A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Описан метод, сочетающий иммуномагнитные шарики и флуоресцентно-активированную сортировку клеток для выделения и анализа определенных субпопуляций иммунных клеток мононуклеарных клеток периферической крови (моноцитов, CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и естественных клеток-киллеров). С помощью этого метода магнитные и флуоресцентно меченые клетки могут быть очищены и проанализированы.
Инфекционный мононуклеоз (IM) является острым синдромом, в основном связанным с первичной инфекцией вируса Эпштейна-Барра (EBV). Основные клинические симптомы включают нерегулярную лихорадку, лимфаденопатию и значительное повышение лимфоцитов в периферической крови. Патогенный механизм ИМ до сих пор неясен; для него не существует эффективного метода лечения, в основном доступна симптоматическая терапия. Основной вопрос в иммунобиологии ВЭБ заключается в том, почему только у небольшой подгруппы инфицированных людей проявляются тяжелые клинические симптомы и даже развиваются злокачественные новообразования, связанные с ВЭБ, в то время как большинство людей бессимптомны на всю жизнь с вирусом.
В-клетки впервые участвуют в IM, потому что рецепторы EBV представлены на их поверхности. Естественные клетки-киллеры (NK) являются цитотоксическими врожденными лимфоцитами, которые важны для уничтожения клеток, инфицированных EBV. Доля CD4 + Т-клеток уменьшается, в то время как доля CD8 + Т-клеток резко расширяется во время острой инфекции EBV, и персистенция CD8 + Т-клеток важна для пожизненного контроля IM. Эти иммунные клетки играют важную роль в IM, и их функции должны быть идентифицированы отдельно. Для этого моноциты отделяют сначала от мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) им-особей с помощью микрошариков CD14, колонки и магнитного сепаратора.
Остальные PBMCs окрашивают перидинин-хлорофилл-белком (PerCP)/цианином 5.5 анти-CD3, аллофикоцианином (APC)/цианином 7 анти-CD4, фикоэритрином (PE) анти-CD8, флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) анти-CD19, APC анти-CD56 и APC анти-CD16 антителами для сортировки CD4+ Т-клеток, CD8+ Т-клеток, В-клеток и NK-клеток с использованием проточного цитометра. Кроме того, было проведено секвенирование транскриптома пяти субпопуляций для изучения их функций и патогенных механизмов в IM.
Вирус Эпштейна-Барра (EBV), γ-герпесвирус, также известный как вирус герпеса человека типа 4, повсеместно распространен в человеческой популяции и устанавливает пожизненную латентную инфекцию у более чем 90% взрослого населения1. Большинство первичных инфекций ВЭБ происходит в детском и подростковом возрасте, причем у части пациентов проявляется инфекционный мононуклеоз (IM)2, демонстрируя характерную иммунопатологию, включая активированный иммунный ответ с CD8 + Т-клетками в крови и преходящую пролиферацию инфицированных ВЭБ В клеток в ротоглотке3. Курс ВМ может длиться 2–6 недель и бо....
Образцы крови были получены у пациентов с ВМ (n = 3), здоровых носителей ВЭБ (n = 3) и детей, не инфицированных ВЭБ (n = 3). Добровольцы были набраны из Пекинской детской больницы, Столичного медицинского университета, и все исследования были этически одобрены. Этическое одобрение было получено .......
Ссылка на стратегию гатинга
Стратегия гатинга, используемая для сортировки четырех субпопуляций лимфоцитов, показана на рисунке 1. Вкратце, лимфоциты выбираются (P1) на точечном графике, показывающем гранулированность (SSC-A) по сравнению с размером (FSC-A). Затем в?.......
Этот протокол представляет собой эффективный способ сортировки субпопуляций иммунных клеток периферической крови. В этом исследовании образцы венозной крови пациентов с ВМ, здоровых носителей ВЭБ и детей, не инфицированных ВЭБ, были выбраны в качестве цели исследования. Эта работа с ?.......
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82002130), Пекинским фондом естественных наук (7222059) и Инновационным фондом медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-026).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved