In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

L'inattivazione genica è fondamentale per studiare la funzione genica e rappresenta una strategia promettente per il trattamento di un'ampia gamma di malattie. Tra le tecnologie tradizionali, l'interferenza dell'RNA soffre dell'abrogazione parziale del bersaglio e della necessità di trattamenti per tutta la vita. Al contrario, le nucleasi artificiali possono imporre un'inattivazione genica stabile attraverso l'induzione di una rottura del doppio filamento di DNA (DSB), ma studi recenti stanno mettendo in discussione la sicurezza di questo approccio. L'editing epigenetico mirato tramite repressori trascrizionali ingegnerizzati (ETR) può rappresentare una soluzione, poiché una singola somministrazione di specifiche combinazioni di ETR può portare a un silenziamento duraturo senza indurre rotture del DNA.

Gli ETR sono proteine contenenti un dominio di legame al DNA programmabile (DBD) ed effettori di repressori trascrizionali presenti in natura. In particolare, è stato dimostrato che una combinazione di tre ETR equipaggiati con il dominio KRAB di ZNF10 umano, il dominio catalitico di DNMT3A umano e DNMT3L umano, induce stati epigenetici repressivi ereditabili sul gene bersaglio di ETR. La natura mordi e fuggi di questa piattaforma, la mancanza di impatto sulla sequenza del DNA del bersaglio e la possibilità di tornare allo stato repressivo mediante demetilazione del DNA su richiesta, rendono il silenziamento epigenetico uno strumento rivoluzionario. Un passo fondamentale è l'identificazione della corretta posizione degli ETR sul gene bersaglio per massimizzare il silenziamento on-target e ridurre al minimo il silenziamento off-target. L'esecuzione di questa fase nel setting preclinico finale ex vivo o in vivo può essere ingombrante.

Prendendo il sistema CRISPR/cataliticamente morto Cas9 come DBD paradigmatico per gli ETR, questo articolo descrive un protocollo costituito dallo screening in vitro di RNA guida (gRNA) accoppiato alla combinazione triplo ETR per un efficiente silenziamento sul bersaglio, seguito dalla valutazione del profilo di specificità a livello di genoma dei migliori successi. Ciò consente di ridurre il repertorio iniziale di gRNA candidati a una breve lista di gRNA promettenti, la cui complessità è adatta per la loro valutazione finale nel contesto terapeuticamente rilevante di interesse.