Vi takker Nanyang NanoFabrication Center (N2FC) og Center for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) ved Nanyang Technological University (NTU) for at støtte nanostrukturfabrikation og SEM-billeddannelse, Protein Production Platform (PPP) på School of Biological Sciences NTU for proteinrensning og School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for det konfokale mikroskop. Dette arbejde finansieres af Singapore Ministry of Education (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 og MOE-T2EP30220-0009), Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) støttet af MOE-finansiering under Research Centres of Excellence-ordningen (W. Zhao), Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU for forskningsstipendiet (X. Miao) og China Scholarship Council for forskningsstipendiet (J. Wu).

1. Rengøring af nanochip
<ol><li>Nanochippen anbringes i et 10 ml bægerglas med den mønstrede side opad. BEMÆRK: Denne kvarts nanochip er fremstillet via elektronstrålelitografi som beskrevet før21. Geometrien og arrangementet af nanostrukturen på chippen kan specialdesignes. Størrelserne på de gradient nanobarer, der anvendes her, er 2000 nm i længden, 600 nm i højden og 100 til 1000 nm i bredden (100 nm trinsæt).</li>
	<li>Tilsæt forsigtigt 1 ml 98% sv...

<ol>
	<li>McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).</li>
	<li>Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).</li>
	<li>Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
	<li>Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).</li>
	<li>Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
	<li>Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).</li>
	<li>Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).</li>
	<li>Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).</li>
	<li>Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).</li>
	<li>Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).</li>
	<li>Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
	<li>Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).</li>
	<li>Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).</li>
	<li>Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).</li>
	<li>Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).</li>
	<li>Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).</li>
	<li>Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).</li>
	<li>Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).</li>
	<li>Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).</li>
	<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
	<li>Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).</li>
	<li>Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).</li>
	<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).</li>
	<li>Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).</li>
	<li>Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).</li>
	<li>Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).</li>
	<li>El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).</li>
	<li>Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
	<li>Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).</li>
	<li>Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).</li>
	<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
	<li>Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).</li>
	<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
	<li>Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).</li>
	<li>Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).</li>
	<li>Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).</li>
	<li>Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).</li>
	<li>Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).</li>
	<li>Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).</li>
	<li>Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).</li>
	<li>Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).</li>
	<li>Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).</li>
	<li>London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).</li>
	<li>Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).</li>
	<li>Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).</li>
	<li>Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).</li>
	<li>Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).</li>
</ol>

Nanobar-SLB-systemet, der er beskrevet her, tilbyder en unik kombination af fordelene ved flere eksisterende in vitro-assays. Det afslører effektivt den foretrukne binding af proteiner til stærkt buede membraner som liposomflådning eller sedimenteringsassay, men kræver meget færre prøver og tilbyder mere præcist defineret krumning på individuelle nanobarer 8,29. Det tilbyder også en bred vifte af præcist kontrolleret krumning til samtidig samme...

Membrankrumning er en kritisk fysisk parameter for en celle, der forekommer i en række cellulære processer såsom morfogenese, celledeling og cellemigration1. Det er almindeligt anerkendt nu, at membrankrumning er ud over et simpelt resultat af cellulære begivenheder; i stedet er det opstået som en effektiv regulator af proteininteraktioner og intracellulær signalering. For eksempel viste det sig, at flere proteiner involveret i clathrinmedieret endocytose fortrinsvis binder til den buede membran, hvilket resulterer i dannelsen af et hotspot for endocytose2. Der er mange forskellige årsager til membrandeformation, såsom membrantrækning af cytoskeletale kræfter, tilstedeværelsen af lipidasymmetri med hovedgrupper af forskellig størrelse, eksistensen af transmembranproteiner med konisk form, akkumulering af membranformende proteiner som BAR-domæneproteiner (opkaldt efter Bin-, amphiphysin- og Rvs-proteiner) og indsættelse af amfipatiske helices-domæne i membranen1 . Interessant nok deformerer disse proteiner og lipider ikke kun membranen, men kan også mærke membrankrumningen og udvise præferenceakkumulering1. Derfor er det afgørende at undersøge, om og hvordan membraner med forskellige krumninger ændrer fordelingen og dynamikken af proteiner og lipider, der er knyttet til dem, og de potentielle virkninger på de relaterede intracellulære processer.
Mange teknikker er udviklet til at analysere interaktionen mellem buet membran og proteiner i både levende celle- og in vitro-systemer. Det levende cellesystem giver et ægte cellemiljø med rig lipiddiversitet og dynamisk proteinsignalregulering 2,3,4,5,6,7. Et sådant sofistikeret system er imidlertid vanskeligt at studere på grund af usikkerheder og udsving i det intracellulære miljø. Derfor er in vitro-assays ved hjælp af en kunstig membran sammensat af kendte lipidarter og oprensede proteiner blevet kraftfulde rekonstitutionssystemer til at karakterisere forholdet mellem proteiner og buede membraner. Traditionelt genereres liposomer med forskellige diametre ved ekstrudering for at detektere krumningsfølsomme proteiner via enten et co-sedimentationsassay ved hjælp af centrifugalkraft eller et co-flotationsassay med en densitetsgradient for at undgå proteinaggregering 8,9. Krumningen af de ekstruderede liposomer er imidlertid begrænset af den tilgængelige porestørrelse på membranfilteret, der anvendes i ekstruderen10. Single liposome curvature (SLiC) assay har vist sig at overvinde denne begrænsning, hvor liposomer med forskellige diametre fluorescensmærkes og immobiliseres på overfladen, så krumningen kan markeres af fluorescerende intensitet11. Imidlertid er der observeret stærk variation i lipidsammensætning i små vesikler, hvilket påvirker nøjagtigheden af krumningsmålingen12. Tether-pulling eksperimenter giver en mere præcis måling af krumningen på den forbigående tether, der trækkes fra gigantiske unilamellar vesikler (GUV'er) ved hjælp af en optisk pincet, hvor krumningen godt kan styres af membranspændingen genereret13,14. Denne metode er egnet til at studere enten positive eller negative krumningsfølende proteiner, men er begrænset af gennemstrømningen af rørgenerering10. Understøttede membranrør (SMrT) assay giver samtidig generering af flere membranrør, der ekstruderes fra det samme lipidreservoir ved mikrofluidiske strømme. Ikke desto mindre varierer membrankrumningen iboende langs nanorøret, hvilket kompromitterer nøjagtigheden af fluorescensintensitetsbaseret krumningsmåling15,16. Til sammenligning genererede brug af små unilamellar vesikler (SUV'er, diameter <100 nm17) til dannelse af et understøttet lipiddobbeltlag (SLB) på overflader indeholdende designede topografier en enkelt dobbeltlagsmembran med krumninger forudbestemt af nanofabrikation eller nanomaterialer med høj nøjagtighed18,19,20.
Her præsenterer vi en protokol for dannelsen af SLB på fabrikerede nanochipoverflader med nanobar-arrays, og hvordan den kan bruges til at undersøge krumningsfølsomheden af proteiner in vitro. Som vist i figur 1 er der seks væsentlige komponenter i analysen: A) Rengøring og samling af chippen med et mikrofluidisk kammer; B) Fremstilling af SUV'er med defineret lipidsammensætning; C) Dannelse af SLB på en nanochip og binding med krumningsfølsomme proteiner; D) Billeddannelse og karakterisering af SLB og krumningsfølsomme proteiner under fluorescensmikroskopi; E) Rengøring af chippen til genbrug; F) Billedbehandling til kvantitativ analyse af proteinkrumningssensorevne. Den detaljerede protokol er beskrevet trin for trin nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anhydrous Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>RN0879999FU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber Vial</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27115-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain PS: L-&#945;-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211060804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211061706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Beaker</td>
			<td>Schott-Duran</td>
			<td>SCOT211065408</td>
			<td>The second container&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V800117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton buds</td>
			<td>Watsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg PC: L-&#945;-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>840051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-BAR+IDR</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-His</td>
			<td>Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore</td>
			<td></td>
			<td>Proteins and peptide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>V9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDR from human FBP17</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>1.50d</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscopy</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>LSM 800 with Airyscan</td>
			<td>100x (N.A.1.4) oil objective.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>10010240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extuder&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>610000-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microtubes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 &#956;m</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>800309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Bufferen Saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>70013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Base</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker</td>
			<td>Dow Corning Corporation</td>
			<td>SYLGARD 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>HARRICK PLASMA</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz Nanochip</td>
			<td>Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt</td>
			<td>Life Technologies Holdings Pte Ltd.</td>
			<td>T1395MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer</td>
			<td>Gooi</td>
			<td>PDC-002-HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>Elma</td>
			<td>D-78224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voterx</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>NUCERITE</td>
			<td>5312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>TW8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a nanobar-supported lipid bilayer system for the study of membrane curvature sensing proteins in vitro

Membrankrumning spiller vigtige roller i forskellige vigtige processer af celler, såsom cellemigration, celledeling og vesikelhandel. Det genereres ikke kun passivt af cellulære aktiviteter, men regulerer også aktivt proteininteraktioner og er involveret i mange intracellulære signalering. Det er således af stor værdi at undersøge membrankrumningens rolle i reguleringen af fordelingen og dynamikken af proteiner og lipider. For nylig er der udviklet mange teknikker til at studere forholdet mellem den buede membran og protein in vitro. Sammenlignet med traditionelle teknikker tilbyder det nyudviklede nanobar-understøttede lipiddobbeltlag (SLB) både høj kapacitet og bedre nøjagtighed i membrankrumningsgenerering ved at danne et kontinuerligt lipiddobbeltlag på mønstrede arrays af nanobarer med en foruddefineret membrankrumning og lokal flad kontrol. Både lipidfluiditeten og proteinfølsomheden over for buede membraner kan kvantitativt karakteriseres ved hjælp af fluorescensmikroskopibilleddannelse. Her introduceres en detaljeret procedure for, hvordan man danner en SLB på fabrikerede glasoverflader indeholdende nanobararrays og karakterisering af krumningsfølsomme proteiner på sådanne SLB. Derudover er protokoller til genbrug af nanochip og billedbehandling dækket. Ud over nanobar-SLB er denne protokol let anvendelig på alle typer nanostrukturerede glaschips til krumningssensorundersøgelser.

Nanobar-design anbefales til sondering af positive krumningsfølende proteiner, som indeholder en halvcirkel i hver ende med krumning defineret af nanobarbredden og en flad / nul krumningskontrol lokalt i midten (figur 2A, B). Vellykket dannelse af SLB på nanobarer resulterer i jævnt fordelte lipidmarkørsignaler over hele nanobaroverfladen som vist i figur 2C. Signaler fra flere nanobarer kan kombineres ved at beregne gennemsnittet af de enke...

Watch this Scientific Journal Video about A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro at JoVE.com

A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro

Her er et nanobar-understøttet lipid dobbeltlagssystem udviklet til at give en syntetisk membran med en defineret krumning, der muliggør karakterisering af proteiner med krumningssensorevne in vitro.

Et nanobar-understøttet lipiddobbeltlagssystem til undersøgelse af membrankrumningsfølende proteiner in vitro

Membrane curvature plays important roles&#160;in various essential processes of cells, such as cell migration, cell division, and vesicle trafficking. It ...

Dette nanobar-understøttede lipid dobbeltlagssystem kan bruges til at studere membrankrumningens rolle i reguleringen af dynamikken og fordelingen af protein og lipider under celleaktiviteter. Denne teknik tilbyder både høj subrod og dårlig i membrankrumningsgenereringen ved at danne et kontinuerligt lipiddobbeltlag på patent nanobarfejl med membrankrumning foruddefineret af nanofabrikation med høj opløsning. Til at begynde med skal du placere nanochippen i et 10 milliliter bægerglas med mønstersiden opad.Tilsæt forsigtigt en milliliter 98% svovlsyre til bægerglasset, og sørg for, at syren dækker forsiden og bagsiden af chippen fuldt ud. Bægerglasset drejes langsomt, og der tilsættes 200 mikroliter 30 % hydrogenperoxid dråbe for dråbe, indtil hele bægerglasset bliver varmt. Sørg for, at svovlsyre og hydrogenperoxid blandes godt til dannelse af Piranha-opløsning til fjernelse af organiske molekyler fra nanochippen.Bægerglasset anbringes i en sekundær glasbeholder, og lad nanochippen nedsænkes i Piranha-opløsningen natten over for at rense urenhederne grundigt. Bægerglasset tages ud, og Piranha-opløsningen pipetteres forsigtigt i en beholder med syreholdigt affald. Der lægges fem milliliter deioniseret vand i bægerglasset for at fortynde restsyren og kasseres i syreaffaldet.Gentag dette trin fem gange. Grib chippen med pincet og vask med en kontinuerlig strøm af deioniseret vand for at fjerne resterende syre grundigt. Føntør chippen med 99,9% nitrogengas til SLB-dannelse.Sonicer lipidblandingen i 30 minutter. Frys lipidblandingen i flydende nitrogen i 20 sekunder og optø derefter ved 42 grader Celsius i to minutter i et vandbad. Gentag fryse-/optøningscyklusserne 30 gange.Derefter ser lipidblandingen ud som en klar væske. Før lipidblandingen gennem miniekstruderen og ekstruder frem og tilbage 20 gange. Saml SUV'erne fra sprøjten på den anden side for at reducere forureningen med større partikler eller fremmed materiale, og overfør den til et 1,5 ml centrifugerør.Tag forsigtigt den rensede nanochip ud af deioniseret vand med en pincet og føntør med 99,9% nitrogengas. Udfør overfladerensning af nanochippen med luftplasmabehandling i en time. Saml nanochippen i et PDMS-kammer.Start med at placere chippen på en ren overflade med mønsteret opad. Dæk forsigtigt det midterste PDMS med chippen, og sørg for, at hele mønsteret udsættes for det centrale område af den store ovale åbning i det midterste PDMS. Dæk det øverste PDMS med det midterste PDMS, og hold dets to små huller inden for området for det store ovale hul i det midterste PDMS.Derefter samles PDMS-kammeret. Indlæs SUV'erne i PDMS-kanalen fra et af de to små huller i det øverste PDMS med en pipette, og inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur for at danne SLB. Pipetter forsigtigt PBS-bufferen ind i PDMS-kanalen fra den ene side af det lille hul, og fjern affaldet med en vatpind fra det andet hul for at vaske de ubundne SUV'er væk.Derefter erhverves SLB dannet på nanochip. Konfokalmikroskopi til laserscanning opsættes ved hjælp af et 100 x oliemål. Åbn Zen-softwaren for at vælge excitationslaserkraften, der kan ophidse fluorescensen af lipidet og proteinet.Vælg Anskaffelsestilstand. Klik derefter på Smart opsætning efterfulgt af Texas Red. Juster fokus med fokusknappen for at lokalisere nanostængerne på chippen, indtil nanobjælkekanterne er skarpe under lipidkanalen.Indstil scanningsparametrene for at få et kontrolbillede af lipidkanalen, før der tilsættes protein. Udfør FRAP-analysen ved blegning med fluorescerende mærket lipiddobbeltlag på et tilfældigt enkelt nanobarområde. Markér afkrydsningsfelterne Eksperimentområder og blegning.Tegn et cirkulært område med en diameter på fem mikrometer, som kan omfatte hele nanobaren i midten, og tilføj til eksperimentregionerne. Indtast TimeLapse-billedparametre. Vælg Tidsserie.Klik derefter på Varighed. Vælg 100 cyklusser og interval svarende til to sekunder. Input blegning parametre.Markér de laserafkrydsningsfelter, der udfører FRAP, og skift effekten til 100 % Klik på Start eksperiment for FRAP-eksperimentet. Læg proteinopløsningen i PDMS-kanalen og inkuber i fem minutter ved stuetemperatur for at tillade binding af proteinet på SLB. Fokuser nanobarerne igen, og indstil scanningsparametrene til at tage billeder af både lipid- og proteinkanaler til detektion af proteinkrumningsregistrering.Vælg eksperimentregioner, og udfør FRAP-analysen på både lipid- og proteinkanaler, og udfør TimeLapse-billeddannelse for at karakterisere mobiliteten af krumningsfølende protein. Begge viser øget ophobning på enden af SLB-belagte individuelle nanobarer med 300 nanometer bredde. Her indeholder SLB 10% PS for elektrostatisk at forbedre proteinbindingen.Begge proteiner har et højere ende til centerforhold end lipider, hvilket er omkring en. Når man sammenligner IDR FBP17 og F-Bar, indikerer det højere ende til centerforhold mellem IDR FBP17 stærkere krumningsføling end F-Bar. Alle tre proteiner viste præferenceakkumulering ved nanobarens buede membransteder, når krumningen faldt til under 400 nanometer i diameter.Blandt disse tre proteindomæner giver IDR FBP17 den højeste nanobar og densitet, hvilket indikerer dens stærkeste krumningssensorevne, mens F-Bar viser den laveste værdi. Proteinbindingskurve kan afbildes ved gradvist at øge proteinkoncentrationen, hvilket viser, at IDR FBP17 har en stærk kooperativ krumningssensorevne. Sammenlignet med den hurtige genopretning af lipidsignaler på nanobarer kan F-Bar ikke komme sig inden for to minutter, hvilket tyder på dens signifikant nedsatte membranmobilitet og foreningsdynamik på de buede membransteder.Overraskende, forskellig fra F-Bar's opførsel, viste IDR FBP17-signaler tydelig genopretning inden for samme tidsramme, hvilket indikerer den dynamiske karakter af IDR FBP17 akkumuleret ved de buede membraner. Efter at have vasket den ubundne IDR FBP17 væk i løsningen, kunne den samme gendannelse i IDR FBP17-kanalen imidlertid ikke observeres som før. SLB-kvaliteten er meget vigtig, når man studerer samspillet mellem buet membran og protein.Så FRAP-testen er nødvendig i vores eksperiment for at validere membranmobiliteten. Dette system vil hjælpe forskerne med at studere forskellige parametre, der påvirker proteininteraktionen med den buede membran, såsom krumningssensordomænerne og lipidsammensætningen samt at gennemføre de dynamiske undersøgelser af buet membran, såsom ansigtsseparationsadfærd.