Modelos ortotópicos traslacionales del glioblastoma multiforme

Resumen

Aquí, describimos un modelo de ratón ortotópico preclínico para GBM, establecido por inyección intracraneal de células derivadas de tumores modelo de ratón genéticamente modificados. Este modelo muestra las características de la enfermedad del GBM humano. Para estudios traslacionales, el tumor cerebral de ratón se rastrea mediante resonancia magnética in vivo e histopatología.

Resumen

Los modelos de ratón genéticamente modificados (GEM) para el glioblastoma multiforme humano (GBM) son fundamentales para comprender el desarrollo y la progresión de los tumores cerebrales. A diferencia de los tumores de xenoinjerto, en los GEM, los tumores surgen en el microambiente nativo en un ratón inmunocompetente. Sin embargo, el uso de GBM GEM en estudios de tratamiento preclínico es un desafío debido a las largas latencias tumorales, la heterogeneidad en la frecuencia de las neoplasias y el momento del desarrollo del tumor de grado avanzado. Los ratones inducidos a través de la inyección ortotópica intracraneal son más tratables para estudios preclínicos y conservan las características de los tumores GEM. Generamos un modelo de tumor cerebral ortotópico derivado de un modelo GEM con aberraciones Rb, Kras y p53 (TRP), que desarrolla tumores GBM que muestran focos lineales de necrosis por células neoplásicas y vascularización densa análoga al GBM humano. Las células derivadas de tumores GEM GBM se inyectan intracranealmente en ratones receptores de tipo salvaje y reproducen tumores de grado IV, evitando así el largo período de latencia tumoral en ratones GEM y permitiendo la creación de cohortes grandes y reproducibles para estudios preclínicos. Las características altamente proliferativas, invasivas y vasculares del modelo TRP GEM para GBM se recapitulan en los tumores ortotópicos, y los marcadores histopatológicos reflejan subgrupos de GBM humanos. El crecimiento del tumor se controla mediante resonancias magnéticas seriadas. Debido a la naturaleza invasiva de los tumores intracraneales en modelos inmunocompetentes, seguir cuidadosamente el procedimiento de inyección descrito aquí es esencial para prevenir el crecimiento de tumores extracraneales.

Introducción

El glioblastoma (GBM; glioma grado IV) es el tumor cerebral más común y maligno, y las terapias actuales son ineficaces, lo que resulta en una mediana de supervivencia de 15 meses¹. Los modelos preclínicos confiables y precisos que representan las complejas vías de señalización involucradas en el crecimiento y la patogénesis del tumor cerebral son esenciales para acelerar el progreso en la evaluación de nuevos regímenes terapéuticos para GBM. Los modelos de ratón en los que las líneas celulares de tumores cerebrales humanos se implantan por vía subcutánea en ratones inmunocomprometidos no reflejan el entorno inmune nativo de los tumores cerebrales, ni pueden usarse para evaluar la capacidad de la terapéutica para cruzar la barrera hematoencefálica². Idealmente, los modelos preclínicos de ratón también deberían reproducir de cerca la histopatología del GBM humano, incluido el alto nivel de invasividad en el parénquima circundante³. Aunque los modelos de ratón genéticamente modificados (GEM) desarrollan tumores en el contexto de un sistema inmune intacto, a menudo se requieren esquemas de reproducción complicados, y los tumores pueden desarrollarse lenta e inconsistentemente⁴. Los modelos de aloinjertos derivados de GEM son más adecuados para estudios terapéuticos preclínicos, donde se necesitan grandes cohortes de ratones portadores de tumores en un período de tiempo más corto.

En un informe anterior, describimos un modelo ortotópico de ratón GBM derivado directamente de tumores GEM. La tumorigénesis en el GEM se inicia por eventos genéticos en poblaciones celulares (principalmente astrocitos) que expresan proteína ácida fibrilar glial (GFAP), que resultan en progresión a GBM. Estos TRP GEM albergan un transgén TgGZT121 (T), que expresa T121 después de la exposición a la recombinasa Cre impulsada por GFAP. La expresión de la proteína T121 da como resultado la supresión de la actividad de la proteína Rb (Rb1, p107 y p103). La coexpresión de un transgén Cre impulsado por GFAP (GFAP-CreERT2) dirige la expresión a los astrocitos adultos después de la inducción con tamoxifeno. Los ratones TRP también albergan un Kras mutante dependiente de Cre (Kras^G12D; R) alelos, para representar la activación de la vía de la tirosina quinasa receptora, y son heterocigotos para la pérdida de Pten(P)^5,6. Las aberraciones genéticas concurrentes en las redes receptoras tirosina quinasa (RTK), PI3K y RB están implicadas en el 74% de la patogénesis del GBM⁷. Por lo tanto, las vías de señalización primarias alteradas en el GBM humano están representadas por las mutaciones modificadas en ratones TRP, en particular tumores GBM, en los que se activan objetivos descendentes compartidos de RTK⁵.

El modelo ortotópico singénico derivado de GEM se validó como un modelo que recapitula las características de los tumores cerebrales humanos, incluida la invasividad y la presencia de biomarcadores de subtipo, para su uso como plataforma para evaluar la terapéutica del cáncer dirigida a vías aberrantes en GBM. Las células se cultivaron a partir de tumores cosechados de cerebros TRP y se reimplantaron en el cerebro de ratones de cepa compatible, utilizando equipos estereotácticos para la inyección intracraneal en la corteza. Este modelo ortotópico preclínico de ratón desarrolló tumores GBM que eran altamente celulares, invasivos, pleomórficos con una alta tasa mitótica y mostraban focos lineales de necrosis por células neoplásicas y vascularización densa, como se observa para el GBM humano. Los volúmenes y el crecimiento tumoral se midieron mediante imágenes de resonancia magnética (RM) in vivo .

En este informe, describimos la técnica óptima para la inyección intracraneal de células GBM primarias o líneas celulares en el cerebro de ratón de tipo salvaje, utilizando tumores TRP como ejemplo. El mismo protocolo puede adaptarse para ratones inmunocomprometidos y otras líneas celulares GBM. Se dan consejos cruciales para evitar errores comunes, como la preparación de células subóptimas o fugas de células en el lugar de inyección, y para usar correctamente el equipo estereotáctico para garantizar la reproducibilidad y confiabilidad del modelo. Para fines traslacionales, validamos el modelo mediante la detección por resonancia magnética del crecimiento de tumores cerebrales en animales vivos, la caracterización histológica y presentamos un ejemplo de tratamiento en ratones portadores de tumores.

Protocolo

El protocolo del estudio descrito aquí fue aprobado por el NCI en el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Frederick. NCI-Frederick está acreditado por AAALAC International y sigue la Política del Servicio de Salud Pública para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El cuidado de los animales se proporcionó de acuerdo con los procedimientos descritos en la "Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio" (Consejo Nacional de Investigación, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.).

1. Preparación de células para inyección

NOTA: Las células primarias de tumores cerebrales de ratón (MBR) utilizadas para este modelo se aislaron originalmente de ratones TRP GEM inducidos por tamoxifeno, como se describe en El Meskini et ^al.5. Los detalles sobre la preparación de la célula se pueden encontrar en esta referencia.

1. Realice los siguientes pasos utilizando una técnica estéril en un gabinete de bioseguridad.
2. Cultivar células tumorales cerebrales primarias in vitro hasta que alcancen la fase de crecimiento exponencial.
3. Cosechar las células en tripsina al 0,25%, y una vez que se hayan desprendido, dilúyelas con medio de crecimiento para inactivar la tripsina.
4. Granular las células por centrifugación a 400 x g y lavar con medios sin suero. Repita una vez antes de contar.
5. Cuente las celdas manualmente o con un contador de celdas automatizado. Resuspender las células en metilcelulosa estéril al 5% en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) a la concentración deseada, basándose en un volumen de inyección final de 2 μL. La concentración celular deseada puede variar según la línea celular y el modelo de tumor cerebral. Para las células GBM GEM TRP, inyectamos 2 μL de una solución de 25 x 10⁶ células/ml, o 50.000 células.

2. Tensión del ratón

1. Críe o compre una cepa de ratón apropiada que coincida con el fondo de cepa de las células tumorales cerebrales. Para las células TRP, use ratones B6D2F1/J de 9 semanas de edad (de un cruce entre hembras C57BL/6J [B6] y machos DBA/2J [D2]) como receptores de células tumorales.

3. Configuración del área quirúrgica

NOTA: Todos los pasos quirúrgicos se llevan a cabo utilizando una técnica aséptica en un ambiente limpio y desinfectado. El cirujano debe usar batas y equipo de protección personal, incluida una máscara. Las herramientas quirúrgicas deben ser esterilizadas por calor antes de su uso.

1. Coloque protectores de superficie debajo del aparato estereotáxico y en la superficie de trabajo.
2. Conecte el tubo de vinilo de la máquina de anestesia al puerto IN de la plataforma de anestesia de gas del aparato estereotáxico y otro tubo al puerto de salida.
3. Conecte la pantalla digital a una fuente de alimentación y al aparato.
4. Conecte el controlador de la microbomba (Figura 1A) a una fuente de alimentación y conecte la microbomba (Figura 1A) al brazo manipulador del aparato (consulte también las instrucciones del fabricante).
5. Ajuste la microbomba a 5,6 nL/s para la inyección de volumen de 2.000 nL.
6. Encienda el esterilizador de perlas calientes.
7. Enchufe la almohadilla térmica del ratón en el controlador de temperatura y conéctela a una fuente de alimentación. Coloque la placa en la plataforma del escenario. Ajuste la temperatura de la placa a 37 °C.
8. Carga una jeringa de precisión de 30 G, teniendo cuidado de no introducir burbujas. Inserte el émbolo y coloque la aguja. Asegúrese de agarrar la aguja solo por el cubo. Presione el émbolo hasta que una gota de la mezcla de células de metilcelulosa se dispense a través de la aguja. Limpie la aguja con una almohadilla de preparación de alcohol al 70% limpiando cuidadosamente los lados de la aguja o colocando una gasa estéril en la superficie de trabajo y secándola. Tenga cuidado de no doblar o romper la aguja.
9. Conecte la jeringa de precisión a la microbomba y gire el brazo manipulador lejos del escenario, para evitar el desplazamiento de la jeringa-aguja antes de colocar el ratón en el escenario.

4. Preparación del ratón para la cirugía

1. Anestesiar al ratón colocándolo en la cámara de inducción con el vaporizador de isoflurano ajustado al 2,5%, o de acuerdo con las directrices institucionales. Encienda el flujo de isoflurano a la nariz.
2. Transfiera el ratón al aparato estereotáxico y asegúrelo a la nariz, con los dientes superiores colocados sobre el soporte de la nariz (Figura 1B, 9). Apriete la perilla de la nariz para asegurarla (Figura 1B). Asegúrese de un nivel adecuado de anestesia realizando un pellizco en el dedo del pie para verificar el reflejo.
   1. Controle el color (rosa) de las orejas, los pies y las membranas mucosas para asegurar una oxigenación adecuada. Además, controle la frecuencia respiratoria (un aumento o disminución podría indicar la necesidad de ajustar los niveles de isoflurano).
3. Inserte barras para los oídos (Figura 1B) en ambos oídos y apriete la perilla para asegurar la cabeza.
4. Aplique ungüento para los ojos para lubricar los ojos mientras el ratón está bajo anestesia.
5. Use fórceps curvos para arrancar el pelo de la cabeza del ratón en un área aproximadamente un 150% más grande que la incisión planificada, para garantizar condiciones asépticas adecuadas.
6. Inyecte 0.5-1 mg/kg de buprenorfina SR analgesia por vía subcutánea, o use otro analgésico aprobado por el protocolo.
7. Coloque la sonda rectal del ratón para controlar la temperatura interna y prevenir la hipotermia debido a la anestesia. Mantenga la temperatura corporal del ratón entre 36,5 y 38,5 °C.
8. Desinfecte el campo quirúrgico usando círculos hacia afuera, alternando entre un exfoliante quirúrgico y etanol tres veces.
9. Usando fórceps para tensar la piel, haga una incisión de aproximadamente 1 cm con la hoja de bisturí, comenzando entre los ojos. El bregma debe ser visible a través de la incisión.
   NOTA: Para una técnica estéril adecuada, toque el sitio quirúrgico solo con las puntas de las herramientas esterilizadas y coloque las puntas de las herramientas solo sobre una superficie estéril (como el interior de un paquete de herramientas esterilizado en autoclave).
10. Use el extremo de madera del aplicador con punta de algodón para raspar el exceso de tejido conectivo, y luego el extremo de algodón de otro aplicador para que se seque.

5. Inyección celular

1. Devuelva el brazo manipulador con el accesorio de la jeringa sobre el ratón, apretando la perilla para asegurarla. Utilice las perillas X e Y en el plano horizontal para mover el soporte de la jeringa sobre bregma. Baje la aguja con la perilla Z para confirmar la posición del bregma. Establezca la consola de lectura digital en cero.
2. Utilice las perillas X e Y y la lectura digital correspondiente para mover la aguja a la posición deseada. Para la ubicación de la corteza cortical, las coordenadas apropiadas son 3 mm posterior, 2 mm lateral derecho a la bregma y 2 mm de profundidad desde la duramadre. Use la perilla Z para mover la aguja a la superficie del cráneo.
3. Perfore un orificio en el cráneo con una jeringa de 1 ml con una aguja de 25 G adjunta. Coloque el bisel de la aguja hacia la jeringa y la aguja de precisión de 30 G, y gire con cuidado el brazo manipulador hacia un lado. Con el pulgar y el dedo, haga rodar la aguja hacia adelante y hacia atrás lentamente con una presión suave hasta que la punta de la aguja perfore la tapa del cráneo.
4. Use un aplicador con punta de algodón para eliminar cualquier sangre del orificio de la aguja. Coloque el brazo manipulador en la posición adecuada con la aguja de jeringa de precisión cargada por encima del orificio. Alinee la punta de la aguja con el orificio, usando la perilla Z para bajar la aguja hasta la duramadre cerebral, y ajuste la consola de lectura digital a cero.
5. Con la perilla Z, baje la aguja 1 mm y, a continuación, espere 1 minuto. Repita hasta alcanzar la profundidad deseada (2 mm como se indica).
   NOTA: La aguja se baja lentamente para evitar daños adicionales al tejido cerebral circundante y el reflujo de la solución celular.
6. Encienda la microbomba y luego monitoree para asegurarse de que la bomba se detenga cuando se hayan inyectado 2 μL. Este proceso debería tomar aproximadamente 6 minutos a la velocidad indicada. Luego, espere 1 minuto antes de mover la aguja.

6. Extracción de la aguja y cierre de la herida

1. Levante la aguja 1 mm y luego espere 1 min. Repita hasta que la aguja esté completamente libre del cráneo.
2. Si es necesario, use un aplicador con punta de algodón para eliminar cualquier sangre del sitio de inyección.
3. Usando el extremo de madera de un aplicador con punta de algodón, tome un pequeño trozo de cera ósea (~ 1 mm) y forme un cono. Colóquelo en la abertura del cráneo, empujando la cera hacia el agujero.
4. Caliente las pinzas con un esterilizador de cuentas y úselas para derretir la cera restante en el cráneo y alisarla.
5. Coloque aproximadamente dos gotas de solución de bupivacaína (anestésico) en la incisión y use fórceps para unir los bordes de la piel.
6. Tire de la piel tensa y coloque uno o dos clips para heridas para cerrar la piel.
7. Coloque el ratón en una jaula de recuperación limpia sobre una almohadilla térmica en un área libre de corrientes de aire, y observe de cerca el ratón. Permita que el ratón se despierte completamente de la anestesia, reanudando la actividad normal, antes de devolverlo a la vivienda normal.
8. Revise el ratón diariamente después del procedimiento quirúrgico y administre el manejo del dolor, de acuerdo con las pautas institucionales.
   1. Si se utiliza buprenorfina SR (Paso 4.6) para analgesia, la fórmula de liberación sostenida dura 72 h. Repita la inyección sólo si hay dolor o malestar visible después de 72 h. Cuando se realiza correctamente, los ratones se recuperan bien de las inyecciones intracraneales y no se necesita analgesia adicional.
   2. Retire las grapas 7-10 días después de la cirugía.
9. Monitorear el crecimiento del tumor mediante imágenes de animales vivos (MRI).
   1. Eutanasia a los ratones cuando se alcanzan los puntos finales humanitarios (es decir, si el animal pierde el 20% del peso corporal o se vuelve hipotérmico).
   2. Debido a la naturaleza invasiva de estos tumores cerebrales, observe a los ratones para detectar síntomas neurológicos, como marcha desigual, parálisis parcial, giro o inclinación de la cabeza. Eutanasia a un ratón si se observa alguno de estos signos clínicos de crecimiento tumoral avanzado.

Resultados

Los ratones inyectados con células tumorales cerebrales deben ser monitoreados diariamente para detectar signos de crecimiento tumoral, como convulsiones, ataxia o pérdida de peso. El crecimiento del tumor cerebral también se puede controlar mediante una resonancia magnética a intervalos regulares. Las resonancias magnéticas semanales permiten visualizar el aumento de la carga tumoral dentro del cerebro y las mediciones del volumen tumoral (Figura 1C). En particular, los tumores TRP exh...

Discusión

Los modelos preclínicos son esenciales para la evaluación de nuevas dianas terapéuticas y nuevas estrategias de tratamiento en GBM. Los modelos de ratón genéticamente modificados para GBM tienen la ventaja de la aparición de tumores en el sitio autóctono, pero a menudo con una latencia larga y un crecimiento tumoral impredecible¹³. Los tumores modelo GEM exhiben una latencia de 4-5 meses, y la ventana de tiempo ideal para la obtención de imágenes, el reclutamiento y el tratamiento es vari...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large - 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T