تم دعم LM-B و IMG و AT و IS من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة GM055246 الممنوحة ل LM-B. حصلت GC-C على زمالة UC MEXUS-CONACYT لما بعد الدكتوراه لمدة عامين متتاليين: AY 2017-18 و 2018-19. نشكر بشدة الطلاب Sage Chavez و Pepper St. Clair من برنامج التوجيه الذي ترعاه مؤسسة Genentech Foundation لشبكة الإلهام الأكاديمي (GAIN) لدعمهم الفني في التجارب.

<ol>
	<li>Lederberg, J., Tatum, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+recombination+in+Escherichia+coli.">Gene recombination in Escherichia coli.</a> Nature. 158 (4016), 558 (1946).</li><li>de la Cruz, F., Frost, L. S., Meyer, R. J., Zechner, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+DNA+metabolism+in+Gram-negative+bacteria.">Conjugative DNA metabolism in Gram-negative bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (1), 18-40 (2010).</li><li>Grohmann, E., Muth, G., Espinosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+plasmid+transfer+in+gram-positive+bacteria.">Conjugative plasmid transfer in gram-positive bacteria.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (2), 277-301 (2003).</li><li>Koraimann, G., Wagner, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+behavior+and+decision+making+in+bacterial+conjugation.">Social behavior and decision making in bacterial conjugation.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 54 (2014).</li><li>Dziewit, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+role+of+plasmids+in+adaptation+of+bacteria+inhabiting+the+Lubin+copper+mine+in+Poland,+an+environment+rich+in+heavy+metals.">Diversity and role of plasmids in adaptation of bacteria inhabiting the Lubin copper mine in Poland, an environment rich in heavy metals.</a> Frontiers in Microbiology. 6, 152 (2015).</li><li>Smillie, C., Garcill&#225;n-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+plasmids.">Mobility of plasmids.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).</li><li>Balbuena-Alonso, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+plasmid+content+in+food+isolates+of+E.+coli+strongly+supports+its+role+as+a+reservoir+for+the+horizontal+transfer+of+virulence+and+antibiotic+resistance+genes.">Genomic analysis of plasmid content in food isolates of E. coli strongly supports its role as a reservoir for the horizontal transfer of virulence and antibiotic resistance genes.</a> Plasmid. 123-124, 102650 (2022).</li><li>San Millan, A., MacLean, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+costs+of+plasmids:+A+limit+to+plasmid+transmission.">Fitness costs of plasmids: A limit to plasmid transmission.</a> Microbiol Spectrum. 5 (5), (2017).</li><li>Coluzzi, C., Garcill&#225;n-Barcia, M. P., de la Cruz, F., Rocha, E. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+plasmid+mobility:+Origin+and+fate+of+conjugative+and+nonconjugative+plasmids.">Evolution of plasmid mobility: Origin and fate of conjugative and nonconjugative plasmids.</a> Molecular Biology and Evolution. 39 (6), 1-23 (2022).</li><li>Bevan, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+plasmids+encoding+blaCTX-M+from+faecal+Escherichia+coli+in+travellers+returning+to+the+UK+from+South+Asia.">Molecular characterization of plasmids encoding blaCTX-M from faecal Escherichia coli in travellers returning to the UK from South Asia.</a> The Journal of Hospital Infection. 114, 134-143 (2021).</li><li>Minja, C. A., Shirima, G., Mshana, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+plasmids+disseminating+CTX-M-15+among+human,+animals+and+the+environment+in+Mwanza+Tanzania:+a+need+to+intensify+one+health+approach.">Conjugative plasmids disseminating CTX-M-15 among human, animals and the environment in Mwanza Tanzania: a need to intensify one health approach.</a> Antibiotics. 10 (7), 836 (2021).</li><li>Carattoli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmids+and+the+spread+of+resistance.">Plasmids and the spread of resistance.</a> International Journal of Medical Microbiology. 303 (6-7), 298-304 (2013).</li><li>Sengupta, M., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+significance+of+plasmid+maintenance+functions+in+the+virulence+plasmids+of+pathogenic+bacteria.">Prevalence and significance of plasmid maintenance functions in the virulence plasmids of pathogenic bacteria.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2502-2509 (2011).</li><li>Alderliesten, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+donor-recipient+relatedness+on+the+plasmid+conjugation+frequency:+a+meta-analysis.">Effect of donor-recipient relatedness on the plasmid conjugation frequency: a meta-analysis.</a> BMC Microbiology. 20 (1), 135 (2020).</li><li>Neil, K., Allard, N., Rodrigue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+influencing+bacterial+conjugation+in+the+intestinal+microbiota.">Molecular mechanisms influencing bacterial conjugation in the intestinal microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 673260 (2021).</li><li>Liu, G., Bogaj, K., Bortolaia, V., Olsen, J. E., Thomsen, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced,+increased+conjugative+transfer+is+common+to+diverse+naturally+occurring+ESBL+plasmids+in+Escherichia+coli.">Antibiotic-induced, increased conjugative transfer is common to diverse naturally occurring ESBL plasmids in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2119 (2019).</li><li>Suchman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction+protocol.">Polymerase chain reaction protocol.</a> American Society for Microbiology. , 1-14 (2011).</li><li>Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+heredity+of+multiple+drug+resistance+in+bacteria.">Infective heredity of multiple drug resistance in bacteria.</a> Bacteriological Reviews. 27 (1), 87-115 (1963).</li><li>Simonsen, L., Gordon, D. M., Stewart, F. M., Levin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+rate+of+plasmid+transfer:+an+end-point+method.">Estimating the rate of plasmid transfer: an end-point method.</a> Journal of General Microbiology. 136 (11), 2319-2325 (1990).</li><li>Huisman, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+plasmid+conjugation+rates:+A+new+computational+tool+and+a+critical+comparison+of+methods.">Estimating plasmid conjugation rates: A new computational tool and a critical comparison of methods.</a> Plasmid. 121, 102627 (2022).</li><li>Jung, B., Hoilat, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MacConkey+medium.">MacConkey medium.</a> StatPearls. , (2022).</li><li>. NucleoSpin Plasmid DNA purification Available from: <a target="_blank" href="https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf">https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf</a> (2022)</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+extended-spectrum+beta-lactamases+in+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa.">Detection of extended-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9), 2990-2995 (2006).</li><li>Stapleton, P. D., Shannon, K. P., French, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbapenem+resistance+in+Escherichia+coli+associated+with+plasmid-determined+CMY-4+beta-lactamase+production+and+loss+of+an+outer+membrane+protein.">Carbapenem resistance in Escherichia coli associated with plasmid-determined CMY-4 beta-lactamase production and loss of an outer membrane protein.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (5), 1206-1210 (1999).</li><li>Ben Yahia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+CTX-M-15+harboring+Escherichia+coli+isolated+from+wild+birds+in+Tunisia.">Detection of CTX-M-15 harboring Escherichia coli isolated from wild birds in Tunisia.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 26 (2018).</li><li>Madsen, L., Aarestrup, F. M., Olsen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+streptomycin+resistance+determinants+in+Danish+isolates+of+Salmonella+Typhimurium.">Characterisation of streptomycin resistance determinants in Danish isolates of Salmonella Typhimurium.</a> Veterinary Microbiology. 75 (1), 73-82 (2000).</li><li>Perreten, V., Boerlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sulfonamide+resistance+gene+(sul3)+in+Escherichia+coli+is+widespread+in+the+pig+population+of+Switzerland.">A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (3), 1169-1172 (2003).</li><li>Guardabassi, L., Dijkshoorn, L., Collard, J. M., Olsen, J. E., Dalsgaard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+in-vitro+transfer+of+tetracycline+resistance+determinants+in+clinical+and+aquatic+Acinetobacter+strains.">Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains.</a> Journal of Medical Microbiology. 49 (10), 929-936 (2000).</li><li>Carattoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plasmids+by+PCR-based+replicon+typing.">Identification of plasmids by PCR-based replicon typing.</a> Journal of Microbiological Methods. 63 (3), 219-228 (2005).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis.">Agarose gel electrophoresis.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2019 (1), (2019).</li><li>Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SYBR+Green+I+nucleic+acid+gel+stain+mutagenicity+and+ethidium+bromide+mutagenicity+in+the+Salmonella/mammalian+microsome+reverse+mutation+assay+(Ames+test).">Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test).</a> Mutation Research. 439 (1), 37-47 (1999).</li><li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+SYBR+Gold+nucleic+acid+gel+stain:+a+dye+optimized+for+use+with+300-nm+ultraviolet+transilluminators.">Characterization of SYBR Gold nucleic acid gel stain: a dye optimized for use with 300-nm ultraviolet transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268 (2), 278-288 (1999).</li><li>Oatey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+fluorescently+stained+DNA+with+CCD+technology+How+to+increase+sensitivity+and+reduce+integration+times.">Imaging fluorescently stained DNA with CCD technology How to increase sensitivity and reduce integration times.</a> Biotechniques. 42 (3), 376-377 (2007).</li><li>Norman, A., Hansen, L. H., S&#248;rensen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugative+plasmids:+vessels+of+the+communal+gene+pool.">Conjugative plasmids: vessels of the communal gene pool.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 364 (1527), 2275-2289 (2009).</li><li>Du, L., Liu, R. H., Ying, L., Zhao, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+intergeneric+conjugation+of+DNA+from+Escherichia+coli+to+mycelia+of+the+lincomycin-producer+Streptomyces+lincolnensis.">An efficient intergeneric conjugation of DNA from Escherichia coli to mycelia of the lincomycin-producer Streptomyces lincolnensis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13 (4), 4797-4806 (2012).</li><li>Kirk, J. A., Fagan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+increases+conjugation+efficiency+in+Clostridium+difficile.">Heat shock increases conjugation efficiency in Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 42, 1-5 (2016).</li><li>Esteves, G. M., Pereira, J. A., Azevedo, N. F., Azevedo, A. S., Mendes, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+with+benefits:+An+inside+look+of+periodontal+microbes'+interactions+using+fluorescence+in+situ+hybridization-Scoping+review.">Friends with benefits: An inside look of periodontal microbes' interactions using fluorescence in situ hybridization-Scoping review.</a> Microorganisms. 9 (7), 1504 (2021).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

توفر البلازميدات الاقترانية الوصول إلى مجموعة مشتركة من الجينات داخل بيئة بيئية معينة من خلال إعادة التركيب ونقل الجينات الأفقي34. وبالتالي ، فإن البلازميدات المترافقة هي كيانات تطورية قادرة على اكتساب ومنح الوظائف التي تسمح للبكتيريا بالتكيف مع ظروف متعددة (بما في ذلك مقاومة المضادات الحيوية ، ومقاومة المعادن ، واكتساب المعادن ، وتكوين الأغشية الحيوية ، والجينات المسببة للأمراض ، من بين أمور أخرى) في غضون ساعات زمنية.
يقدم هذا العمل بروتوكولا لتحديد البلازميدات المترافقة في البكتيريا. ولكي يعمل البروتوكول، تحتاج العلامات المستخدمة إلى التمييز بين سلالات المتبرعين والمتلقين، كما هو موضح في الضوابط في الوسيطين ألف وباء. يحتاجون أيضا إلى اختيار الخلايا التي تحمل البلازميد بشكل فعال. رد فعل التزاوج أمر بالغ الأهمية. في رد الفعل هذا ، يحتاج المتبرعون والمتلقون إلى إجراء اتصال طويل الأمد (من خلال pili) لحدوث الاقتران. أي شيء يمكن أن يعطل الاتصال من خلية إلى خلية ، مثل عدم كفاية وقت الحضانة أو هز أو تحريك الثقافة ، وبالتالي يقلل من كفاءة الاقتران. يعد اختيار المتلقي أمرا بالغ الأهمية أيضا ، حيث أن بعض سلالات المتلقي مقاومة للاقتران35,36. يقترح LMB100 كمتلقي للاختيار ، لأنه قادر على أخذ البلازميدات من أنواع متعددة من عدم التوافق.
معدل الاقتران محدد لكل زوج كروموسوم مانح للبلازميد ومتلقي وحالة بيئية. تم العثور على اقتران بلازميدات معينة لتكون حساسة لعدد كبير من المتغيرات ، بما في ذلك مرحلة النمو ، وكثافة الخلية ، ونسبة المتبرع إلى المتلقي ، سواء تم إجراء الاقتران في الوسائط السائلة أو الصلبة ، والكربون ، والأكسجين ، والأملاح الصفراوية ، وتركيزات المعادن ، ووجود خلايا الثدييات ، ودرجة الحرارة ، ودرجة الحموضة ، ووقت التزاوج13،14،15 . تعتمد دراسة هذه التفاعلات على الكشف الأولي عن البلازميد الاقتراني المراد دراسته بعمق. وبالتالي ، يمكن أيضا تعديل البروتوكول الموصوف هنا لاستكشاف تأثير المتغيرات التجريبية المختلفة ، على الرغم من أن هذا يأتي على حساب تقييد عدد المتبرعين الذين تم فحصهم. يمكنه أيضا تحديد البلازميدات القابلة للتعبئة في المضيفين الذين لديهم بلازميدات مساعدة (أي البلازميدات التي تمكن من الاقتران من خلال توفير وظائف مفقودة من البلازميدات القابلة للتعبئة في trans6).
يوصى بمعرفة تسلسل البلازميد الاقتراني (ولكن ليس من الضروري اكتشاف الاقتران ، كما نوقش أعلاه). عندما يكون المتبرعون سلبيين للاكتوز (ينتجون مستعمرات صفراء على أجار MacConkey) ، يمكن استخدام متلقي إيجابي اللاكتوز (ينتج مستعمرات وردية على أجار MacConkey) لتمييز المرافقات الحقيقية عن الخلايا المانحة القادرة على النمو على الوسائط لاختيار المرافقات. تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا للكشف عن البلازميدات المترافقة من الأعضاء البيئيين والمتعايشين والممرضين من عائلة Enterobacteriaceae. ومع ذلك ، يمكن استخدامه مع أي نوع بكتيري مع متبرع مناسب ، ومتلقي ، ومضاد حيوي (مضادات حيوية) ، وعلامات لون. يتطلب تحديد هذه المكونات الحرجة في البكتيريا الأخرى دراسات منهجية باستخدام العديد من المتبرعين والمتلقين والعلامات (المضادات الحيوية والألوان). لم يتم اختبار هذا البروتوكول في البكتيريا إيجابية الجرام.
تم الإبلاغ عن العديد من المتغيرات للطريقة المعروضة هنا في الأدبيات ، التي تمت مراجعتها مؤخرا20. يمكن أيضا الإشارة إلى النتيجة النوعية بطرق مختلفة (على سبيل المثال ، تردد الاقتران وتردد نقل الجينات) ، ويمكن استخدام الوحدات عديمة الأبعاد للإبلاغ عن كفاءة الاقتران (mL / CFU x h)20.
يحل البروتوكول الموصوف هنا العديد من القيود التي لم يتم تناولها سابقا بواسطة الطرق الحالية16،18،19،20. أولا ، تم تحديد المتلقي المناسب. ثانيا ، إن استخدام اثنين من المضادات الحيوية (ريفامبين وستربتومايسين) لاختيار ترانسكونوجينات حقيقية يقلل من احتمال أن يطور المتبرعون مقاومة لأحد المضادات الحيوية المستخدمة لاختيار المرافقات العابرة من خلال الطفرات التلقائية. يمكن أن تنتج المرافقات الكاذبة أيضا عن حماية المارة عن طريق التحلل المائي للمضاد الحيوي المستخدم لاختيار المرافقات بواسطة الإنزيمات (مثل بيتا لاكتاماز) التي تنتجها المتبرعة بكميات كبيرة. ثالثا ، يتم تضمين العديد من الضوابط التجريبية للتأكد من أن منتج التزاوج هو ترافق حقيقي (أي خلية متلقية أدرجت بثبات البلازميد المترافق للمتبرع). هنا ، قدمنا طريقتين مستقلتين لاختبار صحة المرافقات ، وهما علامة لونية في MacConkey agar ، واكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل للريبأيكون والجينات المقاومة للمضادات الحيوية للبلازميد المترافق في المتلقي. أيضا ، تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا لعزل وتوصيف البلازميدات المترافقة من الأعضاء البيئيين والمتعايشين والممرضين في عائلة Enterobacteriaceae (Escherichia ، Klebsiella ، Enterobacter ، Citrobacter ، السالمونيلا ، الشيغيلة ، والأنواع الأخرى).
لفهم آليات الاقتران ، تم نمذجة الملاحظات التجريبية باستخدام المحاكاة الحاسوبية. تقدر هذه النماذج التنبؤية تواتر نقل البلازميد لكثافات نمو معينة للمتبرعين والمتلقين والمترافقنات. وجد نموذج يعرف باسم نموذج نقطة النهاية عتبات فوقها معدل نقل البلازميد في الثقافة السائلة ، وخلص إلى أن معدل النقل لا يتأثر بكثافة الخلية ، ونسبة المتبرع: المتلقي ، وزمنالتزاوج 19. تم استخدام التهجين الفلوري في الموقع (FISH) كطريقة بديلة للكشف عن البلازميد المترافق. يسمح FISH بتصور البلازميد باستخدام المجهر الفلوري من خلال تهجين مسبار الحمض النووي والحمض النووي المستهدف. وبالتالي ، يسمح FISH بالكشف البصري عن تدفقات البلازميد عبر مجموعات الخلاياالمختلفة 37 ، على الرغم من أنه لا يتمتع بنفس مستوى الحساسية مثل الطريقة المعروضة هنا إذا تم الكشف عن الاقتران عن طريق الفحص البصري بدلا من الاختيار.
هناك حاجة هائلة لفهم بيولوجيا البلازميدات المترافقة التي تعمل على تشتيت الجينات المقاومة للمضادات الحيوية من خلال مكونات مختلفة من النظام البيئي (العيادة ، والزراعة ، والصرف الصحي ، والحياة البرية ، والحيوانات الأليفة ، والتربة ، والأنهار ، والبحيرات). باختصار، تسهل الظروف التجريبية المبسطة المقدمة في البروتوكولات الموصوفة هنا فحص المتبرعين على نطاق واسع، وبالتالي تمثل أداة رئيسية لدراسة نقل الجينات الأفقي الذي ينشأ في البلازميدات المترافقة من مجموعة متنوعة من المصادر. يمكن استخدامها للتحقيق في انتشار الجينات المقاومة للمضادات الحيوية أو غيرها من الجينات ذات الصلة سريريا في البلازميدات المترافقة من مصادر وبكتيريا متعددة. يمكن أيضا تكييفها لدراسة الاقتران في الجسم الحي (على سبيل المثال ، في أمعاء الفقاريات) ودراسة الظروف التي تعدل كفاءة الاقتران. وستضيف كل هذه الدراسات إلى حد كبير إلى فهم كيفية مساهمة تعبئة البلازميدات المترافقة المقاومة للأدوية المتعددة في انتشار مقاومة الأدوية المتعددة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube racks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-313630</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL conical tubes</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>149597</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL tube racks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8850</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0552G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL sterile flasks&#160;</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>5320</td>
			<td>It can be replaced for another permanent marker brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (molecular biology grade, multipurpose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td>C-103-50</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculating loops: 1 &#181;L</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye 6x&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP119-500</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital scale</td>
			<td>Denver Instrument</td>
			<td>APX-2001</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf conical tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-282-302</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment for agarose gel electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FP300</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-resistant markers</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>37001; 37002; 37003</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation systems (UVP GelSolo)</td>
			<td>Analytakjena</td>
			<td>SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>X-GEN</td>
			<td>44-100M</td>
			<td>Any nitrile gloves brand works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>432128</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey agar&#160;</td>
			<td>BD DIFCO</td>
			<td>212123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix&#160;</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>M0496S&#160;</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes: 2.0 mL</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton agar</td>
			<td>BD DIFCO</td>
			<td>DF0479-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton broth</td>
			<td>BD DIFCO</td>
			<td>275730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740588. 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube racks</td>
			<td>AXYGEN&#160;</td>
			<td>&#160;R96PCRFSP</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes (0.2 mL)</td>
			<td>AXYGEN&#160;</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-164-7517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 &#956;L (P10), 2&#8211;20 &#956;L (P20), 20&#8211;200 &#956;L (P200) and 200&#8211;1000 &#956;L (P1000)</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td>
			<td>Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>335905P</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized tips for 10 &#956;L, 200 &#956;L and 1000 &#956;L&#160;</td>
			<td>Eclipse</td>
			<td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler C1000 Touch&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of horizontal gene transfer mediated by natural conjugative plasmids in e. coli

يمثل الاقتران إحدى الآليات الرئيسية التي تسهل نقل الجينات الأفقي في البكتيريا سالبة الجرام. يصف هذا العمل طرق دراسة تعبئة البلازميدات المترافقة التي تحدث بشكل طبيعي ، باستخدام اثنين من البلازميدات التي تحدث بشكل طبيعي كمثال. تعتمد هذه البروتوكولات على الوجود التفاضلي للعلامات القابلة للاختيار في البلازميد المتبرع والمتلقي والاقتران. على وجه التحديد ، تشمل الطرق الموصوفة 1) تحديد البلازميدات المترافقة الطبيعية ، 2) القياس الكمي لمعدلات الاقتران في الثقافة الصلبة ، و 3) الكشف التشخيصي للجينات المقاومة للمضادات الحيوية وأنواع ريبليكون البلازميد في المستقبلات عبر الاقتران بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تم تطوير البروتوكولات الموصوفة هنا في سياق دراسة البيئة التطورية لنقل الجينات الأفقي ، للكشف عن وجود البلازميدات المترافقة التي تحمل جينات مقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا الموجودة في البيئة. إن النقل الفعال للبلازميدات المترافقة التي لوحظت في هذه التجارب في الثقافة يسلط الضوء على الأهمية البيولوجية للاقتران كآلية تعزز نقل الجينات الأفقي بشكل عام وانتشار مقاومة المضادات الحيوية بشكل خاص.

بالنظر إلى أن المتبرعين SW4955 و SW7037 قد تم تسلسلهما ، فمن المتوقع أن يكون لهاتين السلالتين المانحتين الأنماط الظاهرية المقاومة المقابلة لملف تعريف جين المقاومة المحدد في تسلسلهما الجينومي. يحتوي Plasmid p134797 (من SW4955) على جينات تمنح مقاومة للجيل الثالث من السيفالوسبورينات (blaCTX-M-55) ، ومقاومة للأمينوغليكوزيدات (aac (3) -IIa و aadA1) ، الفينيكول (catA2) ، التتراسيكلين (tet (A)) ، تريميثوبريم (dfrA14) ، والسلفوناميدات (sul3) ؛ لم يتم العثور على جينات مقاومة للمضادات الحيوية في كروموسوم SW4955. يحمل Plasmid p101718 (من SW7037) جينا واحدا فقط لمقاومة المضادات الحيوية (bla CMY-2) ، ومن المتوقع أن يمنح مقاومة للجيل الثالث من السيفالوسبورينات (blaCTX-M-55). مرة أخرى لم يتم العثور على جينات مقاومة للمضادات الحيوية في كروموسوم SW7037.
بعد التزاوج ، كان من المتوقع اكتشاف نقل البلازميدات المترافقة التي تحمل جميع جينات المقاومة المذكورة أعلاه. يشير اكتشاف الاقتران الإيجابي إلى أن المتلقين الذين تم تحديدهم على أنهم ترانسكونارت يجب أن يكونوا قد اكتسبوا البلازميدات الاقترانية. كان من المتوقع أيضا وجود جينات المقاومة التشخيصية للبلازميدات المترافقة في المترافقات (كما تم اكتشافها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل).
لتوضيح الطرق الموضحة هنا ، تم اختبار قدرة عزلتين بيئيتين من الإشريكية القولونية على نقل الحمض النووي البلازميد عن طريق الاقتران. يظهر تمثيل تخطيطي للإعداد التجريبي في الشكل 1. تم تزاوج اثنين من المتبرعين (E. coli SW4955 و SW7037) ومتلقي واحد (E. coli LMB100) بشكل مستقل. يوضح الشكل 2 الخريطة الجينية للبلازميدات المترافقة الموجودة في الإشريكية القولونية SW4955 (p134797) وSW7037 (p101718).
تم اختيار البلازميدات الاقترانية مع الكربينيسيلين واختيارها باستخدام ريفامبين والستربتومايسين ، والتي توجد محددات مقاومتها في كروموسوم المتلقي. تم استخدام MacConkey agar لتمييز المتبرعين إيجابيي اللاكتوز (الذين ينتجون مستعمرات كبيرة وردية) من المتلقي و transconjuants (التي تكون سلبية اللاكتوز وتنتج مستعمرات صفراء شاحبة أصغر) (الشكل 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig03.jpg"> الشكل 3: رسم توضيحي لعلامات الألوان التفاضلية لمستعمرات المانحين والمتلقين على أجار MacConkey. المستعمرات المقابلة للمتبرعين وردية اللون على أجار MacConkey لأنها إيجابية اللاكتوز. هذا يميز المتبرع عن المستعمرات المتلقية ، والتي تكون صفراء شاحبة وأصغر (سلبية اللاكتوز). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تم الكشف عن تعبئة البلازميد الاقتراني p134797 ، مع كل من المضادات الحيوية الخمسة المقابلة للفئات الخمس المختلفة من جينات المقاومة الموجودة في البلازميد.
يتم تقديم مثال على كيفية حساب كفاءة الاقتران (CE) للسلالة SW4955. من الفحص مع سلالة SW4955 ، تم حساب 172 CFU من transconjuants في اللوحة من التخفيف 10-2 ؛ كان عدد المتلقي من التخفيف المقابل (10-2) 10,300,000 CFU / مل (الجدول 4).
يتم حساب CE على النحو التالي:
CE = (174 CFU / مل) / (10,300,000 CFU / مل)
CE = 1.67 × 10-5 مترافقات / مستلم
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="2">ل مب 100</td>
			<td>ترانسكونكورات من سلالة SW4955 مختارة مع كاربليسيلين</td>
			<td rowspan="2">كفاءة الاقتران</td>
		</tr><tr><td>التخفيف</td>
			<td>CFU (لوحة قابلة للعد)</td>
			<td>تقريبا.CFU / مل</td>
			<td>CFU (لوحة قابلة للعد)</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>متلاقى</td>
			<td>1.03E+09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-1</td>
			<td>متلاقى</td>
			<td>1.03E+08</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-2</td>
			<td>متلاقى</td>
			<td>10300000</td>
			<td>172</td>
			<td>1.67 × 10-5 مترافقات / مستلم</td>
		</tr><tr><td>10-3</td>
			<td>متلاقى</td>
			<td>1030000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-4</td>
			<td>متلاقى</td>
			<td>103000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-5</td>
			<td>متلاقى</td>
			<td>10300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-6</td>
			<td>متلاقى</td>
			<td>1030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-7</td>
			<td>103</td>
			<td>103</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">يتم تمييز القيم المستخدمة لحساب CE بالخط العريض.</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 4: مثال على كيفية حساب كفاءة الاقتران (CE) للسلالة SW4955.
تظهر النتائج في الجدول 5 ، معبرا عنها بكفاءة الاقتران لكل مستلم. كانت كفاءات الاقتران الخمسة التي تم الحصول عليها باستخدام السلالة SW4955 كمتبرع كلها ضمن نفس الترتيب من حيث الحجم. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن الكشف عن تعبئة البلازميد الاقتراني بغض النظر عن الاختيار المستخدم لتحديد هوية الاقتران المرافق.
باستخدام السلالة SW7037 كجهة مانحة ، كانت كفاءة الاقتران التي تم الحصول عليها أقل بثلاث مرات. تسمح هذه النتائج بمقارنة كفاءات الاقتران لمختلف الجهات المانحة وأنواع البلازميد مع نفس المتلقين.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="5">كفاءة الاقتران</td>
		</tr><tr><td>وتر</td>
			<td>كاربينيسيلين (100 ملغم/لتر)</td>
			<td>جنتاميسين (2 ملغ/لتر)</td>
			<td>الكلورامفينيكول (25 ملغم/لتر)</td>
			<td>التتراسيكلين (10 ملغم/لتر)</td>
			<td>تريميثوبريم (20 ملغ/لتر)</td>
		</tr><tr><td>SW4955</td>
			<td>1.67 س 10-5</td>
			<td>5.67 س 10-5</td>
			<td>2.17 س 10-5</td>
			<td>7.62 س 10-5</td>
			<td>1.36 س 10-5</td>
		</tr><tr><td>SW7037</td>
			<td>2.14 س 10-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>الجدول 5: كفاءات اقتران سلالات المتبرعين بالإشريكية القولونية SW4955 و SW7037 اعتمادا على المضاد الحيوي المستخدم في الاختيار.
في الاقتران ، تم فحص وجود replicons وجميع جينات المقاومة المشفرة في اثنين من البلازميدات الاقترانية التي تم اختبارها ، والردود المقابلة لها ، بواسطة PCR. يوضح الجدول 3 الظروف المستخدمة لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصية هذه.
المواد الهلامية التشخيصية موضحة في الشكل 4. تؤكد هذه المواد الهلامية وجود replicons المتوقعة في الاقتران (IncFIC و IncFIB في p1347975 ، و IncI1 في p101718). كما أنها تؤكد وجود جينات مقاومة المضادات الحيوية المتوقعة ، وهي مجموعة bla CTX-M-55 (بيتا لاكتام) ، و aac (3) -II و aadA (أمينوغليكوزيد) ، و catA2 (فينيكول) ، و tet (A) (التتراسيكلين) ، و dfrA14 (تريميثوبريم) ، و sul3 (السلفوناميد) ل p1347975 ، و blaCMY-2 ل p101718 (الشكل 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig04.jpg"> الشكل 4: المواد الهلامية التشخيصية للرحلان الكهربائي. هلام الكهربائي من منتجات PCR من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية و replicons البلازميد وجدت في البلازميدات المترافقة p134797 و p101718 في الخلايا المانحة (سلالات SW4955 و SW7037 ، على التوالي) وفي الترانسكونجوجات LMB100 المقابلة. تم استخدام Carbenicillin لاختيار البلازميد. الاختصارات. -: السيطرة السلبية (تم استخدام الحمض النووي للسلالة LMB100 كعنصر تحكم سلبي) ؛ د: المانح. T: مترافق. أحجام amplicon المتوقعة: blaCTX-M-55: 864 pb ؛ aac(3)-IIa: 237 نقطة أساس; aadA1: 283 نقطة أساس ؛ catA2: 225 نقطة أساس ؛ تيت (أ): 957 نقطة أساس ؛ dfrA14: 302 نقطة أساس ؛ SUL3: 799 BP ؛ IncFIC(FII): 262 نقطة أساس; IncFIB: 683 نقطة أساس. blaCMY-2: 1855 نقطة أساس ؛ IncI1-I: 139 نقطة أساس. يحتوي الجل على 1٪ أغاروز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli at JoVE.com

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

يتوسط الاقتران في نقل الجينات الأفقي عن طريق تعبئة الحمض النووي البلازميد عبر خليتين مختلفتين ، مما يسهل انتشار الجينات المفيدة. يصف هذا العمل طريقة مستخدمة على نطاق واسع للكشف الفعال عن نقل البلازميد الاقتراني ، بناء على استخدام العلامات التفاضلية في البلازميد المترافق والمتبرع والمتلقي للكشف عن الاقتران التبادلي.

الكشف عن نقل الجينات الأفقي بوساطة البلازميدات المترافقة الطبيعية في الإشريكية القولونية

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

تحمل البكتيريا مثل E.coli جينات مقاومة للمضادات الحيوية في البلازميدات المترافقة. يمكن العثور على هذه البكتيريا في المستشفيات ، وتعيش كمتعايشات في الحيوانات ، وفي البيئات المائية. البلازميدات المترافقة الطبيعية النقل الأفقي للجينات بين السلالات البكتيرية المختلفة.نقدم المعادن للكشف عن البلازميدات المترافقة وكفاءة اقتران التكوين. هذه التقنية بسيطة وحساسة. إنه حساس لأنه يستخدم علامات للبلازميد والمتبرع والمتلقي.هذه العلامات قابلة للاختيار ، مما يعني أنه يمكنها تحديد الأحداث الفردية في مجموعات سكانية كبيرة جدا. البروتوكولات التي نقدمها مفيدة لدراسة تطور مقاومة المضادات الحيوية والمراقبة الوبائية ، أي مراقبة تدفق الجينات المقاومة للأدوية. سيوضح الإجراء كايسون وارنر ، طالب دكتوراه من مختبري ، وبيبر سانت كلير ، طالب جامعي من مختبر CAMS.في اليوم الأول ، قم بخط المتبرعين والمتلقي بشكل منفصل من مخزون الجلسرين على الوسائط C وهو MacConkey agar بدون مضادات حيوية واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم الثاني ، قم بتسمية أنبوب مزرعة سعة 14 ملليلتر لكل متبرع ومتلقي. حدد مستعمرة واحدة لكل متبرع ومتلقي وقم بزراعتها في ملليلتر من مرق مولر هينتون عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.في اليوم الثالث ، قم بقياس الكثافة البصرية ل 10 أضعاف الثقافة الملحية المخففة بين عشية وضحاها عند 600 نانومتر دون دوامة. إذا لزم الأمر ، استخدم محلول ملحي معقم لضبط الكثافة البصرية إلى اثنين. قم بتسمية أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر كأنبوب تزاوج ، مع الإشارة إلى سلالات المتبرع والمتلقي.انقل 500 ميكرولتر من التعليق المعدل لكل متبرع ومتلقي في أنبوب التزاوج وامزج التعليق برفق عن طريق الانقلاب. جهاز طرد مركزي أنبوب التزاوج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 500 G.ماصة من 800 ميكرولتر من المادة الطافية من أنبوب التزاوج دون إزعاج الحبيبات ، وترك 200 ميكرولتر في الأنبوب. احتضان أنبوب التزاوج لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.علاوة على ذلك ، كعنصر تحكم سلبي ، قم بخط ثقافة المتبرعين بين عشية وضحاها على الوسائط B والمتلقين على الوسائط A واحتضان اللوحات طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، في اليوم الرابع ، أضف 800 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى أنبوب التزاوج وأعد تعليقه عن طريق الدوامة. قم بعمل تخفيفات تسلسلية لتعليق التزاوج وأضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح الوسائط.بمجرد تجفيف الألواح ، احتضنها لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية واحسب تكرار الاقتران لكل متبرع أو لكل مستلم كما هو موضح في المخطوطة. بعد استخراج الحمض النووي من جدران الخلايا البكتيرية باستخدام طريقة بسيطة لاستخراج تحضير الغليان ، قم بتسمية أنبوب سعة 1.5 ملليلتر كتجمع في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوبة باسم الجين والعينة. في الأنبوب المسمى بالبركة ، أضف الماء المعقم ، والمزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، والبادئات ، والبلمرة.امزج برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل في بيئة باردة. أضف قالب الحمض النووي إلى الأنبوب المقابل وقم بتأمين أنابيب PCR بأغطية. ضع أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل في جهاز التدوير الحراري وابدأ برنامج جينات المقاومة و replicons كما هو موضح في المخطوطة.لتأكيد amplicon ، قم بإعداد هلام agarose بنسبة 1٪ عن طريق إضافة agarose و TAE buffer في قارورة 250 ملليلتر وقم بإذابة الأغاروز باستخدام الميكروويف. بمجرد أن يبرد محلول الأغاروز إلى حوالي 55 درجة مئوية ، تحت غطاء الدخان ، أضف ستة ميكرولترات من SYBR Green واخلطها. صب الجل في صينية محكمة الغلق بشريط لاصق لتجنب الانسكاب واترك الجل يتماسك لمدة 15 إلى 25 دقيقة حتى يظهر التعكر.بعد إزالة الشريط اللاصق ، ضع الجل في غرفة الرحلان الكهربائي وأضف المخزن المؤقت TAE لتغطية الجل. امزج خمسة ميكرولترات من صبغة تحميل هلام الحمض النووي ست مرات مع 25 ميكرولترا من كل تفاعل عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل. ثم قم بتحميل الخليط في الآبار عن طريق تجنب الفقاعات.بعد إضافة أربعة ميكرولترات من سلم الحمض النووي لزوج كيلو قاعدة واحد في البئر الأول ، أغلق غطاء الغرفة وقم بتشغيل الجل لمدة 60 دقيقة عند 120 فولت و 400 مللي أمبير. تصور الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتسجيل الصورة. ميز أجار ماكونكي المتبرعين الإيجابيين للاكتوز الذين أنتجوا مستعمرات وردية كبيرة من المتلقي و transconjugants ، والتي كانت سلبية اللاكتوز وأنتجت مستعمرات صفراء شاحبة أصغر.كانت كفاءات الاقتران الخمسة لسلالة مانحة SSW4955 كلها ضمن نفس الترتيب من حيث الحجم ، مما يشير إلى أنه يمكن اكتشاف تعبئة البلازميد الاقتراني بغض النظر عن الاختيار المستخدم لتحديد هوية الاقتران المرافق. في حين أظهرت سلالة المتبرع SSW7037 كفاءة اقتران أقل بثلاث مرات ، مما يسمح بمقارنة كفاءات الاقتران لمختلف المتبرعين وأنواع البلازميد مع نفس المتلقين. أكد الرحلان الكهربائي الهلامي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وجود replicons المتوقعة في المرافقات.يعتمد هذا الفحص تماما على العلامات القابلة للتحديد. يجب أن تكون الضوابط في مكانها الصحيح للتأكد من أن كل اختيار يعمل ويجب تأكيد الاقتران اللوني أو بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن تكييف البروتوكولات المعروضة هنا لدراسة الاقتران في الجسم الحي أو نماذج الأغشية الحيوية ، ولدراسة المتغيرات التي تعدل كفاءة الاقتران.هذا البروتوكول للكشف عن البلازميدات القابلة للتعبئة على نطاق واسع سيضيف بشكل كبير إلى فهمنا لتدفق الجينات عبر البيئة ، ودراسة المتغيرات التي تؤثر على كفاءة الاقتران.

الكشف عن نقل الجينات الأفقي بوساطة البلازميدات المترافقة الطبيعية في الإشريكية القولونية

Abstract