Nous remercions le Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) et le Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) de l’Université technologique de Nanyang (NTU) pour leur soutien à la fabrication de nanostructures et à l’imagerie SEM, la plate-forme de production de protéines (PPP) de l’École des sciences biologiques NTU pour la purification des protéines et l’École de génie chimique et biomédical NTU pour le microscope confocal. Ce travail est financé par le ministère de l’Éducation de Singapour (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 et MOE-T2EP30220-0009), l’Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) soutenu par un financement du MOE dans le cadre du programme Research Centres of Excellence (W. Zhao), la Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), la NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU pour la bourse de recherche (X. Miao), et China Scholarship Council pour la bourse de recherche (J. Wu).

1. Nettoyage de la nanopuce
<ol><li>Placez la nanopuce dans un bécher de 10 mL avec le côté à motifs vers le haut. REMARQUE: Cette nanopuce de quartz a été fabriquée par lithographie par faisceau d’électrons comme décrit précédemment21. La géométrie et la disposition de la nanostructure sur la puce peuvent être conçues sur mesure. Les tailles des nanobarres de gradient utilisées ici sont de 2000 nm de longueur, 600 nm de hauteur et 100 à 1000 nm de...

<ol>
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</ol>

Le système nanobar-SLB décrit ici offre une combinaison unique des avantages de plusieurs tests in vitro existants. Il révèle efficacement la liaison préférentielle des protéines aux membranes très incurvées comme le test de flottaison ou de sédimentation des liposomes, mais nécessite beaucoup moins d’échantillons et offre une courbure plus précisément définie sur des nanobarres individuelles 8,29. Il offre également une large gamme de ...

La courbure membranaire est un paramètre physique critique d’une cellule qui se produit dans une variété de processus cellulaires tels que la morphogenèse, la division cellulaire et la migration cellulaire1. Il est maintenant largement reconnu que la courbure de la membrane est au-delà d’un simple résultat d’événements cellulaires; Au lieu de cela, il est apparu comme un régulateur efficace des interactions protéiques et de la signalisation intracellulaire. Par exemple, plusieurs protéines impliquées dans l’endocytose médiée par la clathrine se lient préférentiellement à la membrane incurvée, entraînant la formation d’un point chaud pour l’endocytose2. Il existe de nombreuses causes différentes de déformation membranaire telles que l’attraction de la membrane par les forces du cytosquelette, la présence d’asymétrie lipidique avec des groupes de tête de différentes tailles, l’existence de protéines transmembranaires de forme conique, l’accumulation de protéines de formation de la membrane comme les protéines du domaine BAR (nommées d’après les protéines Bin, amphiphysine et Rvs), et l’insertion du domaine des hélices amphipathiques dans la membrane1 . Fait intéressant, ces protéines et lipides non seulement déforment la membrane, mais peuvent également détecter la courbure de la membrane et présenter une accumulation préférentielle1. Par conséquent, il est crucial d’étudier si et comment des membranes avec des courbures différentes modifient la distribution et la dynamique des protéines et des lipides qui leur sont attachés et les impacts potentiels sur les processus intracellulaires connexes.
De nombreuses techniques ont été développées pour analyser l’interaction entre la membrane incurvée et les protéines dans les cellules vivantes et les systèmes in vitro. Le système cellulaire vivant fournit un environnement cellulaire réel avec une riche diversité lipidique et une régulation dynamique de la signalisation des protéines 2,3,4,5,6,7. Cependant, un système aussi sophistiqué est difficile à étudier en raison des incertitudes et des fluctuations de l’environnement intracellulaire. Par conséquent, les essais in vitro utilisant une membrane artificielle composée d’espèces lipidiques connues et de protéines purifiées sont devenus de puissants systèmes de reconstitution pour caractériser la relation entre les protéines et les membranes courbes. Traditionnellement, des liposomes de différents diamètres sont générés par extrusion pour détecter les protéines sensibles à la courbure via soit un test de co-sédimentation utilisant la force centrifuge, soit un test de co-flottation avec un gradient de densité pour éviter l’agrégation des protéines 8,9. Cependant, la courbure des liposomes extrudés est limitée par la taille des pores disponibles du filtre à membrane utilisé dans l’extrudeuse10. Il a été prouvé que le test de courbure mono-liposomique (SLiC) surmonte cette limitation, dans lequel des liposomes de différents diamètres sont marqués par fluorescence et immobilisés sur la surface afin que la courbure puisse être marquée par l’intensité fluorescente11. Cependant, une forte variabilité de la composition lipidique a été observée dans les petites vésicules, ce qui affecte la précision de la mesure de la courbure12. Les expériences de traction d’attache fournissent une mesure plus précise de la courbure sur l’attache transitoire tirée des vésicules unilamellaires géantes (GUV) à l’aide d’une pince optique, où la courbure peut être bien contrôlée par la tension membranaire générée13,14. Cette méthode convient à l’étude des protéines de détection de courbure positive ou négative, mais elle est limitée par le débit de la génération de tubes10. Le test des tubes à membrane supportée (SMrT) permet la génération simultanée de plusieurs tubes à membrane qui sont extrudés à partir du même réservoir lipidique par des écoulements microfluidiques. Néanmoins, la courbure de la membrane varie intrinsèquement le long du nanotube, ce qui compromet la précision de la mesure de la courbure basée sur l’intensité de fluorescence15,16. En comparaison, l’utilisation de petites vésicules unilamellaires (VUS, diamètre <100 nm17) pour former une bicouche lipidique supportée (SLB) sur des surfaces contenant des topographies conçues a généré une membrane bicouche unique avec des courbures prédéterminées par nanofabrication ou nanomatériaux de haute précision18,19,20.
Ici, nous présentons un protocole pour la formation du SLB sur des surfaces de nanopuces fabriquées avec des réseaux nanobar et comment il peut être utilisé pour sonder la sensibilité à la courbure des protéines in vitro. Comme le montre la figure 1, le test comporte six composants essentiels : A) Nettoyage et assemblage de la puce avec une chambre microfluidique; B) Préparation de VUS avec une composition lipidique définie; C) Formation du SLB sur une nanopuce et liaison avec des protéines sensibles à la courbure; D) Imagerie et caractérisation des protéines sensibles au SLB et à la courbure sous microscopie à fluorescence; E) Nettoyage de la puce pour la réutiliser; F) Traitement d’images pour l’analyse quantitative de la capacité de détection de la courbure des protéines. Le protocole détaillé est décrit étape par étape ci-dessous.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

La courbure de la membrane joue un rôle important dans divers processus essentiels des cellules, tels que la migration cellulaire, la division cellulaire et le trafic des vésicules. Il n’est pas seulement généré passivement par les activités cellulaires, mais régule également activement les interactions protéiques et est impliqué dans de nombreuses signaux intracellulaires. Ainsi, il est très utile d’examiner le rôle de la courbure de la membrane dans la régulation de la distribution et de la dynamique des protéines et des lipides. Récemment, de nombreuses techniques ont été développées pour étudier la relation entre la membrane courbe et la protéine in vitro. Par rapport aux techniques traditionnelles, la bicouche lipidique (SLB) nouvellement développée offre à la fois un débit élevé et une meilleure précision dans la génération de courbure de la membrane en formant une bicouche lipidique continue sur des réseaux à motifs de nanobarres avec une courbure membranaire prédéfinie et un contrôle plat local. La fluidité lipidique et la sensibilité des protéines aux membranes courbes peuvent être caractérisées quantitativement à l’aide de l’imagerie par microscopie à fluorescence. Ici, une procédure détaillée sur la façon de former un SLB sur des surfaces de verre fabriquées contenant des réseaux nanobar et la caractérisation des protéines sensibles à la courbure sur ces SLB sont introduites. En outre, les protocoles de réutilisation des nanopuces et de traitement d’images sont couverts. Au-delà du nanobar-SLB, ce protocole est facilement applicable à tous les types de copeaux de verre nanostructurés pour les études de détection de courbure.

La conception nanobar est recommandée pour sonder les protéines de détection de courbure positive, qui contient un demi-cercle à chaque extrémité avec une courbure définie par la largeur nanobar et un contrôle de courbure plate/nulle localement au centre (Figure 2A, B). La formation réussie du SLB sur les nanobarres entraîne une distribution uniforme des signaux de marqueurs lipidiques sur toute la surface nanobaraire, comme le montre la figure...

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A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Ici, un système bicouche lipidique soutenu par nanobar est développé pour fournir une membrane synthétique avec une courbure définie qui permet la caractérisation de protéines ayant une capacité de détection de courbure in vitro.

Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in vitro de protéines de détection de courbure membranaire

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Ce système bicouche lipidique soutenu par nanobar peut être utilisé pour étudier le rôle de la courbure de la membrane dans la régulation de la dynamique et de la distribution des protéines et des lipides pendant les activités cellulaires. Cette technique offre à la fois une sous-racine élevée et une mauvaise dans la génération de courbure de la membrane en formant une bicouche lipidique continue sur des erreurs nanobar patentes avec une courbure de membrane prédéfinie par nanofabrication à haute résolution. Pour commencer, placez la nanopuce dans un bécher de 10 millilitres avec le côté du motif vers le haut.Ajoutez soigneusement un millilitre d’acide sulfurique à 98% dans le bécher et assurez-vous que l’acide recouvre complètement l’avant et l’arrière de la puce. Faites tourner lentement le bécher et ajoutez 200 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 30% goutte à goutte jusqu’à ce que tout le bécher devienne chaud. Assurez-vous que l’acide sulfurique et le peroxyde d’hydrogène sont bien mélangés pour former une solution de Piranha pour l’élimination des molécules organiques de la nanopuce.Placez le bécher dans un récipient en verre secondaire et conservez la nanopuce immergée dans la solution Piranha pendant la nuit pour nettoyer soigneusement les impuretés. Sortez le bécher et pipettez soigneusement la solution de Piranha dans un récipient à déchets acides. Chargez cinq millilitres d’eau désionisée dans le bécher pour diluer l’acide résiduel et l’éliminer dans les déchets acides.Répétez cette étape cinq fois. Prenez la puce avec une pince à épiler et lavez avec un jet continu d’eau désionisée pour éliminer complètement l’acide résiduel. Sécher la puce avec 99,9% d’azote gazeux pour la formation de SLB.Soniquer le mélange lipidique pendant 30 minutes. Congeler le mélange lipidique dans de l’azote liquide pendant 20 secondes, puis décongeler à 42 degrés Celsius pendant deux minutes au bain-marie. Répétez les cycles de congélation/décongélation 30 fois.Après cela, le mélange lipidique ressemble à un liquide clair. Passez le mélange lipidique à travers la mini extrudeuse et extrudez 20 fois d’avant en arrière. Récupérez les VUS de la seringue de l’autre côté pour réduire la contamination par des particules plus grosses ou des corps étrangers, et transférez-les dans un tube centrifuge de 1,5 millilitre.Retirez soigneusement la nanopuce nettoyée de l’eau désionisée avec une pince à épiler et séchez-la avec 99,9% d’azote gazeux. Effectuez un nettoyage de surface de la nanopuce avec un traitement plasma à l’air pendant une heure. Assemblez la nanopuce dans une chambre PDMS.Commencez par placer la puce sur une surface propre avec le motif vers le haut. Couvrez délicatement le PDMS central avec la puce et assurez-vous que l’ensemble du motif est exposé à la zone centrale de la grande ouverture ovale dans le PDMS central. Couvrez le PDMS supérieur avec le PDMS du milieu et gardez ses deux petits trous dans la région du grand trou ovale du PDMS du milieu.Ensuite, la chambre PDMS est assemblée. Chargez les SUV dans le canal PDMS à partir de l’un des deux petits trous dans le PDMS supérieur avec une pipette et incuber pendant 15 minutes à température ambiante pour former le SLB. Pipeter doucement le tampon PBS dans le canal PDMS d’un côté du petit trou et retirer les déchets avec un coton-tige de l’autre trou pour laver les VUS non liés.Acquérir ensuite le SLB formé sur la nano puce. Configurez la microscopie confocale à balayage laser à l’aide d’un objectif d’huile 100 x. Ouvrez le logiciel Zen pour sélectionner la puissance laser d’excitation qui peut exciter la fluorescence du lipide et de la protéine.Choisissez Mode d’acquisition. Cliquez ensuite sur Smart Setup (Configuration intelligente), puis sur Texas Red (Texas Red). Ajustez la mise au point avec le bouton de mise au point pour localiser les nano barres sur la puce jusqu’à ce que les bords de la nano barre soient nets sous le canal lipidique.Définissez les paramètres de balayage pour obtenir une image de contrôle du canal lipidique avant d’ajouter des protéines. Effectuer le test FRAP en blanchissant avec une bicouche lipidique marquée par fluorescence sur une seule zone nanobar aléatoire. Cochez les cases Régions d’expérience et Blanchiment.Dessinez une zone circulaire de cinq micromètres de diamètre qui peut inclure l’ensemble de la nanobarre au centre, et ajouter aux régions expérimentales. Entrez les paramètres d’imagerie TimeLapse. Choisissez Séries chronologiques.Cliquez ensuite sur Durée. Sélectionnez 100 cycles et intervalle égal à deux secondes. Paramètres de blanchiment d’entrée.Activez les cases à cocher laser qui exécutent FRAP et modifiez l’alimentation à 100%Cliquez sur Démarrer l’expérience pour l’expérience FRAP. Chargez la solution protéique dans le canal PDMS et incuber pendant cinq minutes à température ambiante pour permettre la liaison de la protéine sur le SLB. Recentrez les nanobarres et réglez les paramètres de balayage pour prendre des images des canaux lipidiques et protéiques pour la détection de la courbure des protéines.Sélectionnez les régions expérimentales et effectuez le test FRAP sur les canaux lipidiques et protéiques, et effectuez l’imagerie TimeLapse pour caractériser la mobilité de la protéine de détection de courbure. Les deux montrent une accumulation accrue à l’extrémité des nanobarres individuelles revêtues de SLB avec une largeur de 300 nanomètres. Ici, le SLB contient 10% de PS pour améliorer électrostatiquement la liaison aux protéines.Les deux protéines ont un rapport extrémité / centre plus élevé que les lipides, qui est d’environ un. En comparant l’IDR FBP17 et le F-Bar, le rapport extrémité/centre supérieur de l’IDR FBP17 indique une détection de courbure plus forte que la F-Bar. Les trois protéines ont montré une accumulation préférentielle aux sites membranaires incurvés de l’extrémité nanobar lorsque la courbure a diminué en dessous de 400 nanomètres de diamètre.Parmi ces trois domaines protéiques, IDR FBP17 donne la nano bar et la densité les plus élevées, indiquant sa plus forte capacité de détection de courbure, tandis que F-Bar montre la valeur la plus faible. La courbe de liaison aux protéines peut être tracée en augmentant progressivement la concentration en protéines, ce qui montre que IDR FBP17 a une forte capacité de détection de courbure coopérative. Par rapport à la récupération rapide des signaux lipidiques sur les nanobars, la barre F ne peut pas récupérer en deux minutes, ce qui suggère une diminution significative de la mobilité de la membrane et de la dynamique d’association aux sites membranaires incurvés.Étonnamment, différents du comportement de F-Bar, les signaux IDR FBP17 ont montré une récupération évidente dans le même laps de temps, indiquant la nature dynamique de l’IDR FBP17 accumulé au niveau des membranes courbes. Cependant, après avoir éliminé l’IDR FBP17 non lié dans la solution, la même récupération dans le canal IDR FBP17 n’a pas pu être observée comme auparavant. La qualité SLB est très importante lors de l’étude de l’interaction entre la membrane incurvée et la protéine.Le test FRAP est donc nécessaire dans notre expérience pour valider la mobilité de la membrane. Ce système aidera les chercheurs à étudier divers paramètres affectant l’interaction des protéines avec la membrane courbe, tels que les domaines de détection de la courbure et la composition lipidique, ainsi qu’à mener des études dynamiques sur la membrane incurvée telles que les comportements de séparation des visages.

Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in vitro de protéines de détection de courbure membranaire

Abstract