Zygote mikroinjeksjon for å lage genkassett-, inn- og floxalleler hos mus

CRISPR-Cas-teknologien har muliggjort rask og uanstrengt generering av genmodifiserte mus. Spesielt produseres mus og punktmutante mus lett ved elektroporering av CRISPR-faktorer (og enkeltstrengede oligo DNA-donorer) i zygoten. I motsetning til dette genereres genkassett (>1 kb) innslag og floxede mus hovedsakelig ved mikroinjeksjon av CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer til zygoter. Genomredigeringsteknologier har også økt fleksibiliteten til genmodifisert musproduksjon. Det er nå mulig å introdusere de tiltenkte mutasjonene i målgenomiske regioner i en rekke gunstige innavlede musestammer. Vårt team har produsert over 200 genkassett knock-in muselinjer, og over 110 floxed muselinjer ved zygote mikroinjeksjon av CRISPR-Cas9 etter forespørsler fra flere land, inkludert Japan. Noen av disse genomredigeringene brukte BALB/c, C3H/HeJ og C57BL/6N innavlede stammer, men de fleste brukte C57BL/6J. I motsetning til elektroporasjonsmetoden er genomredigering ved zygotemikroinjeksjon i forskjellige innavlede stammer av mus ikke så lett. Imidlertid er genkassett-knock-in og floxed mus på enkelt innavlet genetisk bakgrunn like kritisk som genetisk humanisert, fluorescerende reporter og betingede knockout-musemodeller. Derfor presenterer denne artikkelen protokollen for zygote mikroinjeksjon av CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer i C57BL/6J-mus for generering av genkassett-innslag og floxede mus. Denne artikkelen fokuserer utelukkende på kjernefysisk injeksjon i stedet for cytoplasmatisk injeksjon. I tillegg til zygote mikroinjeksjon, skisserer vi tidslinjen for produksjonsprosessen og perifere teknikker som induksjon av superovulasjon og embryooverføring.