אנו מודים לחברי המעבדה של סאנצ'ז-גורמצ'י וואלאס על דיונים חשובים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מאיגוד הלב האמריקאי (18CDA34080527 ל- JSG ו- 19POST34380545 ל- RM), NIH (R21OD031907 ל- JSG), פרס נאמן CCHMC, פרס מרכז CCHMC לגנומיקה של ילדים, ופרס מרכז CCHMC לגנומיקה מנדליאנית וטיפול. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH P30 DK078392 של מרכז הליבה לחקר מחלות עיכול בסינסינטי. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. RT ו- MW נתמכו על ידי מלגת UCD Ad Astra.

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי.
1. הכנת D2O
הערה: כדי להימנע משינויים ניסיוניים, הכינו תמיסה/מי שתייה מספיקים לכל העכברים למשך הניסוי.
<ol><li>להזרקה תוך צפקית: יש לייצר 0....

הבנת האיזון והאינטראקציה בין מסלולים מטבוליים מורכבים היא צעד הכרחי לקראת הבנת הבסיס הביולוגי של מחלות הקשורות לחילוף חומרים. כאן, אנו מראים מתודולוגיה לא פולשנית וזולה כדי לקבוע שינויים בסינתזת חומצות שומן דה נובו. שיטה זו מבוססת על שיטות שפורסמו בעבר אשר פיתחו חישובים להערכת שטף ס...

השמנת יתר ומחלות מטבוליות נלוות הן מגיפה המסכנת את הדורות הנוכחיים והעתידיים 1,2. בדרך כלל מפושט כתוצאה של חוסר איזון בין צריכת אנרגיה והוצאה, חוסר הוויסות המטבולי הקשור להשמנת יתר משפיע על מספר רב של מסלולים מטבוליים הנשלטים על ידי גורמים סביבתיים אנדוגניים3. עם זאת, רק מסלולים מעטים נבדקים באופן שגרתי במודלים של בעלי חיים של חוסר ויסות מטבולי.
לדוגמה, סילוק גלוקוז נמדד באופן שגרתי על ידי בדיקות גלוקוז וסבילות לאינסולין, כנראה בשל פשטות השימוש במוניטורים ניידיםלגלוקוז 4. שיעורים יחסיים של גלוקוז וחמצון שומנים בכל הגוף נאמדים גם הם באופן שגרתי בהתבסס על יחס חילופי הנשימה ממבחני קלוריות עקיפים 5,6. עם זאת, רוב ההיבטים האחרים של חילוף החומרים אינם מוערכים באופן שגרתי. זה מוביל לפרשנויות חלקיות של המצב המטבולי ואפשרויות טיפוליות שהוחמצו. אחד המסלולים העיקריים מסוג זה הוא דה נובו ליפוגנזיס.
De novo lipogenesis (DNL) הוא התהליך שבו חומצות שומן חדשות נוצרות ממבשרים. גלוקוז נחשב לקודמן העיקרי התורם ל- DNL7 של כל הגוף, אולם מבשרים אחרים, כגון אצטט, פרוקטוז, לקטט וחומצות אמינו מסועפות שרשרת, הוכחו כמקורות פחמן רלוונטיים באופן מרחבי ותלוי מצב 8,9,10,11,12. DNL הוא תורם מרכזי להומאוסטזיס מטבולי והוא חיוני להתפתחות תקינה13. בנוסף, שינויים ב- DNL נקשרו לסרטן 14,15 ומטבולית 16,17,18 ומחלות לב וכלי דם 19,20.
מסלול DNL מורכב מרכיבי הליבה האנזימטיים ATP ציטראט ליאז (ACLY), אצטיל-CoA קרבוקסילאז (ACC1/2) וחומצת שומן סינתאז (FAS) המייצרים בעיקר פלמיטט, חומצת שומן רוויה בת 16 פחמן. עם זאת, ניתן לייצר גם חומצות שומן מוזרות ומסועפות שרשרת בשיעורים נמוכים יותר9. Elongases ו desaturases לשנות עוד יותר חומצות שומן אלה, יצירת מגוון רחב של מיני חומצות שומן שימושי עבור מגוון רחב של פונקציות (למשל, אחסון אנרגיה לטווח ארוך מניפולציה של נזילות הממברנה).
הביטוי של המנגנון האנזימטי DNL נשלט על ידי מספר קצר של גורמי שעתוק. המתוארים ביותר עד כה כוללים את משפחת החלבון קושר אלמנט רגולטורי סטרול (SREBP), חלבון קושר אלמנט תגובת פחמימות (ChREBP), וקולטן X בכבד (LXR) 21,22,23,24,25,26. למרות חפיפה לכאורה בתפקודם, דווח על תקנות אינדיבידואליות המבוססות על דומיננטיות סוג התא ומצבים פיזיולוגיים או פתולוגיים 21,22,27,28.
למרבה הפלא, מספר מעכבים לשלבים נבחרים של מסלול DNL אושרו לשימוש קליני או נמצאים בשלבי פיתוח פרה-קליניים או קליניים עבור מספר מחלות, כולל השמנת יתר, מחלת כבד שומני לא אלכוהולי/סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NAFLD/NASH), ומחלות לב וכלי דם29. מאמצים אלה מדגישים את הרלוונטיות של DNL בבריאות ובמחלות.
בשנים האחרונות, השימוש בשיטות להערכה כמותית של סינתזת חומצות שומן דה נובו גדל30. השיטה הנפוצה ביותר להערכה זו היא שימוש במים מסומנים כבדים (D2O), כאשר המימן המסומן הכבד משולב בשרשראות אציל במהלך הסינתזה הן באופן ישיר והן בעקיפין, באמצעות חילופי דאוטריום עם המימן של מצעי DNL NAPDH, אצטיל-CoA ומלוניל-CoA. למרות שגישה זו צוברת פופולריות, חסרים פרוטוקולים מפורטים הזמינים לציבור המתאימים למצטרפים חדשים בתחום. כאן, אנו מתארים שיטה להערכה כמותית של סינתזת דה נובו של מוצרים של FAS באמצעות D2O וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז (GCMS), עם חישובים שפותחו בעבר על ידי Lee et al.31. שיטה זו מודדת סינתזת חומצות שומן דה נובו ללא תלות במקור פחמן, והיא עשויה להיות שימושית כמעט לכל רקמה, בכל מודל עכבר, ותחת כל הפרעה חיצונית. כאן, אנו מתמקדים בניתוח של רקמת שומן חום (BAT) בשל רמות גבוהות של DNL ותפקידים קריטיים בשמירה על הומאוסטזיס מטבולי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 mL Glass Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needeled syringes</td>
			<td>BD</td>
			<td>309597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Merck</td>
			<td>900667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue GC screw cap with septa</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-1599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>151882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B1378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) 
			Select FAME Column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>CP7419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>411395105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>51976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecenoic-d31 Acid</td>
			<td>Larodan</td>
			<td>71-1631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Olympus Plastic</td>
			<td>24-282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse environmental chamber</td>
			<td>Caron</td>
			<td>Caron 7001-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potasium Phosphate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafeLock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw top amber GC vial</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5182-0716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, dibasic</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP332-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial insert</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5183-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative determination of de novo fatty acid synthesis in brown adipose tissue using deuterium oxide

סינתזת חומצות שומן היא מסלול מטבולי מורכב ועתיר אנרגיה עם תפקידים תפקודיים חשובים בשליטה על הומאוסטזיס מטבולי של כל הגוף ותהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים אחרים. בניגוד למסלולים מטבוליים מרכזיים אחרים, כגון סילוק גלוקוז, סינתזת חומצות שומן אינה מוערכת באופן פונקציונלי באופן שגרתי, מה שמוביל לפרשנויות חלקיות של המצב המטבולי. בנוסף, קיים מחסור בפרוטוקולים מפורטים הזמינים לציבור המתאימים למצטרפים חדשים בתחום. במאמר זה אנו מתארים שיטה כמותית זולה המשתמשת בתחמוצת דאוטריום ובספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז (GCMS) לניתוח סינתזת חומצת השומן הכוללת דה נובו ברקמת שומן חומה in vivo. שיטה זו מודדת את הסינתזה של תוצרי חומצת השומן סינתאז ללא תלות במקור פחמן, והיא עשויה להיות שימושית כמעט לכל רקמה, בכל מודל עכברי, ותחת כל הפרעה חיצונית. פרטים על הכנת המדגם עבור GCMS וחישובים במורד הזרם מסופקים. אנו מתמקדים בניתוח של שומן חום בשל רמות גבוהות של סינתזת חומצות שומן דה נובו ותפקידים קריטיים בשמירה על הומאוסטזיס מטבולי.

בהתבסס על מינון D 2 O המתואר בשלב 1, אנו מוצאים בדרך כלל שמי הגוף מועשרים בטווח של2.5% עד 6%, וכי רמה בסיסית של העשרת דאוטריום במי הגוף מושגת במהירות תוך שעה אחת ונשמרת למשך המחקר באמצעות מי שתייה מועשרים של 8% (איור 1). העשרת מי גוף במצב יציב רציף היא הנחה של החישובים המשמ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide at JoVE.com

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

כאן, אנו מציגים שיטה כמותית זולה המשתמשת תחמוצת דאוטריום וספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז (GCMS) לניתוח של חומצת שומן כוללת דה נובו ליפוגנזה ברקמת שומן חום in vivo.

קביעה כמותית של סינתזת חומצות שומן דה נובו ברקמת שומן חומה באמצעות תחמוצת דאוטריום

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

בניגוד למסלולים מטבוליים אחרים כמו סילוק גלוקוז, סינתזת חומצות שומן אינה מוערכת באופן שגרתי, מה שמוביל לפרשנויות חלקיות של המצב המטבולי. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם שהיא יחסית לא פולשנית, וסביר להניח שהיא משקפת טוב יותר את שטף סינתזת חומצות השומן מאשר שימוש בגלוקוז המסומן באיזוטופים, שבו שינויים בטיפול בגלוקוז במעלה הזרם יכולים להשפיע על התוצאות. כאן, אנו מתמקדים ברקמת שומן חומה, אך שיטה זו עשויה להיות שימושית לחקר כל רקמה בכל מודל עכבר.כדי להתחיל, הניחו את הדגימות על קרח יבש. קחו צינור מיקרוצנטריפוגה מסומן מראש, הניחו אותו על איזון אנליטי וטפחו על האיזון. לאחר מכן הניחו פינצטה ואזמל או סכין גילוח מפלדה על קרח יבש למשך 10 עד 20 שניות להתקרר.השתמשו בפינצטה כדי להוציא את דגימת הרקמה הקפואה מהצינור והניחו אותה על סירת משקל מפלסטיק, אותה ניתן למקם על גוש שטוח של קרח יבש או משטח אחר מקורר מראש. באמצעות אזמל או סכין גילוח פלדה, לנתח חלק קטן של הרקמה שווה ערך 5 עד 15 מיליגרם במשקל, ומניחים אותו בתוך צינור microcentrifuge. רשום את המשקל המדויק וחזור על הפעולה עבור כל דגימה.הוסף מיקרוליטר אחד למיליגרם של 10 מילימולרית חומצה הקסדקאנואית D31, ואחריו שלושה חרוזי נירוסטה חמישה מ"מ לכל דגימה. לאחר מכן הוסיפו 250 מיקרוליטר מתנול, 250 מיקרוליטר מים ו-500 מיקרוליטר כלורופורם לכל דגימה עם חרוזים. מניחים את הצינורות בגוש מקורר מראש של טחנת טחינה ומערבבים את הדגימות בתדר רטט של 25 הרץ במשך חמש דקות.הסר את החרוזים באמצעות מגנט וצנטריפוגה את הדגימות ב 12, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרופיפטה, לקחת נפח קבוע של השלב התחתון של כל דגימה לתוך צינורות microcentrifuge מסומן בהתאם. הוסף 500 מיקרוליטר כלורופורם לדגימה הנותרת וחזור על שלבים אלה.הניחו את הצינורות עם הפאזה התחתונה המשולבת תחת גז חנקן או בוואקום צנטריפוגלי מקורר עמיד לכלורופורם בארבע מעלות צלזיוס עד לייבוש מוחלט. פיפטה 98 מיליליטר מתנול נטול מים לתוך בקבוק מדיה זכוכית. ולהוסיף לאט שני מיליליטר של חומצה גופרתית נטולת מים במכסה האדים כדי לייצר 2% חומצה גופרתית מתנול.מערבבים על ידי ערבול הבקבוק הסגור. הוסף 500 מיקרוליטר של חומצה גופרתית זו 2% בתמיסת מתנול לכל דגימה ומערבולת לזמן קצר. לדגור את הדגימות על בלוק החום ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולהוסיף 100 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלורי רווי ו 500 מיקרוליטר של הקסאן לכל דגימה.מערבבים את הדגימות במרץ בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת ומשאירים את הדגימות לשבת דקה אחת. שני השלבים צריכים להיות ברורים לאחר מכן. אספו את השלב העליון לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה טרי.לאחר מכן חזור על תוספת הקסאן. ולאחר הפרדת פאזה, לאסוף את דגימות השלב העליון השני לתוך אותן צינורות מסומנים. יבשו את הדגימות בטמפרטורת החדר תחת גז חנקן והשהו מחדש את הדגימות ב-20 מיקרוליטר הקסאן למיליגרם ממשקל הרקמה המקורי.מעבירים את הדגימות מיד לבקבוקון כרומטוגרפיית גז זכוכית עם תוספת זכוכית. הזריקו את הדגימות לתוך ספקטרומטר מסות כרומטוגרפיית גז מרובע יחיד כדי לקבוע את שפע אסטרי המתיל של חומצות שומן או איזוטופולוגים של FAME. הזריקו מיקרוליטר אחד של דגימה לכניסה מפוצלת או מפוצלת בטמפרטורת כניסה של 270 מעלות צלזיוס באמצעות הליום כגז המוביל.בצינורות מיקרוצנטריפוגות עם נעילה בטוחה, יש לשלב 10 מיקרוליטר מכל דגימת פלזמה או ארבעה מיקרוליטרים סטנדרטיים של 10 נתרן הידרוקסידי מולארי וארבעה מיקרוליטרים של 5% אצטון באצטוניטריל. בצע זאת בשלשה עבור כל דגימה. לאחר הדגירה על הדגימות במשך הלילה בטמפרטורת החדר, מוסיפים 450 עד 550 מיליגרם נתרן גופרתי לכל דגימה, מוסיפים 600 מיקרוליטר כלורופורם לכל צינור במכסה האדים, ומערבלים במרץ במשך 15 שניות.צנטריפוגה את הדגימות ב 300 G במשך שתי דקות. קח בקבוקוני GCMS זכוכית מסומנים עם תוספות זכוכית ולהעביר את הטריפליקט ולאחר מכן 80 מיקרוליטר aliquots של supernatant מכל דגימה לבקבוקונים. מכסים את הבקבוקונים בחוזקה לניתוח GCMS.אחוז העשרת D2O בפלזמה של עכברים על פני נקודות זמן מרובות מוצג כאן. נמצא כי מי הגוף מועשרים בטווח של 2.5 עד 6%, כי רמה בסיסית של העשרת דאוטריום במי הגוף מושגת במהירות תוך שעה אחת ונשמרת למשך המחקר. התפלגות איזוטופולוג המסה של פלמיטט ברקמת שומן חום לאחר שלושה ימים של מתן D2O בטמפרטורת החדר ובתרמו-נייטרליות מוצגת כאן.תוצאה זו מראה העשרה גבוהה יותר של M1 ו-M2 בדאוטריום בטמפרטורת החדר. באיור זה מוצגים העשרה מולרית של רקמת שומן חומה והעשרה מולרית פלזמה של מגוון חומצות שומן לאחר שלושה ימים של מתן D2O בטמפרטורת החדר ובתרמו-ניטרליות. העשרת הטמפרטורה הקרה יותר נמצאה במגוון רחב של חומצות שומן ברקמת השומן החומה.יש לציין כי העשרת חומצות השומן הכוללת בפלזמה אינה עוקבת אחר אותה מגמה כמו רקמת שומן חומה, אלא במקום זאת, העשרת חומצות שומן מוגברת עם ניטרליות תרמית. תמונות אלה מייצגות את השפע הכולל ואת הפלמיטט המסונתז דה נובו ברקמת שומן חומה לאחר שלושה ימים של מתן D2O. התוצאה מראה עלייה בסינתזה הכוללת של פלמיטט בטמפרטורת החדר.היזהר בעת הפעלת חומצות שומן על GCMS. יש לוודא שהפלמיטט אינו עמוס יתר על המידה, שכן הוא רק יכול לתת ערכי העשרת איזוטופים גבוהים באופן מלאכותי. בנוסף, בעת ניתוח אצטון ב- GCMS, ודא שאין שיא אצטון ברקע לפני הפעלת הדגימות, לכן הפעל ריקים כדי להסיר אצטון כלשהו במערכת.שיטה זו בוחנת את סך חומצות השומן על פני קבוצות שומנים מרובות, אך אם ברצונך להבין כיצד סינתזת חומצות שומן משפיעה על קבוצות שומנים ספציפיות, תחילה תוכל להפריד בין מחלקות שומנים אלה באמצעות כרומטוגרפיה ולאחר מכן לחלץ חומצות שומן משברים אלה. מכיוון שליפוגנזה היא תורמת מרכזית להתפתחות תקינה, אך גם למחלות רבות, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי בתחומים רבים.

קביעה כמותית של סינתזת חומצות שומן דה נובו ברקמת שומן חומה באמצעות תחמוצת דאוטריום

Abstract