새로운 3D 프린팅 홀더를 사용한 온전한 생체 외 구체의 라이브 셀 이미징

각막 상피 상처 치유는 상피 세포에서 발현되는 퓨린 성 수용체의 활성화에 의해 시작되는 이동 과정입니다. 이 활성화는 세포에서 세포로 전파되는 칼슘 동원 이벤트를 초래하며, 이는 상처 침대로의 세포 운동성을 시작하여 효율적인 상처 치유를 촉진하는 데 필수적입니다. 트링카우스-랜달 연구실은 생체 외 쥐 구체에서 각막 상처 치유 반응을 실시간으로 이미징하는 방법론을 개발했습니다. 이 접근법은 확립 된 프로토콜에 따라 안락사 된 마우스에서 손상되지 않은 지구를 핵 제거하고 칼슘 지시제 염료로 지구를 즉시 배양하는 것을 포함합니다. 이 단계에서 세포의 다른 특징을 염색하는 카운터 염색을 적용하여 이미징을 돕고 세포 랜드 마크를 보여줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 액틴을 염색하는 SiR 액틴과 세포막을 염색하는 진한 적색 원형질막 염색을 포함하여 카운터 염색에 사용되는 여러 가지 살아있는 세포 염료와 잘 작동했습니다. 상처에 대한 반응을 검사하기 위해 25G 바늘을 사용하여 각막 상피를 손상시키고 지구본을 3D 인쇄 홀더에 넣습니다. 3D 프린팅 홀더의 치수는 실험 기간 동안 지구본의 고정을 보장하도록 보정되며 다양한 크기의 눈을 수용하도록 수정할 수 있습니다. 상처 반응의 라이브 셀 이미징은 컨포칼 현미경을 사용하여 시간이 지남에 따라 조직 전체에 걸쳐 다양한 깊이에서 연속적으로 수행됩니다. 이 프로토콜을 사용하면 컨포칼 현미경에서 20x 공기 대물렌즈를 사용하여 고해상도 출판 품질의 이미지를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 다른 목표도 사용할 수 있습니다. 이는 생체 외 뮤린 글로브에서 생세포 영상의 품질을 크게 개선했으며 신경과 상피의 식별을 허용합니다.