CS/US (1% 1-פרופנול מימי ו-HCl [pH 4.0]) (שלב 3.1. ושלב 4.1.), הוסף 0.4 מ"ל של 1-פרופנול מוחלט ו-4 μL של 5 M HCl (0.1 mM בריכוז הסופי) ל-39.6 מ"ל של ddH₂O. שמור את התמיסה ב- RT.
8. כדי ליצור ddH 2 O, יש לטפל במי ברז פי₂באמצעות מערכות טיהור מים (עיין בטבלת החומרים).
9. הכן תרבית נוזלית (OD₆₀₀ = ~ 0.7) של Escherichia coli OP50 על ידי חיסון מושבה טרייה עם קיסם לתוך 10 מ"ל של LB בינוני דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7-8 שעות. חיידקים המעובדים במשך תקופה ארוכה יותר יכולים להשפיע על התוצאות של התניה, אולי בגלל מטבוליטים משניים.

2. הכנת C מסונכרן.  אלגנס

1. באמצעות שיטות סטנדרטיות²⁶, לטפח בעלי חיים על לוחות NGM 6 ס"מ (שלב 1.1.). לוחות NGM מוכנים על ידי פיזור 0.2 מ"ל של תרבית נוזלית E. coli OP50 במדיום LB (ראה שלב 1.9 .) ודגרה ב- RT למשך לא יותר מ-24 שעות (חיידקים ישנים יכולים להשפיע על תוצאות ההתניה).
   הערה: הלמידה והזיכרון של C. elegans רגישים מאוד ללחצים מכניים, כימיים וטמפרטורה. לכן, מומלץ מאוד לטפח בעלי חיים, לשמור על כל הריאגנטים כולל מים, ולבצע את כל הבדיקות ב- RT בין 17 °C ל 20 °C (70 °F). יש להימנע מגירוי פיזיקלי ומכני כגון מערבולות, פיפטות גסות וצנטריפוגה. יש להשתמש ב-1-פרופנול טרי כל 3 חודשים לכל היותר מסיבה לא ידועה. חשוב לציין שיש לטפח בעלי חיים עם שפע של מזון, שכן הרעבה עלולה להשפיע קשות על תוצאות ההתניה.
2. ביום הראשון, בחרו והניחו חמש חיות גרבידיות שניזונו היטב (שימו יותר חיות מוטנטיות שמטילות ביצים לאט) על כל אחת מארבע צלחות ה-NGM בגודל 6 ס"מ עם בורר תולעי פלטינה, ותנו להן להטיל ~50 ביצים במשך 3 שעות ב-RT כדי לקבל אוכלוסייה מסונכרנת של בעלי חיים בוגרים. עצור את הטלת הביצים על ידי הסרת חיות הורה מהצלחות באמצעות בורר תולעי פלטינה.
   הערה: יש לשמור את הצלחות שנזרעו ב-RT כדי למזער את הלחץ על בעלי החיים.
3. טפחו את בעלי החיים ב-RT במשך כ-5 ימים, שזה הזמן שלוקח לבעלי החיים להגיע לשלב הבוגר שלהם, ולא לשלב הבוגר הצעיר.
   הערה: יש להתאים את תקופת הטיפוח בין 4.5 ימים ל-5.5 ימים בהתאם לתנאים, שכן בעלי חיים בוגרים צעירים רגישים יותר לכימיקלים המשמשים להתניה מאשר חיות בוגרות (איור משלים 1). לאחר ההתניה, בעלי חיים בוגרים צעירים יותר עשויים להראות ערכי אינדקס כימוטקסיס (C.I.) נמוכים יותר.
4. אסוף ~ 200 בעלי חיים בוגרים באספן בעלי חיים (ראה שלב 1.4.) על ידי שטיפת כל צלחת עם 1 מ"ל של 0.25% ג'לטין מימי (שלב 1.4.) ג'לטין מימי זה מונע הידבקות של בעלי החיים לפני השטח של פלסטיק כגון קצוות פיפטה.
5. שטפו את בעלי החיים באספן עם ddH 2 O (שלב 1.8.) על ידי הזזה עדינה מאוד של האספן למעלה ולמטה 2x ב~ 10 מ"ל של ddH2 O. חזור על תהליך זה פי 2 יותר (3x בסך הכל) עם ~ 10 מ"ל של ddH₂O כל אחד כדי למנוע זיהום חיידקי.
   הערה: זיהום חיידקי משפיע קשות על כימוטקסיס של בעלי חיים.

3. אימון המוני ללמידה אסוציאטיבית לטווח קצר וזיכרון

הערה: ראה איור 1 עבור זרימת העבודה של האימון ההמוני.

1. טבלו בעדינות את אספן החיות המכיל ~200 בעלי חיים ב-40 מ"ל של תערובת של 1% 1-פרופנול ו-HCl (pH 4.0 לאחר ערבוב עם 1-פרופנול; ראו שלב 1.7.) בכלי מתגבש למשך ~1 שניות.
   הערה: עבור חיות הבקרה, עשו את אותו הדבר אך טבלו רק ב-1% 1-פרופנול מימי. עדיף לטפל בבעלי חיים עם HCl (pH 4.0) רק כבקרה נוספת.
2. לשטוף את החיות באספן על ידי טבילה עדינה מאוד של אספן 1x ב 10 מ"ל של ddH₂O בבאר של צלחת תרבית רקמה 6 בארות.
   הערה: שלב כביסה זה חייב להיות עדין מאוד ולהיעשות רק פי 1 מכיוון שכביסה נרחבת עלולה למנוע למידה.
3. חזור על שלבים 3.1. ו-3.2. 10x ללא הפרעה (מרווח בין הניסויים [ITI], 0 דקות).
   הערה: השתמש ב- ddH₂O טרי בכל פעם ב- RT.
4. הניחו את האספן על מדשאת E. coli OP50 על צלחת NGM בקוטר 6 ס"מ למשך 10 דקות ב-RT על מנת שהחיות יוכלו לנוח.
5. שטפו את בעלי החיים באספן עם ddH 2 O על ידי הזזה עדינה מאוד של האספן למעלה ולמטה 2x ב~10 מ"ל של ddH2 O. חזרו על תהליך זה פי 2 יותר (3x בסך הכל) עם ~ 10 מ"ל של ddH₂O כל אחד כדי למנוע זיהום חיידקי.
6. המשך לבדיקת כימוטקסיס כמתואר להלן (שלב 5).

4. אימון מרווח ללמידה אסוציאטיבית ארוכת טווח וזיכרון

הערה: ראה איור 2 עבור זרימת עבודה מרווחת של אימון.

1. לטבול בעדינות אספן בעלי חיים המכיל ~200 בעלי חיים ב-40 מ"ל של תערובת של 1% 1-פרופנול ו-HCl (pH 4.0 לאחר ערבוב עם 1-פרופנול; ראו שלב 1.7.) בצלחת מתגבשת במשך ~1.0 שניות.
   הערה: בצע את אותו הדבר עם 1% 1-פרופנול מימי רק כבקרה. עדיף לטפל בבעלי חיים עם HCl (pH 4.0) רק כבקרה נוספת.
2. לשטוף את החיות באספן על ידי טבילה קצרה מאוד של אספן 1x ב 10 מ"ל של ddH₂O בבאר של צלחת תרבית רקמה 6 באר.
   הערה: כביסה זו חייבת להיות קצרה מאוד מכיוון שכביסה נרחבת עלולה למנוע למידה.
3. הניחו את האספן על מדשאה מסוג E. coli OP50 על צלחת אגר NGM בצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ (בקוטר) למשך 10 דקות ב-RT על מנת שהחיות יוכלו לנוח.
   הערה: מנוחה זו במשך 10 דקות כמו ITI הוא חיוני עבור בעלי החיים כדי לאחד זיכרונות להיווצרות LTM.
4. חזור על שלבים 4.1.-4.3. פי 10.
5. לשטוף את החיות באספן עם ddH 2 O על ידי הזזה עדינה מאוד של האספן למעלה ולמטה 2x ב ~ 10 מ"ל של ddH 2 O, אשר נשמר ב RT. חזור על תהליך זה 2x יותר (3x בסך הכל) עם ~ 10 מ"ל של ddH₂O כל אחדכדי למנוע זיהום חיידקי.
6. המשך לבדיקת כימוטקסיס כמתואר להלן (שלב 5.).

5. בדיקת כימוטקסיס

1. הכינו צלחות אגר לבדיקת כימוטקסיס בצלחות פטרי מפלסטיק בקוטר 6 ס"מ (ראו שלב 1.5).
2. העבר בעלי חיים באספן (שלב 2.5.), אשר ממוקם על משטח שטוח של מכסה צלחת פטרי פלסטיק, לצינור microcentrifuge 2 מ"ל עם 1 מ"ל של 0.25% ג'לטין מימי באמצעות קצה פיפטה מנוסר עם פתח >1 מ"מ (קוטר פנימי).
   הערה: חשוב להשתמש בקצה פיפטה מנוסר כדי למזער את לחץ הגזירה על בעלי חיים.
3. הסר את supernatant מן הצינור לאחר החיות להתיישב בתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה במשך ~ 1 דקות (לא צנטריפוגה).
4. החזירו בעדינות את החיות ל-1 מ"ל של מחסום בדיקת כימוטקסיס (ראו שלב 1.6.) ותנו להן להתיישב בכוח הכבידה לתחתית הצינור למשך ~1 דקות (אל תעשו צנטריפוגה). הסר כמה שיותר סופרנטנט על ידי פיפטציה.
5. בינתיים, יש לזהות באלכסון 4 μL כל אחד מ-5% 1-פרופנול מימי בשני מקומות ולזהות 4 μL כל אחד מ-ddH₂O בשני מקומות אחרים באותו אופן, כפי שמוצג באיור 3A. עבור בדיקת כימוטקסיס של מוטנטים בעלי רגישות נמוכה יותר ל-1-פרופנול, יש לזהות ריכוזים גבוהים יותר של 1-פרופנול מימי המביאים לערכים של ~0.6 chemotaxis index (C.I.) של מוטנטים נאיביים, כפי שמוצג בטבלה משלימה 1.
   הערה: חשוב להשלים את הליכי האיתור במהירות האפשרית. ספוט 5% 1-פרופנול מימי מאז 1% 1-פרופנול מימי הוא חלש מכדי למשוך בעלי חיים במבחן chemotaxis. לעומת זאת, יש להשתמש ב-1% 1-פרופנול מימי לצורך התניה, שכן בעלי חיים שטופלו בריכוזים גבוהים יותר של 1-פרופנול מימי מאשר 1% מראים ערכי C.I. נמוכים יותר.
6. נקודתי 6 חלקים μL של תרחיף בעלי החיים בחיץ בדיקה כימוטקסיס (שלב 5.4.) המכיל ~ 60 בעלי חיים במרכז שלוש צלחות לבדיקת כימוטקסיס באמצעות קצה פיפטה מנוסר עם פתח ~ 1.0 מ"מ (קוטר פנימי). הסר נוזל ככל האפשר עם פתיל רקמת מעבדה מבלי לגעת בבעלי החיים והניח מכסה על הצלחת.
   הערה: חשוב להשלים הליכים אלה במהירות האפשרית.
7. אפשר לבעלי החיים לנוע בחופשיות על הצלחת במשך 10 דקות ב- RT, ולאחר מכן להעביר את הצלחת לתוך צלחת פטרי זכוכית על קרח במשך 3 דקות כדי לעצור chemotaxis. לאחר מכן, שמרו את הצלחת במקרר עד לספירת מספר בעלי החיים בצלחת.
8. ספרו את מספר בעלי החיים בארבעה חלקים, למעט אלה שבמעגל המרכזי, תחת סטריאומיקרוסקופ וחשבו את מדד הכימוטקסיס (C.I.) באמצעות המשוואה המוצגת באיור 3B. מתוך ערכי C.I. יש לחשב את ערכי מדד הלמידה (L.I.) כהפרש בין ערך ה- C.I. של חיות הייחוס לבין ערך ה- C.I. של בעלי החיים המותנים (L.I. = _{C.I.reference}- C.I.מותנה).
   הערה: ערך ה- C.I. של חיות הייחוס (_{C.I.reference}) הוא הערך הממוצע של ערכי ה- C.I. של בעלי חיים המותנים ב- 1% 1-פרופנול מימי בלבד.

תוצאות

C. elegans הותנה על ידי אימון המוני ליצירת זיכרון אסוציאטיבי מרתיע לטווח קצר על ידי זיווג 1% 1-פרופנול מימי ו- HCl (pH 4.0) כמו CS ו- US, בהתאמה. על פי הפרוטוקול שתואר לעיל, בעלי חיים מסונכרנים טופחו על ספסל ב- RT של 18 מעלות צלזיוס במשך 5 ימים ונשטפו בעדינות רבה פי 2 עם ddH₂O ב- RT של 18 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בעלי החיים היו מותנים בתערובת של 1% 1-פרופנול מימי ו- HCl (pH 4.0) במשך 1 שניות. אימנו גם בעלי חיים עם ddH₂O בלבד, 1% 1-פרופנול מימי בלבד, ו- HCl (pH 4.0) רק כהפניות. לאחר ההתניה, בעלי החיים נשטפו 1x עם ddH₂O. חזרנו על ההתניה פי 10 ללא הפרעה (ללא ITIs). התניה מוצלחת הושגה על ידי חזרה על ההליך יותר מ 7x עד 10x. התניה של יותר מפי 10 הביאה ללמידה פחות יעילה²¹. לאחר האימון, בעלי החיים נחו על מזון חיידקי במשך 10 דקות ב- RT (18 מעלות צלזיוס). לאחר שנשטפו עם ddH₂O 3x, בעלי החיים הועברו לצינור מיקרוצנטריפוגה על ידי השעיה בג'לטין מימי של 0.25% והתיישבו לתחתית על ידי כוח הכבידה. לאחר הסרת הסופר-נטנט ככל האפשר, החיות עברו החייאה עדינה בחיץ בדיקה כימוטקסיס ולאחר מכן הורשו להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח הכבידה.

לאחר הסרת כמה שיותר סופרנטנטים, ההשעיה של בעלי החיים זוהתה על המעגל המרכזי של צלחת בדיקה כימוטקסיס, אשר נשמרה ב- RT של 18 מעלות צלזיוס, ואז בעלי חיים הורשו לנוע בחופשיות על הצלחת במשך 10 דקות ב- RT של 18 מעלות צלזיוס. ערכי C.I. חושבו באמצעות המשוואה המוצגת באיור 3B. כפי שניתן לראות באיור 4A, בעלי חיים עם תערובת של 1% 1-פרופנול ו-HCl כבר לא נמשכו ל-5% 1-פרופנול שנצפו על צלחות אגר לצורך בדיקת כימוטקסיס, בעוד שבעלי חיים נאיביים ובעלי ייחוס נמשכו באופן דומה ל-5% 1-פרופנול. לאחר האימון ההמוני (שלב 3.), הזיכרון כבר לא נצפה תוך 3 שעות²⁰. יתר על כן, הזיכרון שנוצר על ידי האימון ההמוני היה רגיש להלם קר²⁰. תוצאות אלה מראות כי C. elegans הצליח ליצור STM מרתיע על ידי אימון המוני.

בעלי חיים היו מותנים גם על ידי אימון מרווח 10x עם ITI של 10 דקות בין שלבי האימון (שלב 4.). במהלך ITI, אספן עם בעלי חיים הונח על מדשאה חיידקית על צלחת 6 ס"מ NGM ב RT של 18 מעלות צלזיוס. בעלי חיים שהותנו על ידי אילוף מרווח עם תערובת של 1% 1-פרופנול מימי ו-HCl (pH 4.0) כבר לא נמשכו ל-5% 1-פרופנול בהשוואה לבעלי חיים שטופלו ב-1% 1-פרופנול בלבד, HCl (pH 4.0) בלבד, או ddH₂O בלבד (איור 4B). לאחר האימון המרווח, בעלי החיים שמרו על הזיכרון במשך יותר מ-12 שעות ^ו-20,21. יתר על כן, הזיכרון לא נוצר כאשר בעלי חיים טופלו במעכבי תרגום או שעתוק והיה עמיד בפני הלם קר^20,21. לכן, C. elegans בהצלחה יצר LTM מרתיע על ידי אימון מרווח.

בחנו גם את ההשפעות של מוטציות ב"גנים של למידה וזיכרון" על היווצרות STM ו-LTM. הגן crh-1 מקודד את גורם השעתוק cAMP-response חלבון קושר אלמנטים (CREB), glr-1 ו- nmr-1 מקודדים α-אמינו-3-הידרוקסיל-5-מתיל-4-איזוקסאזולפרופיונית (AMPA)-סוג ו-N-מתיל-D-אספרטט (NMDA)-סוג תת-יחידות קולטן גלוטמט, בהתאמה, ו stau-1 מקודד את איזופורם חלבון RNA קושר RNA דו-גדילי. גנים אלה ממלאים תפקידים חיוניים בהתניה קלאסית ב-C. elegans, Drosophila, Aplysia ועכברים. באמצעות תערובת של 1% 1-פרופנול מימי ו-HCl (pH 4.0), היווצרות STM ו-LTM הייתה תלויה בכל הגנים (איורים 5A,B).

איור 1: סכמת ניסויים של אימון המוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: סכמת ניסוי של אימון מרווח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: בדיקת כימוטקסיס ומדד כימוטקסיס . (A) ייצוג סכמטי של צלחת בדיקה כימוטקסית. צלחות פטרי (בקוטר 6 ס"מ) הופרדו לארבעה אזורים כפי שמוצג, ו-4 μL כל אחד של 5% 1-פרופנול מימי או ddH 2 O זוהו באלכסון בשני מקומות כל אחד, במרחק של₂ס"מ מהמרכז. (B) ערכי מדד כימוטקסיס חושבו מהמשוואה המוצגת על ידי ספירת מספר בעלי החיים באזורים "a" ו- "b" לאחר השלמת הכימוטקסיס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: ערכי מדד כימוטקסיס של בעלי חיים המותנים בכימיקלים. חיות בר מסונכרנות מסוג N2 הותאמו בכימיקלים שצוינו על ידי (A) אימון המוני 10x או (B) אימון מרווח 10x. תרשימי זרימה של פרוטוקולי האימון ההמוני והמרווח שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. לאחר ההתניה, החיות היו חופשיות לנוע במשך 10 דקות על צלחת אגר בגודל 6 ס"מ לבדיקת כימוטקסיס ב- RT של 18 מעלות צלזיוס. ערכי C.I. חושבו באמצעות המשוואה המוצגת באיור 3B. הנתונים לנתון זה מופיעים בטבלה משלימה 1. נתונים מהחיות התמימות שוחזרו בשני לוחות האיורים. עלילת בר מציגה את הרבעון הראשון, החציון והרבעון השלישי. כוכביות (*P < 0.05) מצביעות על הבדלים מובהקים סטטיסטית שנקבעו על ידי ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של דנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: למידת ערכי אינדקס של חיות מוטנטיות מותנות. בעלי חיים מסונכרנים מסוג N2 ובעלי חיים מוטנטיים שצוינו הותנו בתערובת של 1% 1-פרופנול מימי ו-HCl (pH 4.0) על ידי (A) אימון המוני 10x או (B) אימון מרווח 10x. תרשימי זרימה של פרוטוקולי האימון ההמוני והמרווח שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. לאחר ההתניה, החיות היו חופשיות לנוע במשך 10 דקות על צלחת אגר בגודל 6 ס"מ לבדיקת כימוטקסיס ב- RT של 18 מעלות צלזיוס. הנתונים לנתון זה מובאים בטבלה משלימה 2. עלילת בר מציגה את הרבעון הראשון, החציון והרבעון השלישי. כוכביות (*P < 0.05) מצביעות על הבדלים מובהקים סטטיסטית שנקבעו על ידי ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של דנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים 1: בעלי חיים בוגרים צעירים רגישים לטיפול כימי. יום 4 ויום 5 חיות N2 מסוג בר לאחר הבקיעה עברו הכשרה המונית של פי 10 עם HCl, pH 4.0, ללא הפרעה ולאחר מכן נבדקו עבור כימוטקסיס ל-5% 1-פרופנול מימי. ברים הם אמצעי ± S.E.M. (n = 19). כוכביות (*P < 0.05) מצביעות על הבדלים מובהקים סטטיסטית שנקבעו על ידי ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן טוקי-קרמר לאחר ההוק. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 1: נתונים המתאימים לתרשים 4. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה משלימה 2: נתונים המתאימים לתרשים 5. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

במחקר הנוכחי, כל הריאגנטים הוחזקו ב-RT של ~18 מעלות צלזיוס בממוצע, ובעלי חיים טופחו על ספסל ב-RT כדי למנוע לחץ על בעלי החיים. יתר על כן, כל הליכי הניסוי בוצעו ב- RT. בעלי חיים טופחו בתחילה באינקובטור בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הותנו על ספסל ב~ 24 מעלות צלזיוס באמצעות ריאגנטים ב- RT. בתנאים אלה, תוצאות ההתניה היו שונות מאוד. ב-RT הנמוך, C. elegans גדל לאט ויש לגדל אותו זמן רב יותר מאשר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שהחיות יגיעו לשלב הבגרות הבוגרת, שכן בעלי חיים בוגרים צעירים רגישים יותר לכימיקלים המשמשים לריכוך מאשר בעלי חיים בוגרים ועשויים להראות ערכי C.I. נמוכים יותר.

השלב הקריטי ביותר למיזוג מוצלח הוא שטיפת בעלי חיים עם ddH₂O מיד לאחר כל טיפול כימי. לכן, יש למזער את הלחץ המכני ואת הלחץ הטמפרטורות על ידי שימוש בקצוות פיפט מנוסרים, שמירה על ריאגנטים ב- RT, ושטיפה עדינה מאוד של בעלי החיים על ידי הזזה איטית מאוד של אספן החיות למעלה ולמטה ב- ddH₂O. שטיפה יסודית של בעלי החיים בכל פעם לאחר ההתניה עשויה להשפיע על הלמידה והזיכרון. גם התנאים של לוחות הבדיקה של כימוטקסיס משפיעים קשות על התוצאות. צלחות יבשות מדי או רטובות מדי מונעות תנועה חלקה של בעלי החיים. צלחות הוכנו כמתואר בשלב 1.; צלחת טובה היא אחת שעבורה 4 כתמי μL של ddH₂O או 5% 1-פרופנול מימי נספגים לחלוטין על ידי האגר בערך 5 דקות לאחר ההמראה. כפי שתואר לעיל, גם גילאי בעלי החיים קריטיים להתניה מוצלחת. בעלי חיים בוגרים צעירים רגישים לטיפול מכני וכימי, וכתוצאה מכך לתוצאות משתנות, אם כי גם בעלי חיים מבוגרים מאוד עשויים שלא להתאים להתניה.

חיי המדף של 1-פרופנול תלויים במותגים ובמגרשים והוא פחות מ-3 חודשים ב-RT. כאשר ערכי ה- C.I. של בעלי חיים תמימים מחמירים, מומלץ להשתמש ב- 1-propanol טרי לבדיקת ההתניה והכימוטקסיס.

היווצרות הזיכרון על ידי אימון המוני לא הושפעה מהטיפול בבעלי חיים עם מעכבי תרגום (ציקלוהקסמיד ואניסומיצין) ומעכב שעתוק (אקטינומיצין D), בעוד שהיווצרות הזיכרון על ידי האימון המרווח עוכבה במידה ניכרת על ידי המעכבים^20,21. יתר על כן, הזיכרון הראשון נרקב על ידי הלם קר, בעוד האחרון נשמר לתקופה ארוכה יותר מאשר הראשון והיה עמיד בפני הלם קר. תוצאות אלה מראות כי הראשון הוא STM והאחרון הוא LTM,^{בהתאמה 20,21}. עם זאת, הזיכרון שנוצר על-ידי האימון ההמוני עשוי להיות מורכב מ-STM ומזיכרון לטווח בינוני (טווח ביניים) מאחר ש-STM תלוי במידה חלשה בגורם השעתוק של CREB (איור 5A). זה עולה בקנה אחד עם התוצאה כי STM נשמר במשך יותר מ 1 שעה^20,21. היווצרותם של STM ו-LTM תלויה מאוד ב-nmr-1, המתבטא רק בשישה זוגות של נוירונים (AVA, AVD, AVE, RIM, AVG ו-PVC) ב-C. elegans^27,28. בתאי עצב אלה, אם כן, קולטני NMDA עשויים לפעול כגלאי צירוף מקרים מולקולרי של 1% אותות 1-פרופנול מימי ו-HCl (pH 4.0) לפלסטיות סינפטית, כאשר החיזוק הסינפטי הנדרש הן ל-STM והן ל-LTM יכול לנבוע מירי מקרי של נוירונים טרום-סינפטיים ואחריהם 29,30,31,32,33^. לכן, הזיכרון האסוציאטיבי המרתיע עשוי להיווצר בקרב interneurons.

השיטות המתוארות במחקר הנוכחי צריכות להיות ישימות ללמידה מעוררת תיאבון של חוש הריח ולזיכרון אסוציאטיבי לטווח קצר וארוך באמצעות 1-נונול כ- CS ואשלגן כלורי כמו ארה"ב²¹. מעניין להשוות את המעגלים העצביים המעורבים בהיווצרות זיכרונות מעוררי תיאבון ומרתיעים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 mL beaker	HARIO	B-500-H32
10 µL pipette tips	Thermo Fisher Scientific	H-104-96RS-Q
0.2 mL pipette tips	Thermo Fisher Scientific	TTW110RS-Q
1.0 mL pipette tips	Thermo Fisher Scientific	H-111-R100NS-Q
1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	0030120086
2 mL plastic tubes	Eppendorf	0030120094
10 mL Serological pipettes	As One	2-5237-04
50 mL Serological pipettes	As One	2-5237-06
6-well cell culture plate	Costar	3516
Aron Alpha (Glue for plastic)	Toagosei	High Speed EX
Autoclave	Tomy Digital Biology	SX-300
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Bottle top 0.2 µm filter units	Thermo Fisher Scientific	566-0020
Bunsen burner	EISCO	SKU CH0089A
Calcium chloride dihydrate	Nacalai Tesque	06730-15
C. elegans mutant strains	Caenorhabditis Genetics Center
Cholesterol	Wako Pure Chemical Industries	034-03002
Clear acrylic cylindrical pipe	Asahi Kasei		3.5 cm (length), 30 mm (external diameter), 2 mm (thickness)
Crystallizing dish	Pyrex	3140-80
Dental burner	Phoenix-Dent	APT-3
Di-potassium hydrogen phosphate	Nacalai Tesque	28726-05
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Electric pipetter	Drummond Scientific	4-000-101
Gelatin	Wako Pure Chemical Industries	073-06295
Glass Petri dishes (10 cm in diameter)	As One	Trade FLAT Mark
Heating magnetic stirrer	Thermo Fisher Scientific	SP131324
Hydrochloric acid	Nacalai Tesque	37345-15
Incubator	SANYO	MIR-553
Kimwipes S-200	Nippon Paper Crecia	62011
Laboratory coat	TOYO LINT FREE	FH240C
Magnesium sulfate heptahydrate	Nacalai Tesque	21002-85
Magnetic stirrer bar	SANSYO	93-5412
Metal spatula	FUJIFILM Wako	647-06531
Nitrile gloves	Kimberly-Clark	KC100
Nylon mesh (mesh size: 30 μm)	SEFAR	NY30-HD
P10 pipetman	Gilson	F144802
P200 pipetman	Gilson	F123600
P1000 pipetman	Gilson	F123602
pH meter	HORIBA	Navi F-52
Plastic Petri dishes (9 cm in diameter)	IWAKI	SH90-15E
Plastic Petri dishes (6 cm in diameter)	SARSTEDT	82.1194.500
Plastic weighing boats	As One	1-5233-01
Platinum wire for a worm pick	Nilaco	PT-351265
1-Propanol	SIGMA-ALDRICH	279544
Potassium dihydrogen phosphate	Nacalai Tesque	28721-55
Safety goggles	Kimberly-Clark	#25646
Sodium chloride	Nacalai Tesque	31320-05
Stereomicroscope	Olympus	SZX16
Tooth picks
Water purification sysytem	Merck	Elix Essential 10 UV
Water urification sysytem	Merck	Milli-Q Synthesis A10
Weighing balance	METTLER	TOREDO
Wild type C. elegans strain N2	Caenorhabditis Genetics Center