Live-Cell Imaging av intakt Ex Vivo Globes Bruke en roman 3D-trykt holder

Kornealepitelial sårheling er en migrerende prosess initiert ved aktivering av purinerge reseptorer uttrykt på epitelceller. Denne aktiveringen resulterer i kalsiummobiliseringshendelser som forplanter seg fra celle til celle, som er avgjørende for å initiere cellulær motilitet i sårsengen, og fremmer effektiv sårheling. Trinkaus-Randall-laboratoriet har utviklet en metodikk for å avbilde hornhinnens sårhelingsrespons i ex vivo murine globuser i sanntid. Denne tilnærmingen innebærer å enukleere en intakt klode fra en mus som har blitt avlivet i henhold til etablerte protokoller og umiddelbart inkubere kloden med et kalsiumindikatorfargestoff. En motbeis som flekker andre funksjoner i cellen, kan brukes på dette stadiet for å hjelpe til med avbildning og vise cellulære landemerker. Protokollen fungerte bra med flere forskjellige levende cellefarger som ble brukt til motfarging, inkludert SiR-aktin for å farge aktin og dyprød plasmamembranflekk for å farge cellemembranen. For å undersøke responsen på et sår, er hornhinneepitelet skadet ved hjelp av en 25 G nål, og globusene er plassert i en 3D-trykt holder. Dimensjonene til den 3D-printede holderen er kalibrert for å sikre immobilisering av kloden gjennom hele eksperimentets varighet og kan endres for å imøtekomme øyne av forskjellige størrelser. Levende celleavbildning av sårresponsen utføres kontinuerlig på ulike dybder i vevet over tid ved hjelp av konfokalmikroskopi. Denne protokollen lar oss generere bilder med høy oppløsning i publikasjonskvalitet ved hjelp av et 20x luftmål på et konfokalmikroskop. Andre mål kan også brukes til denne protokollen. Det representerer en betydelig forbedring i kvaliteten på levende cellebilder i ex vivo murine globuser og tillater identifisering av nerver og epitel.