Dette arbejde blev støttet af Ramalingaswami-bevillingen DBT-843-BIO (Institut for Bioteknologi, Indiens regering) og Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Indiens regering) til S.R. Forfatterne anerkender et ICMR-JRF-tilskud til P.C og DBT-JRF-tilskud til P.S. Forfatterne takker Dr. Ravikant Ranjan for forslag til manuskriptet og teknisk bistand fra Mr. Pradeep Singh Thakur under SEM.

BALB/c mus blev opstaldet i Small Animal Facility på IIT Roorkee. Alle dyr blev holdt i en 12 timer: 12 h lys: mørk cyklus ved 25 ° C og blev forsynet med en pellet kost og vand ad libitum. Alle dyreforsøg blev godkendt af IIT Roorkees institutionelle dyreetiske komité (IAEC).
1. Fremstilling af C. tropicalis
BEMÆRK: Svampen Candida tropicalis tilhører risikogruppe 2 patogener og er klassificeret som en BSL2 mikroorga...

Svampeinfektioner forårsaget af Candida-arter er forbundet med høj sygelighed og dødelighed over hele verden. Den voksende trussel om invasiv svampeinfektion kræver tidlig håndtering af sådanne livstruende sygdomme. De fleste Candida-infektioner involverer dannelse af biofilm, som klæber til en række medicinske anordninger og er ansvarlige for persistens og gentagelse af svampeinfektioner i hospitalsmiljøer31. Biofilm består af gær- eller hyphalceller, og de udviser be...

Systemisk candidiasis er den fjerde hovedårsag til nosokomielle infektioner, som er forbundet med høj sygelighed og dødelighed på verdensplan. Globalt påvirker systemisk candidiasis ca. 700.000 individer1. Candida-arter, nemlig C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata og C. auris, er den mest almindelige årsag til invasive Candida-infektioner 2. Candida-arter er opportunistiske patogener, der producerer biofilm3. Biofilm er overvejende forbundet med Candida virulens, og Candida kan modstå oxidative og osmotiske stresstilstande ved at inducere biofilmdannelse4. Biofilm modulerer yderligere ekspressionen af virulensfaktorer og cellevægskomponenter og danner en exopolymer beskyttelsesmatrix, der hjælper Candida med at tilpasse sig forskellige værtsnicher4. Biofilm bidrager til gærbinding på værtsvæv og medicinske instrumenter5. Som sådan er biofilmdannelse forbundet med en fordel for gær, da gærceller i biofilmene kan undgå værtsimmunresponset6. Biofilmdannelse beskytter også de patogene gær mod virkningen af svampedræbende stoffer5. Nedsat modtagelighed af C. albicans biofilm til amphotericin B er blevet påvist af Pierce et al.7,8. Desuden viser biofilm svampedræbende lægemiddelresistens over for fluconazol, hvilket forringer effektiv behandling af systemisk candidiasis 9,10.
Mikrober har en iboende tendens til at klæbe til forskellige biotiske og abiotiske overflader, hvilket resulterer i biofilmdannelse. Candida albicans, som er en dimorf svamp, findes i gær- og hyphalformer, og dens biofilmdannelse er blevet karakteriseret i forskellige in vitro- og in vivo-modelsystemer 11. Trinene til biofilmdannelse inkluderer vedhæftning af Candida-celler til substratet, filamentering, proliferation og biofilmmodning11. Indledningsvis klæber gærformen af C. albicans til substrater, herunder medicinsk udstyr og humant væv, efterfulgt af filamentering og spredning af C. albicans i hyphal- og pseudohyphalformer og endelig modning af biofilm indlejret i ekstracellulær matrix11. Biofilmdannelse bidrager i vid udstrækning til C. albicans patogenesemekanismer12. Candida-arter danner lægemiddelresistente biofilm, hvilket gør deres udryddelse udfordrende13. En lille delmængde af den biofilmproducerende population C. albicans er blevet beskrevet som værende meget resistent over for de svampedræbende stoffer amphotericin B og chlorhexidin14. Det skal bemærkes, at gærceller i biofilm udviser høj modstandsdygtighed over for multidrugbehandling sammenlignet med gærceller i planktonfasen og spredningsfase14. Det er blevet foreslået, at gærceller, der findes i biofilm, er meget tolerante over for svampedræbende stoffer, hvilket bidrager til C. albicans overlevelse i biofilm14. Disse eksisterende celler blev rapporteret at være fænotypiske varianter af C. albicans og ikke mutanter14. Desuden er celler i Candida biofilm kendt som "persisterceller" tolerante over for høje doser af amphotericin-B-behandling og bidrager til Candida-overlevelse og udgør derved en stor byrde af tilbagevendende systemiske Candida-infektioner hos højrisikopersoner15.
Stigningen i svampedræbende lægemiddelresistens i Candida-stammer nødvendiggør forskning i nye svampedræbende midler og immunterapier. Som det fremgår af ovennævnte undersøgelser, viser Candida biofilm nedsat modtagelighed for svampedræbende stoffer. Derfor er der behov for forbedrede immunterapier til at kontrollere Candida biofilm dannelse. Tidligere undersøgelser har vist, at CAGTA kan yde effektiv beskyttelse mod systemiske Candida-infektioner ved at hæmme dannelsen af C. albicans biofilm in vitro16. En anden undersøgelse rapporterede, at immunisering af mus med C. albicans rAls3-N protein inducerer høje antistoftitre, der forstyrrer C. albicans biofilmdannelse in vitro17. Anti-Als3-N antistoffer udøvede også en hæmmende virkning på C. albicans spredning fra biofilm17. NDV-3A-vaccine baseret på C. albicans er i øjeblikket under klinisk forsøg, og anti-NDV-3A-sera viste sig også at reducere C. auris biofilmdannelse18. En nylig undersøgelse identificerede hæmning af biofilmdannelse af Sap2-antistoffer som en beskyttelsesmekanisme i en murinmodel af systemisk candidiasis19.
Dette papir skitserer en detaljeret in vitro-protokol til evaluering af effekten af antigenspecifikke antistoffer til stede i polyklonalt serum opnået fra forskellige grupper af Sap2-vaccinerede mus på præformerede Candida tropicalis-biofilm . For at opnå dette blev en metode baseret på et XTT-reduktionsassay optimeret og udviklet i laboratoriet, som kan måle biofilmlevedygtighed på en hurtig, følsom og høj kapacitet måde i nærvær eller fravær af antistoffer.
XTT-analysen bruges til at måle cellulær metabolisk aktivitet som en indikator for cellelevedygtighed, cellulær proliferation og cytotoksicitet20. Dette kolorimetriske assay er baseret på reduktionen af et gult tetrazoliumsalt, natrium 3'-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzensulfonssyrehydrat (XTT) til et orange formazanfarvestof af metabolisk aktive celler. Da kun levedygtige celler kan reducere XTT, er mængden af reduceret XTT-formazan proportional med intensiteten af farve og cellelevedygtighed. Det dannede formazanfarvestof er vandopløseligt og kvantificeres direkte ved hjælp af en pladelæser. På grund af sin vandopløselige natur tillader XTT-analysen undersøgelsen af intakte biofilm samt undersøgelse af biofilmlægemiddelfølsomhed uden forstyrrelse af biofilmstruktur21. Derudover er denne metode implementeret i Candida svampelevedygtighedsvurderinger på grund af dens brugervenlighed, hastighed, nøjagtighed, høje gennemstrømning og høje grad af reproducerbarhed 7,22.
Ud over XTT-reduktionsanalysen er der også identificeret adskillige alternative teknikker til måling af biofilmmængde. Nogle af disse inkluderer brugen af MTT-reduktionsassay, krystalviolet farvning, DNA-kvantificering, kvantitativ PCR, proteinkvantificering, måling af tørcellevægt og levedygtig kolonitælling. Disse procedurer varierer meget med hensyn til deres tids- og omkostningskrav. Taff et al. udførte en sammenlignende analyse af syv forskellige Candida biofilmkvantitetsanalyser og fandt ud af, at XTT-analysen gav den mest reproducerbare, nøjagtige og effektive metode til kvantitativ estimering af C. albicans biofilm23. Farvningsteknikker såsom krystalviolet har visse begrænsninger; Den krystalviolette test bestemmer indirekte mængden af biofilm ved at måle den optiske tæthed af den krystalvioletfarvede biofilmmatrix og celler. Selvom det krystalviolette assay giver et godt mål for biofilmmasse, giver det ikke et mål for biofilmlevedygtighed, da det pletter både mikrobielle celler og den ekstracellulære matrix24. Dhale et al. rapporterede yderligere, at XTT-reduktionsanalysen var den mest følsomme, reproducerbare, nøjagtige, effektive og specifikke metode til at detektere biofilmproduktion sammenlignet med krystalviolet assay25. Litteraturrapporter har vist, at XTT-analysen korrelerer godt med CFU/ml-parameteren i CFU-tællemetoden. Sammenlignet med XTT-analysen er CFU-metoden imidlertid arbejdskrævende og langsom26. Desuden er fraktionen af fritliggende levende celler muligvis ikke repræsentativ for den oprindelige biofilmpopulation27. Selvom XTT-reduktionsanalysen synes at være den bedste tilgængelige mulighed for at kvantificere levedygtigheden, er der et par begrænsninger ved denne teknik. Mens XTT-metoden er nyttig til sammenligninger, der involverer en svampestamme, kan dens anvendelse være begrænset, når man sammenligner forskellige svampestammer og arter. Interstrain sammenligninger kan være vanskelige i mangel af detaljeret standardisering, da forskellige stammer metaboliserer substrater med forskellige muligheder21.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>NaCl : 4 g 
			KCl : 0.1 g 
			Na2HPO4:&#160; 0.72 g 
			KH2PO4 : 0.12 g 
			Water 500 mL. Adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microtiter plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>442404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Menadione</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter Plate Reader</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette and tips</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>460090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Lactate</td>
			<td>-</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 MOPS</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>AT180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Agar</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabouraud dextrose Broth</td>
			<td>SRL</td>
			<td>24835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>X6493</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a soluble tetrazolium-based reduction assay to evaluate the effect of antibodies on candida tropicalis biofilms

Candida arter er den fjerde mest almindelige årsag til systemiske nosokomielle infektioner. Systemisk eller invasiv candidiasis involverer ofte biofilmdannelse på implanterede enheder eller katetre, hvilket er forbundet med øget virulens og dødelighed. Biofilm produceret af forskellige Candida-arter udviser øget resistens over for forskellige svampedræbende stoffer. Derfor er der behov for at udvikle effektive immunterapier eller supplerende behandlinger mod Candida biofilm. Mens rollen som cellulær immunitet er veletableret i anti-Candida-beskyttelse , er rollen som humoral immunitet blevet undersøgt mindre.
Det er blevet antaget, at hæmning af biofilmdannelse og modning er en af de vigtigste funktioner i beskyttende antistoffer, og Candida albicans kimrørantistoffer (CAGTA) har vist sig at undertrykke in vitro-vækst og biofilmdannelse af C. albicans tidligere. Dette papir skitserer en detaljeret protokol til evaluering af antistoffernes rolle på biofilm dannet af C. tropicalis. Metoden til denne protokol involverer C. tropicalis biofilmdannelse i 96-brønds mikrotiterplader, som derefter blev inkuberet i nærvær eller fravær af antigenspecifikke antistoffer efterfulgt af et 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) assay til måling af svampecellernes metaboliske aktivitet i biofilmen.
Specificiteten blev bekræftet ved anvendelse af passende serumkontroller, herunder Sap2-specifikt antistofudtømt serum. Resultaterne viser, at antistoffer til stede i serum af immuniserede dyr kan hæmme Candida biofilm modning in vitro. Sammenfattende giver dette papir vigtig indsigt i antistoffernes potentiale i udviklingen af nye immunterapier og synergistiske eller supplerende behandlinger mod biofilm under invasiv candidiasis. Denne in vitro-protokol kan bruges til at kontrollere virkningen af potentielle nye svampedræbende forbindelser på den metaboliske aktivitet af Candida-artsceller i biofilm.

Candida tropicalis biofilm blev dyrket i 96-brønds mikrotiterplader og afbildet ved 40x ved hjælp af et omvendt mikroskop (figur 1A). Biofilmen blev yderligere farvet ved hjælp af krystalviolet og observeret ved 40x ved hjælp af et omvendt mikroskop (figur 1B). Scanning elektronmikroskopi viser et repræsentativt billede af C. tropicalis biofilm (figur 1C). Til udførelse af biofilmhæmningsanalysen blev 10<sup...

Watch this Scientific Journal Video about A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms at JoVE.com

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Et 96-brønds mikrotiterpladebaseret protokol ved anvendelse af en 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT) reduktionsassay er beskrevet heri for at studere antistoffers virkninger på biofilm dannet af C. tropicalis. Denne in vitro-protokol kan bruges til at kontrollere virkningen af potentielle nye svampedræbende forbindelser på den metaboliske aktivitet af Candida-artsceller i biofilm.

Et opløseligt tetrazoliumbaseret reduktionsassay for at evaluere virkningen af antistoffer på Candida tropicalis biofilm

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

Denne in vitro, 96-brøndpladebaserede protokol kan bruges til at teste den hæmmende virkning af antistoffer på nye svampedræbende midler på svampecellernes metaboliske aktivitet i Candida-biofilm. Sammenlignet med andre metoder er dette en meget følsom, nøjagtig, gennemstrømende, reproducerbar, brugervenlig og omkostningseffektiv teknik til evaluering af virkningen af antistoffer eller svampemidler på udviklingen af Candida biofilm. Dette assay kan bruges til at vurdere effekten af nye lægemiddelbaserede eller antistofbaserede terapier samt vaccinekandidater mod Candida-biofilm, som er forbundet med sværhedsgraden af invasiv candidiasis.Denne metode kan anvendes til at teste effekten af nye svampedræbende midler eller antistoffer under biofilmdannelse eller modning i forskellige indstillinger ved hjælp af forskellige svampestammer eller antistofkilder. Pankaj Chandley, en ph.d.-forsker, der arbejder i mit laboratorium, demonstrerer denne procedure. Til at begynde med tilsættes 100 mikroliter Candida tropicalis-kultur til en 96-brønds mikrotiterplade.Brug en flerkanalspipette til at fylde de sidste to kolonner med 100 mikroliter RPMI 1640 MOPS-medium alene. Dæk mikrotiterpladen med låg og aluminiumsfolie, og inkuber pladen i 24 timer ved 37 grader Celsius under stationære forhold. Den næste dag skal du opsuge mediet forsigtigt ved hjælp af en flerkanalspipette.Vend pladen forsigtigt på blottingplader, og tryk for at fjerne eventuelle resterende medier. Vask pladen med 200 mikroliter 1X PBS ved hjælp af en flerkanalspipette. Pbs aspireres omhyggeligt ved hjælp af en flerkanalspipette, og vaskes to gange med PBS.For at fjerne overskydende PBS skal du lufttørre pladen i 30 minutter ved stuetemperatur inde i et biologisk sikkerhedsskab. Forbered serielle fortyndinger af varmeinaktiverede serumprøver i sterilt RPMI 1640 MOPS-medium. Der tilsættes 100 mikroliter af den valgte serumfortynding til hver brønd på 96-brøndsmikrotiterpladen.I kolonne 10 skal du kun tilføje RPMI 1640 Mops-medium til den positive kontrol kun for svampen. Der tilsættes en fortynding af serum til 50 i alle boringer i kolonne 11 for at tjene som ikke-svamp plus serumnegativ kontrol. Efter at have dækket pladen med låg og aluminiumsfolie, inkuberes pladen i 24 timer ved 37 grader Celsius.Den næste dag, efter at have aspireret serumet forsigtigt ved hjælp af en flerkanalspipette, skal du trykke forsigtigt på den omvendte plade for at fjerne eventuelt resterende serum. Gentag PBS-vasken tre gange, og lufttør pladen i 30 minutter ved stuetemperatur inde i et biologisk sikkerhedsskab for at tørre overskydende PBS. Derefter opløses 25 milligram XTT i 50 ml filtersteriliseret Ringers laktat.Aliquot 10 ml i separate rør. Dæk det med aluminiumsfolie og opbevar det ved minus 80 grader Celsius. Opløs derefter 8,6 milligram menadion i fem milliliter acetone.Og efter at have distribueret 50 mikroliter i 100 separate mikrorør, opbevares aliquoterne ved minus 80 grader Celsius. Tag 10 ml XTT og tilsæt en mikroliter menadion for at opnå en mikromolær arbejdsløsning. Tilsæt 100 mikroliter af XTT menadonopløsningen pr. Brønd af 96-brønds mikrotiterpladen.Efter at have dækket pladen med låg og aluminiumsfolie, inkuberes pladen derefter i to timer ved 37 grader Celsius i mørket. Til sidst overføres 80 mikroliter af den farvede supernatant fra hver brønd til en frisk 96-brøndplade, og læs pladen ved 490 nanometer. Serum fra Sap2-parapsilose-immuniserede mus kunne forhindre modning af præformerede Candida tropicalis biofilm med 65% sammenlignet med 45% i serum fra Sap2-albicans og 55% i Sap2-tropicalis-immuniserede mus.Generelt var biofilmhæmning af Sap2-immunserum signifikant højere end ved sham-immunserum, som er 16% og 13% i præimmunt serum. Biofilmhæmning var tæt på ubetydelig ved brug af PBS og ingen serumkontrol. Der skal udvises størst mulig omhu under udførelsen af vasketrinnene for at forhindre afbrydelse af biofilm.XTT-opløsningen skal fremstilles lige før brug og tilsættes straks til pladen. Efter denne procedure kan brugerne evaluere effekten af nye svampedræbende midler, vaccinekandidater eller antistoffer under Candida biofilmdannelse og modning i forskellige forskningsmiljøer ved hjælp af forskellige svampestammer.

Et opløseligt tetrazoliumbaseret reduktionsassay for at evaluere virkningen af antistoffer på Candida tropicalis biofilm

Abstract