تم دعم هذا العمل بشكل مشترك من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (41877139) ، والمشاريع الرئيسية للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (41991335) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFD0800204) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (رقم BK20161616) ، وخطة "135" ، وبرنامج الحدود للأكاديمية الصينية للعلوم (ISSASIP1615).

الهدف من هذا البروتوكول هو توفير خط أنابيب عام ، من تجربة الاستزراع المائي إلى التحليل الأيضي ، وتحديد تأثير DEHP على إفرازات جذر البرسيم.
1. تجربة الزراعة المائية
ملاحظة: يقدم هذا البروتوكول مثالا على تجربة الاستزراع المائي البرسيمي المصممة للحصول على...

يوفر هذا البروتوكول إرشادات عامة حول كيفية جمع وقياس إفرازات جذر البرسيم تحت ضغط DEHP ، وكذلك كيفية تحليل بيانات الأيض. يجب إيلاء اهتمام وثيق لبعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. في تجارب الاستزراع المائي ، تم استزراع شتلات البرسيم في الماء في زجاجات زجاجية مملوءة بمحاليل مغذية بتركيزات...

Di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) هو مركب كيميائي اصطناعي يستخدم على نطاق واسع في العديد من المواد البلاستيكية والبوليمرات كملدنات لتحسين اللدونة والقوة. في السنوات القليلة الماضية ، اقترح عدد متزايد من الدراسات أن DEHP هو اضطراب الغدد الصماء وله تأثير سلبي على الجهاز التنفسي والعصبي والتناسلي للبشر والحيوانات الأخرى1،2،3. بالنظر إلى المخاطر الصحية ، صنفت وكالة حماية البيئة الأمريكية والاتحاد الأوروبي ومركز المراقبة البيئية في الصين DEHP في قائمة الملوثات ذات الأولوية. تعتبر التربة بالوعة مهمة ل DEHP في البيئة ، بسبب استخدام التغطية البلاستيكية والأسمدة العضوية ، والري بمياه الصرف الصحي ، وتطبيق مزرعة الحمأة4. كما هو متوقع ، تم اكتشاف DEHP في كل مكان في تربة الأراضي الزراعية ، والتي يصل محتواها إلى ملليغرام لكل كيلوغرام من التربة المجففة في بعض المناطق في الصين 5,6. يمكن أن يدخل DEHP النباتات بشكل رئيسي عن طريق الجذور ويخضع للتضخم الأحيائي على مستويات غذائية مختلفة في النظم الإيكولوجية للتربة7. لذلك ، أثير قلق كبير بشأن الإجهاد الناجم عن DEHP في النباتات على مدى العقود الأخيرة.
عادة ما تكون النباتات عرضة للتعرض ل DEHP. لوحظ أن إجهاد DEHP له تأثير سلبي على إنبات البذور والتمثيل الغذائي الطبيعي ، وبالتالي يمنع نمو النبات وتطوره 8,9. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي DEHP إلى حدوث ضرر تأكسدي لخلايا الميزوفيل ، وتقليل محتويات الكلوروفيل والأوسموليت ، ورفع أنشطة الإنزيم المضاد للأكسدة ، مما يؤدي في النهاية إلى انخفاض في إنتاجية وجودة النباتات الصالحة للأكل10,11. ومع ذلك ، فإن معظم الدراسات السابقة حول استجابة النباتات لإجهاد DEHP قد ركزت على الإجهاد التأكسدي والخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية. الآليات المقابلة المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي للنبات أقل دراسة. إفرازات الجذر مصطلح عام يصف المركبات التي تفرزها جذور النباتات وتطلقها في البيئة. وقد تم اعتبارها وسائط تفاعل بين النباتات وتربة الجذور ، وتلعب دورا مهما في دعم نمو النبات وتطوره12. من المعروف جيدا أن إفرازات الجذر تمثل حوالي 30٪ -40٪ من جميع الكربون الضوئي13. في البيئات الملوثة ، تشارك إفرازات الجذر في تحسين تحمل النباتات لإجهاد الملوثات من خلال التمثيل الغذائي أو الاستبعاد الخارجي14. نتيجة لذلك ، قد يساعد الفهم العميق لاستجابة إفرازات جذور النبات لإجهاد التلوث في الكشف عن الآليات الأساسية المرتبطة بالكيمياء الحيوية للخلايا والظواهر البيولوجية15.
توفر تقنية الأيض استراتيجية فعالة لقياس عدد كبير من مستقلبات الجزيئات الصغيرة في وقت واحد داخل الخلايا 16,17 ، والأنسجة18 ، وحتى إفرازات الكائناتالحية 19 ، بما في ذلك السكريات والأحماض العضوية والأحماض الأمينية والدهون. بالمقارنة مع طرق التحليل الكيميائي التقليدية أو الكلاسيكية ، فإن نهج الأيض يزيد بشكل كبير من عدد المستقلبات التي يمكن اكتشافها20 ، والتي يمكن أن تساعد في تحديد المستقلبات بطريقة إنتاجية أعلى وتحديد المسارات الأيضية الرئيسية. تم استخدام الأيض على نطاق واسع في مجال أبحاث الاستجابة البيولوجية في بيئات الإجهاد ، مثل المعادن الثقيلة21 ، والملوثات الناشئة22 ، والجسيمات النانوية19. ركزت معظم هذه الدراسات على النباتات على التغيرات الأيضية في الأنسجة النباتية الداخلية ، في حين تم الإبلاغ عن القليل منها حول استجابة إفرازات الجذر للإجهاد البيئي. لذلك ، فإن الهدف من هذه الدراسة هو تقديم إرشادات عامة لجمع إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير DEHP على إنتاج الأيض. ستوفر النتائج إرشادات طريقة لدراسة متابعة الأيض النباتي بواسطة DEHP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adonitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfalfa seeds</td>
			<td>Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>BSA124S-CW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSTFA</td>
			<td>REGIS Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with 1% TMCS, v/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Fresco17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatographic column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>DB-5MS (30 m &#215; 250 &#956;m &#215; 0.25 &#956;m)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di(2-ethylhexyl) phthalate</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAMEs</td>
			<td>Dr. Ehrenstorfer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatography(GC)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>7890A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding instrument</td>
			<td>Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd</td>
			<td>JXFSTPRP-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer(MS)</td>
			<td>LECO</td>
			<td>PEGASUS HT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>CNW Technologies</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyaminatio hydrochloride</td>
			<td>TCI</td>
			<td></td>
			<td>AR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf Quality</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHG-9023A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyridine</td>
			<td>Adamas</td>
			<td></td>
			<td>HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (pathway enrichment, topology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA16.0.2&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical analysis software (OPLS-DA etc)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra low temperature freezer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Forma 900 series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound</td>
			<td>Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd</td>
			<td>YM-080S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Taicang Huamei biochemical instrument factory</td>
			<td>LNG-T98</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate on metabolite production

إفرازات الجذر هي الوسائط الرئيسية لتوصيل المعلومات ونقل الطاقة بين جذور النباتات والبيئة المحيطة. عادة ما يكون التغيير في إفراز إفرازات الجذر استراتيجية خارجية لإزالة السموم للنباتات في ظل ظروف الإجهاد. يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم إرشادات عامة لجمع إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات (DEHP) على إنتاج المستقلب. أولا ، تزرع شتلات البرسيم تحت ضغط DEHP في تجربة الاستزراع المائي. ثانيا ، يتم نقل النباتات إلى أنابيب طرد مركزي تحتوي على 50 مل من الماء المعقم عالي النقاء لمدة 6 ساعات لجمع إفرازات الجذر. ثم يتم تجفيف المحاليل بالتجميد في مجفف تجميد بالفراغ. يتم استخراج العينات المجمدة واشتقاقها باستخدام كاشف ثنائي (ثلاثي ميثيل سيليل)) ثلاثي فلورو أسيتاميد (BSTFA). بعد ذلك ، يتم قياس المستخلصات المشتقة باستخدام نظام كروماتوجراف الغاز إلى جانب مطياف كتلة وقت الرحلة (GC-TOF-MS). ثم يتم تحليل بيانات الأيض المكتسبة بناء على طرق المعلوماتية الحيوية. يجب استكشاف المستقلبات التفاضلية ومسارات التمثيل الغذائي المتغيرة بشكل كبير للكشف عن تأثير DEHP على البرسيم في ضوء إفرازات الجذر.

في هذه التجربة ، تم جمع إفرازات جذر البرسيم واستخراجها وتحليلها وفقا للطرق المذكورة أعلاه (الشكل 1). تم إنشاء ثلاث مجموعات علاجية: السيطرة ، تركيز منخفض من DEHP (1 ملغ L − 1) ، وتركيز عال من DEHP (10 ملغ L − 1).
تم اكتشاف ما مجموعه 778 قمة في كروماتوجراف التحكم ...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production at JoVE.com

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

عادة ما يكون إفراز إفرازات الجذر استراتيجية خارجية لإزالة السموم للنباتات تحت ظروف الإجهاد. يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم تأثير xenobiotics على البرسيم من خلال التحليل الأيضي غير المستهدف.

مجموعة من إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات على إنتاج الأيض

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم تأثير xenobiotics على البرسيم أثناء تحليل الأيض غير المستهدف. هذه التقنية بسيطة للغاية ومريحة للتشغيل ويمكن تحديد المزيد من أنواع إفرازات الجذر. مما يساعد على بناء البصمة الأيضية لإفرازات جذور النبات.ابدأ تعقيم بذور ميديكاغو ساتيفا أو البرسيم عن طريق شطف البذور ب 0.1٪ هيبوكلوريت الصوديوم لمدة 10 دقائق. يليه غسل مع 75 ٪ الكحول الإيثيلي لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، شطف البذور المعقمة عدة مرات بالماء المقطر.ثم تنبتها على ورق الترشيح الرطب الموضوع في طبق بتري معقم. عند 30 درجة مئوية في الظلام. بعد الإنبات ، انقل 20 بذرة ممتلئة كبيرة نبتة بشكل موحد إلى سلة نقش في زجاجة استزراع مملوءة بمحلول مغذي.ضع جميع زجاجات الثقافة في غرفة نمو ذات ظروف مسيطر عليها. بعد أسبوعين ، انقل 15 شتلة برسيم موحدة إلى زجاجة زجاجية جديدة لتعريضها لملليغرام واحد لكل كيلوغرام و 10 ملليغرام لكل كيلوغرام إجهاد DEHP لتجربة الاستزراع. لف عبوات المعالجة والتحكم بورق الألمنيوم والبارافيلم لمنع التحلل الضوئي وتطاير DEHP.تكملة محلول المغذيات يوميا للحفاظ على مستوى السائل. ضع الزجاجات وقم بتدويرها بشكل عشوائي كل يومين لضمان ظروف نمو متسقة لشتلات البرسيم. بعد سبعة أيام من الزراعة ، قم بإزالة شتلات البرسيم من الزجاجات.واغسلها بماء عالي النقاء عدة مرات لتحضيرها لجمع إفرازات الجذر. ابدأ تجربة جمع إفرازات الجذر عن طريق نقل 10 شتلات برسيم موحدة إلى أنابيب طرد مركزي مملوءة ب 50 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات المعقم. لجمع إفرازات الجذر ، احتفظ بالأنابيب في وضع مستقيم لمدة ست ساعات مع غمر الجذور في الماء.بمجرد الانتهاء من ذلك ، لف أنابيب الطرد المركزي بورق الألمنيوم لحماية الجذور من الضوء. قم بإزالة النباتات وتجميد السائل الذي تم جمعه لتنميط الأيض. تابع تجربة الاستخراج بإضافة 1.8 ملليلتر من محلول الاستخراج إلى العينات المجففة بالتجميد.في دوامة لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، ضع الموجات فوق الصوتية على الأنابيب لمدة 10 دقائق في حمام ماء مثلج. قبل الطرد المركزي للعينات.انقل بعناية 200 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. نضح 45 ميكرولتر من المادة الطافية من أنبوب الطرد المركزي ومزجها في مراقبة الجودة أو عينات مراقبة الجودة بحجم نهائي يبلغ 270 ميكرولتر. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتجميد المستخلصات في مكثف فراغ.بمجرد اكتمال التجفيف ، أضف خمسة ميكرولترات من الريبونوكلياز القياسي الداخلي واستمر في التجفيف. بعد التبخر ، أضف 30 ميكرولترا من محلول هيدروكلوريد ميثوكسياأمينيون واحتضان الأنابيب عند 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من كاشف BSTFA إلى العينات قبل وضع الأنابيب عند 70 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة للاشتقاق.بمجرد انتهاء الحضانة ووصول العينة المشتقة إلى درجة حرارة الغرفة، أضف خمسة ميكرولترات من استرات ميثيل الأحماض الدهنية الذائبة في الكلوروفورم إلى العينات المشتقة. باستخدام عمود شعري بقياس 30 مترا × 250 ميكرومتر × 0.25 ميكرومتر ، افصل ميكرولتر واحد من إفرازات الجذر مع هيليوم غاز ناقل بمعدل تدفق 1.0 ملليلتر في الدقيقة. اضبط درجة حرارة الحقن على 280 درجة مئوية.والحفاظ على درجة حرارة خط النقل عند 280 درجة مئوية. اضبط برنامج الفرن للفصل. بعد فصل المستخلصات ، قم بإجراء قياس الطيف الكتلي في وضع تصادم الإلكترون بطاقة ناقص 70 إلكترون فولت.الحفاظ على درجة حرارة مصدر الأيونات عند 250 درجة مئوية. احصل على أطياف الكتلة باستخدام وضع مراقبة المسح الكامل مع نطاق مسح كتلي من 50 إلى 500 كتلة عن طريق الشحن بمعدل 12.5 أطياف في الثانية. تم الكشف عن 778 قمة في كروماتوجراف عينة التحكم.تم تحديد 314 مستقلبا منها وفقا لأطياف الكتلة. تم تقسيم الأحماض إلى أحماض دهنية وأحماض أمينية وأحماض عضوية وأحماض فينولية. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف أيضا عن بعض المواد الشائعة الموجودة بشكل عام في إفرازات جذر البرسيم بما في ذلك البيريميدين والهيدروكسي بيريميدين والفلافونويد والفينولات والكيتونات والبيريميدين والديتيربينات.تم رسم خريطة حرارية بناء على درجة VIP لتصور التباين في المستقلبات التفاضلية بين علاجات DEHP المختلفة. بالمقارنة مع عينات التحكم ، أدى التعرض ل DEHP إلى تغيير كبير في محتوى 50 مستقلبا وإفرازات جذر البرسيم. بما في ذلك أساسا بعض الكربوهيدرات والأحماض العضوية منخفضة الوزن الجزيئي.أظهر تحليل المسارات الأيضية أن DEHP يثبط بشكل كبير عملية التمثيل الغذائي للكربوهيدرات التي هي نتاج التمثيل الضوئي مما يشير إلى أن DEHP يمكن أن يثبط التمثيل الضوئي للبرسيم إلى حد ما ، وقد شوهد DEHP لتعزيز عملية التمثيل الغذائي للأحماض الدهنية التي تساعد على مقاومة الإجهاد من DEHP. يجب إجراء إفرازات جذر البذور على الأقل لكل علاج لضمان تحليل دقيق للبيانات الأيضية. يمكننا تحديد التمثيل الغذائي التفاضلي ومواصلة التحقيق في القواعد المهمة في السلوك البيئي للملوثات.يمكن فك رموز التفاعلات بين النباتات والمجتمع البيولوجي الميداني الأوسع في الغالب باستخدام هذه الطريقة.

مجموعة من إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات على إنتاج الأيض

Abstract