Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Описан метод, сочетающий иммуномагнитные шарики и флуоресцентно-активированную сортировку клеток для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток мононуклеарных клеток периферической крови (моноцитов, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и естественных клеток-киллеров). С помощью этого метода магнитные и флуоресцентно меченые клетки могут быть очищены и проанализированы.

Abstract

Инфекционный мононуклеоз (IM) является острым синдромом, в основном связанным с первичной инфекцией вируса Эпштейна-Барра (EBV). Основные клинические симптомы включают нерегулярную лихорадку, лимфаденопатию и значительное повышение лимфоцитов в периферической крови. Патогенный механизм ИМ до сих пор неясен; для него не существует эффективного метода лечения, в основном доступна симптоматическая терапия. Основной вопрос в иммунобиологии ВЭБ заключается в том, почему только у небольшой подгруппы инфицированных людей проявляются тяжелые клинические симптомы и даже развиваются злокачественные новообразования, связанные с ВЭБ, в то время как большинство людей бессимптомны на всю жизнь с вирусом.

В-клетки впервые участвуют в IM, потому что рецепторы EBV представлены на их поверхности. Естественные клетки-киллеры (NK) являются цитотоксическими врожденными лимфоцитами, которые важны для уничтожения клеток, инфицированных EBV. Доля CD4 + Т-клеток уменьшается, в то время как доля CD8 + Т-клеток резко расширяется во время острой инфекции EBV, и персистенция CD8 + Т-клеток важна для пожизненного контроля IM. Эти иммунные клетки играют важную роль в IM, и их функции должны быть идентифицированы отдельно. Для этого моноциты отделяют сначала от мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) им-особей с помощью микрошариков CD14, колонки и магнитного сепаратора.

Остальные PBMCs окрашивают перидинин-хлорофилл-белком (PerCP)/цианином 5.5 анти-CD3, аллофикоцианином (APC)/цианином 7 анти-CD4, фикоэритрином (PE) анти-CD8, флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) анти-CD19, APC анти-CD56 и APC анти-CD16 антителами для сортировки CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и NK-клеток с использованием проточного цитометра. Кроме того, было проведено секвенирование транскриптома пяти субпопуляций для изучения их функций и патогенных механизмов в IM.

Introduction

Вирус Эпштейна-Барра (EBV), γ-герпесвирус, также известный как вирус герпеса человека типа 4, повсеместно распространен в человеческой популяции и устанавливает пожизненную латентную инфекцию у более чем 90% взрослого населения1. Большинство первичных инфекций ВЭБ происходит в детском и подростковом возрасте, причем у части пациентов проявляется инфекционный мононуклеоз (IM)2, демонстрируя характерную иммунопатологию, включая активированный иммунный ответ с CD8 + Т-клетками в крови и преходящую пролиферацию инфицированных ВЭБ В клеток в ротоглотке3. Курс ВМ может длиться 2–6 недель и бо....

Protocol

Образцы крови были получены у пациентов с ВМ (n = 3), здоровых носителей ВЭБ (n = 3) и детей, не инфицированных ВЭБ (n = 3). Добровольцы были набраны из Пекинской детской больницы, Столичного медицинского университета, и все исследования были этически одобрены. Этическое одобрение было получено .......

Representative Results

Ссылка на стратегию гатинга
Стратегия гатинга, используемая для сортировки четырех субпопуляций лимфоцитов, показана на рисунке 1. Вкратце, лимфоциты выбираются (P1) на точечном графике, показывающем гранулированность (SSC-A) по сравнению с размером (FSC-A). Затем в?.......

Discussion

Этот протокол представляет собой эффективный способ сортировки субпопуляций иммунных клеток периферической крови. В этом исследовании образцы венозной крови пациентов с ВМ, здоровых носителей ВЭБ и детей, не инфицированных ВЭБ, были выбраны в качестве цели исследования. Эта работа с ?.......

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82002130), Пекинским фондом естественных наук (7222059) и Инновационным фондом медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-026).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
APC anti-human CD16Biolegend302012Fluorescent antibody 
APC anti-human CD56 (NCAM)Biolegend362504Fluorescent antibody 
APC/Cyanine7 anti-human CD4Biolegend344616Fluorescent antibody 
Automated cell counterBIO RADTC20Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II)Becton, Dickinson and Company644832Cell sort
CD14 MicroBeads, humanMiltenyi Biotec130-050-201microbeads
Cell ctng slidesBIO RAD1450016Cell count
Centrifuge tubesFalcon3520971515 mL centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium)BeyotimeST1303EDTA
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubesBecton, Dickinson and Company 367862 EDTA anticoagulant tubes
FITC anti-human CD19Biolegend302206Fluorescent antibody 
Gibco Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific16000-044Fetal Bovine Serum
 High-speed centrifugeSigma 3K15Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
 High-speed centrifugeEppendorf5424RCell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation mediumDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque
LS Separation columnsMiltenyi Biotec130-042-401Separation columns
Microcentrifuge tubesAxygenMCT-150-C1.5 mL microcentrifuge tube
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302Magnetic bead separator
PE anti-human CD8Biolegend344706Fluorescent antibody 
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3Biolegend344808Fluorescent antibody 
Phosphate Buffered Saline (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Polystyrene round bottom tubesFalcon3522355 mL tube for FACS flow cytometer
TRIzol reagentAmbion15596024Lyse cells for RNA extraction
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay KitBeyotimeC0011Trypan Blue Staining

References

  1. Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
  2. Bu, W., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187EBVIMFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved