نشكر مركز نانيانغ للتصنيع النانوي (N2FC) ومركز التقنيات الضوئية التخريبية (CDPT) في جامعة نانيانغ التكنولوجية (NTU) لدعم تصنيع البنية النانوية والتصوير SEM ، ومنصة إنتاج البروتين (PPP) في كلية العلوم البيولوجية NTU لتنقية البروتين ، وكلية الهندسة الكيميائية والطبية الحيوية NTU للمجهر متحد البؤر. يتم تمويل هذا العمل من قبل وزارة التعليم السنغافورية (MOE) (W. Zhao و RG112/20 و RG95/21 و MOE-T2EP30220-0009) ، ومعهد التحليلات الجزيئية الرقمية والعلوم (IDMxS) بدعم من تمويل وزارة التربية والتعليم في إطار مخطط مراكز التميز البحثية (W. Zhao) ، ومؤسسة برنامج علوم الحدود البشرية (W. Zhao ، RGY0088/2021) ، ومنحة NTU Start-up Grant (W. Zhao) ، كلية الهندسة الكيميائية والطبية الحيوية NTU للمنحة البحثية (X. Miao) ، ومجلس المنح الدراسية الصيني للمنحة البحثية (J. Wu).

1. تنظيف رقاقة النانو
<ol><li>ضع الشريحة النانوية في دورق سعة 10 مل بحيث يكون الجانب المنقوش متجها لأعلى. ملاحظة: تم تصنيع رقاقة الكوارتز النانوية هذه عبر الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون كما هو موضح من قبل21. يمكن تصميم هندسة وترتيب البنية النانوية على الرقاقة حسب ا...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

يقدم نظام nanobar-SLB الموصوف هنا مزيجا فريدا من المزايا في العديد من المقايسات الموجودة في المختبر. يكشف بكفاءة عن الارتباط التفضيلي للبروتينات بالأغشية المنحنية للغاية مثل مقايسة تعويم الجسيمات الشحمية أو الترسيب ولكنه يتطلب عينات أقل بكثير ويوفر انحناءا محددا بدقة أكبر على قضبان نان?...

انحناء الغشاء هو معلمة فيزيائية حرجة للخلية تحدث في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية مثل التشكل وانقسام الخلايا وهجرة الخلايا1. من المعترف به على نطاق واسع الآن أن انحناء الغشاء يتجاوز نتيجة بسيطة للأحداث الخلوية. بدلا من ذلك ، برز كمنظم فعال لتفاعلات البروتين والإشارات داخل الخلايا. على سبيل المثال ، تم العثور على العديد من البروتينات المشاركة في التداخل الخلوي بوساطة الكلثرين ترتبط بشكل تفضيلي بالغشاء المنحني ، مما يؤدي إلى تكوين نقطة ساخنة للداخل الخلوي2. هناك العديد من الأسباب المختلفة لتشوه الغشاء مثل سحب الغشاء بواسطة قوى الهيكل الخلوي ، ووجود عدم تناسق الدهون مع مجموعات الرأس ذات الأحجام المختلفة ، ووجود بروتينات عبر الغشاء ذات شكل مخروطي ، وتراكم البروتينات المكونة للغشاء مثل بروتينات مجال BAR (سميت على اسم بروتينات Bin و amphiphysin و Rvs) ، وإدخال مجال الحلزونات البرمائية في الغشاء1 . ومن المثير للاهتمام أن هذه البروتينات والدهون لا تشوه الغشاء فحسب ، بل يمكنها أيضا استشعار انحناء الغشاء وإظهار تراكم تفضيلي1. لذلك ، من الأهمية بمكان دراسة ما إذا كانت الأغشية ذات الانحناءات المختلفة تغير توزيع وديناميكيات البروتينات والدهون المرتبطة بها وكيف تغير التأثيرات المحتملة على العمليات داخل الخلايا ذات الصلة.
تم تطوير العديد من التقنيات لتحليل التفاعل بين الغشاء المنحني والبروتينات في كل من الخلايا الحية وأنظمة المختبر. يوفر نظام الخلية الحية بيئة خلية حقيقية مع تنوع غني للدهون وتنظيم إشارات البروتين الديناميكي2،3،4،5،6،7. ومع ذلك ، يصعب دراسة مثل هذا النظام المتطور بسبب عدم اليقين والتقلبات في البيئة داخل الخلايا. ومن ثم ، فإن المقايسات في المختبر باستخدام غشاء اصطناعي يتكون من أنواع الدهون المعروفة والبروتينات النقية أصبحت أنظمة إعادة تكوين قوية لتوصيف العلاقة بين البروتينات والأغشية المنحنية. تقليديا ، يتم إنشاء الجسيمات الشحمية بأقطار مختلفة عن طريق البثق للكشف عن البروتينات الحساسة للانحناء إما عن طريق مقايسة الترسيب المشترك باستخدام قوة الطرد المركزي أو مقايسة التعويم المشترك مع تدرج الكثافة لتجنب تراكم البروتين 8,9. ومع ذلك ، فإن انحناء الجسيمات الشحمية المبثوقة محدود بحجم المسام المتاح لمرشح الغشاء المستخدم في الطارد10. وقد ثبت أن مقايسة انحناء الجسيمات الشحمية المفردة (SLiC) تتغلب على هذا القيد ، حيث يتم تمييز الجسيمات الشحمية بأقطار مختلفة بالتألق وتثبيتها على السطح بحيث يمكن تمييز الانحناء بكثافة الفلورسنت11. ومع ذلك ، فقد لوحظ تباين قوي في تكوين الدهون في الحويصلات الصغيرة ، مما يؤثر على دقة قياس الانحناء12. توفر تجارب سحب الحبل قياسا أكثر دقة للانحناء على الحبل العابر المسحوب من الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) باستخدام ملقط بصري ، حيث يمكن التحكم في الانحناء جيدا بواسطة توتر الغشاء الناتج13,14. هذه الطريقة مناسبة لدراسة بروتينات استشعار الانحناء الإيجابي أو السلبي ، ولكنها مقيدة بإنتاجية توليد الأنبوب10. يوفر فحص الأنابيب الغشائية المدعومة (SMrT) توليدا متزامنا لأنابيب غشائية متعددة يتم بثقها من نفس خزان الدهون بواسطة تدفقات الموائع الدقيقة. ومع ذلك ، يختلف انحناء الغشاء جوهريا على طول الأنبوب النانوي ، مما يضر بدقة قياس الانحناء القائم على شدة التألق15,16. وبالمقارنة ، فإن استخدام حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة (سيارات الدفع الرباعي ، قطرها <100 نانومتر17) لتشكيل طبقة ثنائية دهنية مدعومة (SLB) على الأسطح التي تحتوي على طبوغرافيات مصممة ولدت غشاء أحادي الطبقة مع انحناءات محددة مسبقا بواسطة التصنيع النانوي أو المواد النانوية بدقة عالية18،19،20.
هنا ، نقدم بروتوكولا لتشكيل SLB على أسطح رقاقة نانوية مصنعة مع صفائف نانوية وكيف يمكن استخدامه لاستكشاف حساسية انحناء البروتينات في المختبر. كما هو موضح في الشكل 1 ، هناك ستة مكونات أساسية للفحص: أ) تنظيف وتجميع الرقاقة بغرفة الموائع الدقيقة ؛ ب) تحضير سيارات الدفع الرباعي ذات التركيب الدهني المحدد ؛ ج) تشكيل SLB على رقاقة نانوية وملزمة ببروتينات حساسة للانحناء ؛ د) تصوير وتوصيف SLB والبروتينات الحساسة للانحناء تحت المجهر الفلوري ؛ ه) تنظيف الرقاقة لإعادة استخدامها ؛ و) معالجة الصور للتحليل الكمي لقدرة استشعار انحناء البروتين. يتم وصف البروتوكول التفصيلي خطوة بخطوة أدناه.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

يلعب انحناء الغشاء أدوارا مهمة في مختلف العمليات الأساسية للخلايا ، مثل هجرة الخلايا وانقسام الخلايا والاتجار بالحويصلات. لا يتم إنشاؤه بشكل سلبي فقط من خلال الأنشطة الخلوية ، ولكن أيضا ينظم بنشاط تفاعلات البروتين ويشارك في العديد من الإشارات داخل الخلايا. وبالتالي ، من المفيد للغاية دراسة دور انحناء الغشاء في تنظيم توزيع وديناميات البروتينات والدهون. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من التقنيات لدراسة العلاقة بين الغشاء المنحني والبروتين في المختبر. بالمقارنة مع التقنيات التقليدية ، توفر الطبقة الثنائية الدهنية المدعومة بالقضيب النانوي (SLB) المطورة حديثا إنتاجية عالية ودقة أفضل في توليد انحناء الغشاء من خلال تشكيل طبقة ثنائية دهنية مستمرة على صفائف منقوشة من القضبان النانوية مع انحناء غشاء محدد مسبقا وتحكم مسطح محلي. يمكن توصيف كل من سيولة الدهون وحساسية البروتين للأغشية المنحنية كميا باستخدام التصوير المجهري الفلوري. هنا ، يتم تقديم إجراء مفصل حول كيفية تشكيل SLB على الأسطح الزجاجية المصنعة التي تحتوي على صفائف نانوية وتوصيف البروتينات الحساسة للانحناء على SLB هذا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغطية بروتوكولات إعادة استخدام الرقائق النانوية ومعالجة الصور. بالإضافة إلى nanobar-SLB ، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق بسهولة على جميع أنواع رقائق الزجاج ذات البنية النانوية لدراسات استشعار الانحناء.

يوصى بتصميم Nanobar لفحص بروتينات استشعار الانحناء الإيجابي ، والتي تحتوي على نصف دائرة في كل طرف مع انحناء محدد بعرض القضيب النانوي وتحكم واحد في الانحناء المسطح / الصفري محليا في المركز (الشكل 2 أ ، ب). ينتج عن التكوين الناجح ل SLB على القضبان النانوية إشارات علامة دهن?...

Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

هنا ، تم تطوير نظام ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بشريط نانوي لتوفير غشاء اصطناعي بانحناء محدد يتيح توصيف البروتينات مع القدرة على استشعار الانحناء في المختبر.

نظام ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بشريط نانوي لدراسة بروتينات استشعار انحناء الغشاء في المختبر

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

يمكن استخدام نظام الطبقة الثنائية الدهني المدعوم بشريط نانوي لدراسة دور انحناء الغشاء في تنظيم ديناميكيات وتوزيع البروتين والدهون أثناء أنشطة الخلية. توفر هذه التقنية كلا من الجذر الفرعي العالي والسيئ في توليد انحناء الغشاء من خلال تشكيل طبقة ثنائية دهنية مستمرة على أخطاء نانوية براءات الاختراع مع انحناء الغشاء المحدد مسبقا بواسطة التصنيع النانوي عالي الدقة. للبدء ، ضع شريحة النانو في دورق سعة 10 ملليلتر بحيث يكون جانب النمط متجها لأعلى.أضف بعناية ملليلتر واحد من 98٪ من حمض الكبريتيك إلى الدورق وتأكد من أن الحمض يغطي الجانب الأمامي والخلفي من الرقاقة بالكامل. قم بتدوير الكأس الزجاجية ببطء وأضف 200 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين قطرة قطرة حتى تصبح الكأس الزجاجية بأكملها ساخنة. تأكد من خلط حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين جيدا لتشكيل محلول سمكة البيرانا لإزالة الجزيئات العضوية من رقاقة النانو.ضع الدورق في وعاء زجاجي ثانوي واحتفظ بشريحة النانو مغمورة في محلول سمكة البيرانا طوال الليل لتنظيف الشوائب جيدا. أخرج الدورق واسحب محلول سمكة البيرانا بعناية في حاوية نفايات حمضية. حمل خمسة ملليلترات من الماء منزوع الأيونات في الكأس الزجاجية لتخفيف الحمض المتبقي وتخلص منه في الفضلات الحمضية.كرر هذه الخطوة خمس مرات. أمسك الرقاقة بالملاقط واغسلها بتيار مستمر من الماء منزوع الأيونات لإزالة الحمض المتبقي جيدا. جفف الرقاقة بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪ لتشكيل SLB.سونيك خليط الدهون لمدة 30 دقيقة. تجمد خليط الليبيدات في النيتروجين السائل لمدة 20 ثانية ثم تذوب عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين في حمام مائي. كرر دورات التجميد / الذوبان 30 مرة.بعد ذلك ، يبدو خليط الدهون كسائل صاف. مرر خليط الدهون عبر الطارد الصغير وبثق ذهابا وإيابا 20 مرة. اجمع سيارات الدفع الرباعي من المحقنة الموجودة على الجانب الآخر لتقليل التلوث بجزيئات أكبر أو مواد غريبة ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر.أخرج شريحة النانو النظيفة من الماء منزوع الأيونات بعناية باستخدام زوج من الملقط وجففها بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪. قم بإجراء التنظيف السطحي لرقاقة النانو باستخدام معالجة بلازما الهواء لمدة ساعة واحدة. قم بتجميع شريحة النانو في غرفة PDMS.ابدأ بوضع الشريحة على سطح نظيف مع توجيه النمط لأعلى. قم بتغطية PDMS الأوسط برفق باستخدام الشريحة وتأكد من تعرض النمط بالكامل للمنطقة المركزية للفتحة الكبيرة ذات الشكل البيضاوي في PDMS الأوسط. قم بتغطية PDMS العلوي ب PDMS الأوسط واحتفظ بفتحتيه الصغيرتين داخل منطقة الفتحة البيضاوية الكبيرة لنظام PDMS الأوسط.ثم يتم تجميع غرفة PDMS. قم بتحميل سيارات الدفع الرباعي في قناة PDMS من أحد الفتحتين الصغيرتين في PDMS العلوي باستخدام ماصة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل SLB. قم بماصة برفق المخزن المؤقت PBS في قناة PDMS من جانب واحد من الفتحة الصغيرة وقم بإزالة النفايات باستخدام برعم قطني من الفتحة الأخرى لغسل سيارات الدفع الرباعي غير المقيدة.ثم الحصول على SLB شكلت على رقاقة نانو. قم بإعداد الفحص المجهري متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر باستخدام هدف زيت 100 ×. افتح برنامج Zen لتحديد قوة ليزر الإثارة التي يمكن أن تثير مضان الدهون والبروتين.اختر وضع الاستحواذ. ثم انقر فوق الإعداد الذكي ، متبوعا ب Texas Red. اضبط التركيز باستخدام مقبض التركيز لتحديد موقع قضبان النانو على الشريحة حتى تصبح حواف شريط النانو حادة أسفل قناة الدهون.اضبط معلمات المسح للحصول على صورة تحكم لقناة الدهون قبل إضافة البروتين. قم بإجراء فحص FRAP عن طريق التبييض باستخدام طبقة ثنائية الدهون الفلورية على منطقة نانوية مفردة عشوائية. حدد خانتي الاختيار مناطق التجربة والتبييض.ارسم مساحة دائرية قطرها خمسة ميكرومتر والتي يمكن أن تشمل القضيب النانوي بأكمله في المركز ، وأضفه إلى مناطق التجربة. معلمات التصوير الفاصل الزمني الإدخال. اختر السلاسل الزمنية.ثم انقر على المدة. حدد 100 دورة وفاصل زمني يساوي ثانيتين. معلمات التبييض المدخلة.حدد خانات الاختيار بالليزر التي تقوم بإجراء FRAP وقم بتغيير الطاقة إلى 100٪ انقر فوق بدء التجربة لتجربة FRAP. قم بتحميل محلول البروتين في قناة PDMS واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بربط البروتين على SLB. أعد تركيز القضبان النانوية واضبط معلمات المسح لالتقاط صور لكل من قنوات الدهون والبروتين للكشف عن استشعار انحناء البروتين.حدد مناطق التجربة وقم بإجراء اختبار FRAP على كل من قنوات الدهون والبروتين ، وقم بإجراء تصوير TimeLapse لتوصيف حركة بروتين استشعار الانحناء. كلاهما يظهر تراكما متزايدا في نهاية القضبان النانوية الفردية المطلية ب SLB بعرض 300 نانومتر. هنا يحتوي SLB على 10٪ PS لتعزيز ربط البروتين كهربائيا.كلا البروتينين لهما نسبة أعلى من نهاية إلى مركز الليبيدات، وهي نسبة واحدة تقريبا. عند مقارنة IDR FBP17 و F-Bar ، تشير نسبة الطرف الأعلى إلى المركز ل IDR FBP17 إلى استشعار انحناء أقوى من F-Bar. أظهرت البروتينات الثلاثة تراكما تفضيليا في مواقع الغشاء المنحني النانوي عندما انخفض الانحناء إلى أقل من 400 نانومتر في القطر.من بين مجالات البروتين الثلاثة هذه ، يعطي IDR FBP17 أعلى شريط نانو وكثافة ، مما يشير إلى أقوى قدرة على استشعار الانحناء ، بينما يظهر F-Bar أقل قيمة. يمكن رسم منحنى ربط البروتين عن طريق زيادة تركيز البروتين تدريجيا مما يدل على أن IDR FBP17 لديه قدرة قوية على استشعار الانحناء التعاوني. بالمقارنة مع الاسترداد السريع للإشارات الدهنية على القضبان النانوية ، لا يمكن ل F-Bar التعافي في غضون دقيقتين ، مما يشير إلى انخفاض كبير في حركة الغشاء وديناميكية الارتباط في مواقع الغشاء المنحني.والمثير للدهشة ، تختلف إشارات IDR FBP17 عن سلوك F-Bar ، فقد أظهرت انتعاشا واضحا في نفس الإطار الزمني ، مما يشير إلى الطبيعة الديناميكية ل IDR FBP17 المتراكمة في الأغشية المنحنية. ومع ذلك ، بعد غسل IDR FBP17 غير المنضم في المحلول ، لا يمكن ملاحظة نفس الاسترداد في قناة IDR FBP17 كما كان من قبل. جودة SLB مهمة جدا عند دراسة التفاعل بين الغشاء المنحني والبروتين.لذا فإن اختبار FRAP ضروري في تجربتنا للتحقق من صحة حركة الغشاء. سيساعد هذا النظام الباحثين على دراسة المعلمات المختلفة التي تؤثر على تفاعل البروتين مع الغشاء المنحني ، مثل مجالات استشعار الانحناء ، وتكوين الدهون بالإضافة إلى إجراء الدراسات الديناميكية على الغشاء المنحني مثل سلوكيات فصل الوجه.