LM-B, IMG, AT 및 IS는 LM-B에 수여된 NIH 보조금 GM055246의 지원을 받았습니다. GC-C는 AY 2017-18 및 2018-19에 2 년 연속 UC MEXUS-CONACYT Postdoctoral Fellowship을 수상했습니다. 실험에 대한 기술 지원을 위해 Genentech-Foundation이 후원하는 GAIN(Academic Inspiration Network) 멘토링 프로그램의 Sage Chavez와 Pepper St. Clair 학생에게 큰 감사를 드립니다.

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접합 플라스미드는 재조합 및 수평적 유전자 전달을 통해 특정 환경 환경 내에서 유전자의 공동 풀에 대한 접근을 제공한다34. 따라서 접합 플라스미드는 박테리아가 여러 조건(항생제에 대한 내성, 금속에 대한 내성, 금속 획득, 생물막 형성 및 병원성 유전자 등)에 적응할 수 있도록 하는 기능을 획득하고 부여할 수 있는 진화적 실체입니다.
이 연구는 박테리아에서 접합 플라스미드를 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 프로토콜이 작동하려면 사용된 마커가 배지 A와 B의 대조군에서 볼 수 있듯이 기증자와 수혜자 균주를 구별해야 합니다. 또한 플라스미드를 운반하는 세포를 효과적으로 선택해야 합니다. 짝짓기 반응이 중요합니다. 이 반응에서 기증자와 수혜자는 접합이 일어나기 위해 장기간의 접촉(필리를 통해)을 해야 합니다. 불충분한 배양 시간이나 배양을 흔들거나 교반하는 것과 같이 세포 간 접촉을 방해할 수 있는 모든 것은 접합 효율을 감소시킵니다. 수용자의 선택은 또한 중요한데, 일부 수용자 균주는 접합에 불응하기 때문이다35,36. LMB100은 여러 비호환성 유형의 플라스미드를 취할 수 있기 때문에 선택의 수혜자로 제안됩니다.
접합 속도는 각 플라스미드-공여자 염색체 쌍, 수용자 및 환경 조건에 따라 다릅니다. 특정 플라스미드의 접합은 성장기, 세포 밀도, 공여체 대 수용자 비율, 접합이 액체 또는 고체 매질에서 수행되는지 여부, 탄소, 산소, 담즙염, 금속 농도, 포유동물 세포의 존재, 온도, pH 및 짝짓기 시간을 포함하는 많은 변수에 민감한 것으로 밝혀졌습니다13,14,15 . 이러한 상호 작용에 대한 연구는 심층적으로 연구할 접합 플라스미드의 초기 검출에 달려 있습니다. 따라서 여기에 설명된 프로토콜은 다양한 실험 변수의 영향을 탐색하기 위해 수정할 수도 있지만 선별된 기증자의 수를 제한하는 대가를 치르게 됩니다. 또한, 헬퍼 플라스미드(즉, 트랜스6의 동원 가능한 플라스미드로부터 결여된 기능을 제공함으로써 접합을 가능하게 하는 플라스미드)를 갖는 숙주에서 동원 가능한 플라스미드를 확인할 수 있다.
접합 플라스미드의 서열을 아는 것이 좋습니다(그러나 위에서 논의한 바와 같이 접합을 검출할 필요는 없음). 공여자가 유당 음성인 경우(MacConkey 한천에서 노란색 콜로니 생성), 유당 양성 수용자(MacConkey 한천에서 분홍색 콜로니 생성)를 사용하여 배지에서 성장할 수 있는 기증자 세포와 진정한 형질전환 접합체를 구별하여 형질전환 접합체를 선택할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 장내세균과(Enterobacteriaceae)의 환경적, 공생적 및 병원성 구성원으로부터 접합 플라스미드를 검출하도록 설계되었습니다. 그러나 적절한 기증자, 수혜자, 항생제 및 색상 마커가 있는 모든 박테리아 종과 함께 사용할 수 있습니다. 다른 박테리아에서 이러한 중요한 구성 요소를 식별하려면 여러 기증자, 수혜자 및 마커(항생제 및 색상)를 사용한 체계적인 연구가 필요합니다. 이 프로토콜은 그람 양성균에서 테스트되지 않았습니다.
여기에 제시된 방법의 여러 변형이 문헌에 보고되었으며, 최근20개가 검토되었다. 정성적 결과는 또한 다양한 방식으로(예: 접합 빈도 및 유전자 전달 빈도) 참조할 수 있으며 무차원 단위를 사용하여 접합 효율(mL/CFU x h)을 보고할 수 있습니다20.
여기에 설명된 프로토콜은 기존의 방법(16,18,19,20)에 의해 이전에 다루어지지 않았던 몇 가지 제한사항을 해결한다. 먼저, 적합한 수신자가 확인되었습니다. 둘째, 진정한 형질전환체를 선택하기 위해 두 가지 항생제(리팜핀 및 스트렙토마이신)를 사용하면 기증자가 자발적인 돌연변이 유발을 통해 형질전환체를 선택하는 데 사용되는 항생제 중 하나에 대한 내성을 진화시킬 가능성을 최소화합니다. 거짓 형질전환체는 또한 공여자에 의해 대량으로 생산된 효소(예: 베타-락타마제)에 의해 형질전환체를 선택하는 데 사용되는 항생제의 가수분해에 의한 방관자 보호로부터 발생할 수 있습니다. 셋째, 짝짓기 산물이 진정한 형질전환체(즉, 공여자의 접합 플라스미드를 안정적으로 통합한 수용자 세포)인지 확인하기 위해 몇 가지 실험 대조군이 포함된다. 여기에서 우리는 transconjugants의 진위를 테스트하기 위한 두 가지 독립적인 방법, 즉 MacConkey 한천의 비색 마커와 수용자에서 접합 플라스미드의 레플리콘 및 항생제 내성 유전자의 PCR 검출을 제시했습니다. 또한, 여기에 기술된 프로토콜은 장내세균과(Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella 및 기타 종)의 환경적, 공생적 및 병원성 구성원으로부터 접합 플라스미드를 분리하고 특성화하도록 설계되었습니다.
접합 역학을 이해하기 위해 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하여 실험적 관찰을 모델링했습니다. 이러한 예측 모델은 기증자, 수용자 및 형질전환체의 주어진 성장 밀도에 대한 플라스미드 전달의 빈도를 추정합니다. 종말점 모델(endpoint model)로 알려진 모델은 액체 배양에서 플라스미드 전달 속도보다 높은 임계값을 발견했으며, 전달 속도는 세포 밀도, 기증자:수용자 비율 및 짝짓기 시간에 영향을 받지 않는다고 결론지었습니다19. 형광 in situ 하이브리드화(FISH)는 트랜스콘쥬간트 플라스미드 검출의 대안적인 방법으로 사용되어 왔다. FISH는 DNA 프로브와 표적 DNA의 혼성화를 통해 형광 현미경을 사용하여 플라스미드를 시각화할 수 있습니다. 따라서, FISH는 상이한 세포 집단(37)에 걸친 플라스미드 흐름의 시각적 검출을 허용하지만, 트랜스접합체가 선택과 반대되는 시각적 스크리닝에 의해 검출되는 경우 여기에 제시된 방법과 동일한 수준의 민감도를 갖지는 않는다.
생태계의 다양한 구성 요소(클리닉, 농업, 하수, 야생 동물, 가축, 토양, 강 및 호수)를 통해 항생제 내성 유전자를 분산시키는 접합 플라스미드의 생물학을 이해하는 데 엄청난 필요성이 있습니다. 요컨대, 여기에 설명된 프로토콜에 제시된 단순화된 실험 조건은 대규모로 기증자의 스크리닝을 용이하게 하며, 따라서 다양한 출처의 접합 플라스미드에서 유래하는 수평 유전자 전달 연구를 위한 핵심 도구를 나타냅니다. 여러 출처 및 박테리아의 접합 플라스미드에서 항생제 내성 유전자 또는 기타 임상적으로 관련된 유전자의 유병률을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그들은 또한 생체 내 (예: 척추동물의 장에서) 접합 연구 및 접합 효율을 조절하는 조건을 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 이 모든 연구는 다제내성 접합 플라스미드의 동원이 다제내성의 확산에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다.

1946년 Lederberg와 Tatum1은 현재 접합으로 알려진 대장균 K-12의 성과정을 설명했습니다. 박테리아 접합은 박테리아 세포(기증자)가 직접적인 세포 간 접촉을 통해 단방향 유전 물질을 다른 세포(수용자)로 전달하는 과정입니다. 접합은 박테리아2,3에 광범위하게 분포하지만, 접합 기계를 발현하는 공여 세포의 분율은 일반적으로 매우 작다4.
플라스미드는 자율적으로 복제되는 염색체외 DNA 요소입니다. 플라스미드는 플라스미드 복제 및 유지에 관여하는 유전자 외에도 중금속이나 항생제 노출과 같은 환경 문제에 대한 적응에 관여하는 유전자를 운반하는 경우가 많다5. 접합 플라스미드(Conjugative plasmids)는 수용 세포로의 전달을 허용하고 전달 후 지속성을 지원하는 일련의 특수 유전자를 가진 플라스미드 부류이다6. 접합 플라스미드의 크기는 슈도모나도타문(프로테오박테리아와 동의어)의 박테리아에서 21.8kb에서 1.35Mb까지 다양하며 중앙값은 약 100kb 5,7입니다. 이들은 또한 일반적으로 낮은 복제 수를 가지며, 아마도 숙주에 대한 대사 부담을 낮게 유지하기 위해 8,9.
전형적인 접합 장치는 전달 기원(oriT), 이완효소, IV형 결합 단백질 및 IV형 분비 시스템(기증자가 수혜자와 접촉할 수 있도록 하는 필루스라고 하는 튜브 모양의 구조)의 네 가지 구성 요소로 구성됩니다6. 접합 플라스미드를 운반하는 세포의 극소량만이 접합 기계4를 발현하지만, 플라스미드가 적합성 이점을 제공한다면, 트랜스접합체는 집단에서 급속히 확장될 수 있다. 서로 다른 서식지에서 채취한 대장균 분리주의 35%에서 80% 이상은 적어도 하나의 항생제에 내성을 부여하는 유전자를 가진 접합 플라스미드를 가지고 있다10,11; 따라서, 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평적 유전자 전달은 항생제 내성 유전자12의 세계적 확산을 주도하는 주요 메커니즘이다.
실험실 배양에서 수행된 짝짓기 실험은 접합 빈도가 수용자 세포의 특성, 성장 단계, 세포 밀도, 공여체 대 수용자 비율, 접합이 액체 또는 고체 배지에서 수행되는지 여부, 탄소, 산소, 담즙염, 금속 농도, 포유류 세포의 존재, 온도, pH 및 짝짓기 시간13,14, 15.
이 작업은 주어진 숙주 균주에서 접합 플라스미드의 존재를 검출하고, 고체 배양에서 접합 속도를 정량화하고, 수용자 세포로의 전달을 다시 확인하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 연구에 적합한 천연 접합 플라스미드를 식별하기 위한 첫 번째 단계로 사용할 수 있습니다. 여러 출처(환경, 공생 및 병원성)에서 대규모(수십에서 수백 명의 기증자)에서 얻은 박테리아에서 접합 플라스미드의 존재를 스크리닝하도록 설계되었기 때문에 최소한의 단순화된 단계를 사용합니다.
또한, 주어진 접합 플라스미드의 동원이 검출에 사용된 항생제와 무관한지 여부(즉, 선택 하에서 항생제 내성 유전자의 관련성)를 검출하고 상이한 환경 분리주에서 발견된 2개의 접합 플라스미드의 접합률을 비교하기 위한 시험이 제시된다.
관련 접합 플라스미드(플라스미드 레플리콘 및 항생제 내성 유전자 구성)의 유전적 구성에 기초하여, 프로토콜의 각 단계는 접합 속도에 영향을 미칠 가능성이 있는 다양한 인자의 영향을 연구하기 위해 수정될 수 있다.
일반 실험 설계: 짝짓기 실험을 설정하는 데 필요한 필수 구성 요소는 기증자 세포, 수용자 균주 및 기증자(항생제 A), 수용자(항생제 B) 및 형질전환체(항생제 A 및 B)를 선택하기 위한 고체 배지입니다. 트랜스접합체는 공여자의 접합 플라스미드를 안정적으로 유지하는 수용자 세포이다.
공여 세포는 항생제(항생제 A)에 내성이 있고 수용자 세포를 선택하는 데 사용되는 마커(항생제 B)에 민감합니다. 항생제 내성 유전자의 게놈 위치(즉, 그것이 염색체 또는 공여자 세포의 플라스미드에 위치하는지 여부)는 선험적으로 알려질 필요가 없는데, 그 이유는 항생제 내성 마커를 수용자에게 동원하기 때문에(직접 기증자-수혜자 접촉 후) 공여자-제공된 마커가 플라스미드에 있었다는 것을 의미한다.
수용자 균주(접합 플라스미드를 취하는 것으로 알려짐)는 공여자에게 존재하지 않는 안정적인 선택 가능한 마커를 가질 필요가 있습니다. 이 선택 가능한 마커는 일반적으로 염색체에 위치한 항생제 또는 살생물제에 내성이 있습니다. 교미 실험에 사용할 수용자의 선택은 매우 중요한데, 그 이유는 일부 대장균 균 주가 접합 플라스미드를 채취하는 능력이 다양하기 때문이다16.
이러한 구성 요소가 확립되면 기증자-수혜자 쌍 접촉 후 항생제(A 및 B)가 모두 포함된 배지에서 자라는 모든 콜로니는 추정 형질전환체입니다(그림 1). 이는 기증자가 항생제 A가 있는 배지에서 성장할 수 있지만 항생제 B가 있는 배지에서는 성장할 수 없고, 수혜자가 항생제 B가 있는 배지에서 성장할 수 있지만 항생제 A로 성장할 수 없다고 가정합니다. 첫 번째 검사는 트랜스컨쥬간트 콜로니의 접합 플라스미드에서 발견되는 유전자의 검출(유전자의 중합효소 연쇄 반응[PCR] 증폭 또는 기타 방법에 의한)으로 구성됩니다. 두 번째 테스트는 유당 대사를 기반으로 한 차등 콜로니 색상 마커의 사용을 포함합니다. 차등 식민지 색상은 MacConkey 한천을 사용하여 나타납니다. 한천의 유당은 유당 발효(LAC+) 미생물에 의해 발효 공급원으로 사용될 수 있습니다. 이 미생물은 유기산, 특히 젖산을 생성하여 pH를 낮춥니다. 중성 적색은 pH가 6.8 이하로 떨어지면 회백색에서 밝은 적색/분홍색으로 변하는 배지에 포함된 pH 지표입니다17. 따라서 대장균 유당 양성 균주는 MacConkey 한천에서 더 큰 분홍색 콜로니를 생성하는 반면, 유당 음성 균 주는 MacConkey 한천에서 옅은 노란색과 더 작은 콜로니를 생성합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig01.jpg"> 그림 1: 기증자 균주에서 접합 플라스미드의 존재를 검출하는 데 사용되는 실험 설계. 이 예에서, 공여자는 항생제 A에 대한 내성을 부여하는 항생제 내성 유전자를 갖는 접합 플라스미드를 보유하지만, 이들은 항생제 B에 감수성이 있다. 반대로, 수혜자는 항생제 B로부터 보호를 부여하는 염색체 내성 결정인자를 갖지만, 항생제 A에 감수성이 있다. 트랜스접합체는 항생제 (A 및 B) 모두에 내성이 있고, 항생제 A에 대한 내성을 부여하는 기증자의 접합 플라스미드와 항생제 B로부터 보호하는 수혜자의 염색체를 가지고 있기 때문입니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig01large.jpg" target="_blank">. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
(주어진 실험 조건 하에서) 기증자-수혜자 쌍에 대한 접합률은 형질전환 접합체의 수를 기증자의 수 또는 수혜자의 수로 나누어 계산할 수 있습니다. 첫 번째 비율은 공여자에 의한 접합 기계의 기능적 발현을 나타내는 공여자 세포의 분획을 나타내고16,18, 두 번째 비율은 공여자 플라스미드19,20을 취하는 수용자의 능력을 나타냅니다. 본 연구에서, 달리 언급되지 않는 한, 접합률은 형질접합체가 되는 수용자 세포의 분율(즉, 수용자당 비율)을 나타낸다.
여기에서 1명의 대장균 수혜자와 2명의 대장균 기증자를 포함하는 두 개의 독립적인 짝짓기 실험이 보고됩니다. 또한, 공여자 중 한 명에 대한 형질전환 접합체를 선택하기 위해 상이한 항생제를 사용하여 단일 다제내성 플라스미드가 접합 플라스미드에서 발견되는 항생제 내성 유전자 중 하나로 선택될 수 있음을 확인했습니다.
이 작업에 사용된 기증자 및 수혜자 균주는 이 실험 시스템의 모든 구성 요소를 이해하기 위해 완전히 시퀀싱되었습니다. 그러나, 이들 프로토콜은 알려지지 않은 서열의 숙주에서 접합 플라스미드의 존재를 스크리닝하기 위해 설계되었으며, 이 실험적 맥락에서도 사용될 수 있다; 그러나 이 경우 관련 유전자가 먼저 시퀀싱됩니다.
프로토콜에 사용된 기증자 및 수혜자 균주는 다음과 같습니다.
기증자 1. 대장균 SW4955는 미국 LA 배턴루지의 호수에서 수집되었습니다. IncFIC(FII) 및 IncFIB(AP001918) 응답자를 갖는 134,797bp 접합 플라스미드(p134797)를 가지고 있습니다. 이 접합 플라스미드는 3세대 세팔로스포린(blaCTX-M-55), 아미노글리코사이드(aac(3)-IIa 및 aadA1), 페니콜(catA2), 테트라사이클린(tet(A)), 트리메토프림(dfrA14) 및 설폰아미드(sul3). p134797의 전체 지도는 그림 2A를 참조하십시오. 대장균 SW4955는 유당 양성이며 MacConkey 한천에서 분홍색 콜로니를 생성합니다.
기증자 2. 대장균 SW7037은 Lake Erie (Ottawa County, OH, USA)에서 수집되었다. IncI1-I(알파) 레플리콘이 있는 101,718bp 접합 플라스미드(p101718)를 운반합니다. 이 접합 플라스미드는 베타-락탐(blaCMY-2)에 대한 내성을 부여하는 유전자를 가지고 있습니다. p101718의 전체 지도는 그림 2B를 참조하십시오. 대장균 SW7037은 또한 유당 양성이며 MacConkey 한천에서 분홍색 콜로니를 생성합니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig02.jpg"> 그림 2: 이 연구에 사용된 접합 플라스미드의 유전자 지도. (A) 플라스미드 p134797, 대장균 균주 SW4955에서 발견되는 접합 플라스미드. (B) 플라스미드 p101718, 대장균 균주 SW7037에서 발견되는 접합 플라스미드. 항생제 내성 유전자는 파란색으로 강조 표시되고 접합 장치에 속하는 유전자는 빨간색으로 강조 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
받는 사람. 대장균 LMB100은 수신자로 사용됩니다. 이것은 리팜핀(100mg/L)과 스트렙토마이신(100mg/L)에 내성이 있는 플라스미드가 없는 균주입니다. 두 가지 항생제에 대한 내성이 있으면 결과 해석을 방해할 수 있는 기증자에서 내성 돌연변이가 발생할 가능성이 줄어듭니다. 또한, 대장균 LMB100은 유당 음성이며, MacConkey 한천에서 옅은 노란색과 작은 콜로니(더 큰 분홍색 콜로니와 반대)를 생성하기 때문에 두 기증자 균 주와 구별할 수 있습니다.
기증자가 유당 음성인 경우 유당 양성 수혜자(예: 대장균 J53)를 사용하는 것이 좋습니다. LMB100 및 J53 균주는 다른 실험실에서도 사용할 수 있습니다. Gerardo Cortés-Cortés 박사에게 주소 및 FedEx 번호와 함께 요청을 보내주십시오.
기증자, 수혜자 및 transconjugants를 선택하고 계산하는 데 필요한 고체 배지는 직경 100mm의 페트리 접시에 담긴 MacConkey 한천입니다. 다음 항생제의 추가가 필요합니다: (i) 배지 A: 카르베니실린(100mg/L)을 사용하여 기증자를 계산하고 수혜자가 이 항생제로 성장할 수 없도록 합니다. (ii) 배지 B: 리팜핀(100mg/L) + 스트렙토마이신(100mg/L)을 사용하여 수혜자의 수를 계산하고 기증자가 이 두 항생제에서 성장할 수 없도록 합니다. (iii) 배지 AB: 카르베니실린(100mg/L) + 리팜핀(100mg/L) + 스트렙토마이신(100mg/L)을 사용하여 트랜스콘쥬간트를 얻고 계산합니다. (iv) 배지 C: 연구된 모든 분리주를 줄무늬로 하는 항생제 없음.
대장균 SW4955 및 대장균 SW7037에서 대장균 LMB100에 대한 접합 플라스미드의 접합률을 비교합니다. 또한, p134797 접합 플라스미드(SW4955 균주)의 경우, 항생제 카르베니실린(100 mg/L)을 겐타마이신(2 mg/L), 클로람페니콜(25 mg/L), 테트라사이클린(10 mg/L), 트리메토프림(20 mg/L) 또는 설파메톡사졸(100 mg/L)로 대체하여 선택에 사용된 항생제 내성 마커가 결과에 영향을 미치는지 확인하기 위한 후속 실험에서.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube racks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22-313630</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Cryogenic vials</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430659</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL conical tubes</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>149597</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL tube racks</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>8850</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 kb DNA ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0552G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL sterile flasks&#160;</td>
			<td>PYREX</td>
			<td>5320</td>
			<td>It can be replaced for another permanent marker brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38SI-212</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (molecular biology grade, multipurpose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td>
			<td>C-103-50</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable inoculating loops: 1 &#181;L</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-363-595</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA gel loading dye 6x&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP119-500</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic digital scale</td>
			<td>Denver Instrument</td>
			<td>APX-2001</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf conical tubes: 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>14-282-302</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment for agarose gel electrophoresis</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FP300</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol-resistant markers</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td>37001; 37002; 37003</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel documentation systems (UVP GelSolo)</td>
			<td>Analytakjena</td>
			<td>SP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td>X-GEN</td>
			<td>44-100M</td>
			<td>Any nitrile gloves brand works</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice bucket</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>432128</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MacConkey agar&#160;</td>
			<td>BD DIFCO</td>
			<td>212123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master Mix&#160;</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>M0496S&#160;</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes: 2.0 mL</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton agar</td>
			<td>BD DIFCO</td>
			<td>DF0479-17-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mueller Hinton broth</td>
			<td>BD DIFCO</td>
			<td>275730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA</td>
			<td>Takara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>740588. 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube racks</td>
			<td>AXYGEN&#160;</td>
			<td>&#160;R96PCRFSP</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes (0.2 mL)</td>
			<td>AXYGEN&#160;</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-164-7517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set of micropipettes that dispense between 1 - 10 &#956;L (P10), 2&#8211;20 &#956;L (P20), 20&#8211;200 &#956;L (P200) and 200&#8211;1000 &#956;L (P1000)</td>
			<td>RAININ</td>
			<td>17008648; 17008650; 17008652; 17008653</td>
			<td>Micropipettes should be calibrated; can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S671-3</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>335905P</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized tips for 10 &#956;L, 200 &#956;L and 1000 &#956;L&#160;</td>
			<td>Eclipse</td>
			<td>1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP910-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Safe DNA gel stain&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>BioLabs</td>
			<td>M0273S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler C1000 Touch&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851196</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-500</td>
			<td>It can be replaced for another brand</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of horizontal gene transfer mediated by natural conjugative plasmids in e. coli

접합은 그람 음성 박테리아에서 수평 유전자 전달을 촉진하는 주요 메커니즘 중 하나를 나타냅니다. 이 연구는 두 개의 자연 발생 플라스미드를 예로 사용하여 자연 발생 접합 플라스미드의 동원 연구 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 기증자, 수용자 및 접합 플라스미드에서 선택 가능한 마커의 차등적 존재에 의존합니다. 구체적으로, 기술된 방법은 1) 천연 접합 플라스미드의 동정, 2) 고체 배양에서의 접합 속도의 정량화, 및 3) 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 형질접합체 수용자의 항생제 내성 유전자 및 플라스미드 플리콘 유형의 진단 검출을 포함한다. 여기에 설명된 프로토콜은 환경에서 발견되는 박테리아에서 항생제 내성 유전자를 운반하는 접합 플라스미드의 존재를 스크리닝하기 위해 수평 유전자 전달의 진화 생태학을 연구하는 맥락에서 개발되었습니다. 배양에서 이러한 실험에서 관찰된 접합 플라스미드의 효율적인 전달은 일반적으로 수평적 유전자 전달을 촉진하는 메커니즘으로서 접합의 생물학적 관련성과 특히 항생제 내성의 확산을 강조합니다.

공여체 SW4955 및 SW7037이 시퀀싱되었다는 점을 감안할 때, 이 두 공여체 균주는 게놈 서열에서 확인된 내성 유전자 프로파일에 해당하는 내성 표현형을 가질 것으로 예상됩니다. 플라스미드 p134797(SW4955)은 3세대 세팔로스포린(blaCTX-M-55)에 대한 내성과 아미노글리코사이드(aac(3)-IIa 및 aadA1), 페니콜(catA2), 테트라사이클린(tet(A)), 트리메토프림(dfrA14) 및 설폰아미드(sul3); SW4955 염색체에서 항생제 내성 유전자는 발견되지 않았습니다. 플라스미드 p101718(SW7037)은 3세대 세팔로스포린(blaCTX-M-55)에 대한 내성을 부여할 것으로 예상되는 하나의 항생제 내성 유전자(blaCMY-2)만 가지고 있습니다. 다시 말하지만, SW7037 염색체에서 항생제 내성 유전자가 발견되지 않았습니다.
짝짓기 후, 상기 언급된 모든 내성 유전자를 보유하는 2개의 접합 플라스미드의 전달의 검출이 예상되었다. 양성 접합 검출은 transconjugants로 확인된 수용자가 접합 플라스미드를 획득했어야 함을 의미합니다. 트랜스접합체에서 접합 플라스미드에 대한 진단 내성 유전자의 존재(PCR에 의해 검출됨)도 예상되었습니다.
여기에 기술된 방법을 설명하기 위해, 접합에 의해 플라스미드 DNA를 전달하는 2개의 대장균 환경 단리주의 능력을 시험하였다. 실험 설정의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. 2명의 기증자(E. coli SW4955 및 SW7037)와 1명의 수혜자(E. coli LMB100)를 독립적으로 교미했습니다. 대장균 SW4955 (p134797) 및 SW7037 (p101718)에서 발견되는 접합 플라스미드의 유전자 맵은 그림 2에 나와 있습니다.
접합 플라스미드는 카르베니실린으로 선택되었고 내성 결정인자는 수용자의 염색체에 있는 리팜핀과 스트렙토마이신을 사용하여 반대 선택되었습니다. MacConkey 한천은 유당 양성 기증자(큰 분홍색 콜로니를 생성함)를 수혜자 및 트랜스콘쥬간체(유당 음성이고 더 작고 옅은 노란색 콜로니를 생성함)와 구별하는 데 사용되었습니다(그림 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig03.jpg"> 그림 3: MacConkey 한천의 기증자 및 수용자 콜로니에 대한 차등 색상 마커 그림. 기증자에 해당하는 식민지는 유당 양성이기 때문에 MacConkey 한천에서 분홍색입니다. 이것은 기증자를 옅은 노란색과 더 작은 수혜자 콜로니와 구별합니다(유당 음성). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
접합 플라스미드 p134797의 동원이 검출되었으며, 플라스미드에서 발견된 5가지 다른 종류의 내성 유전자에 해당하는 5가지 항생제 각각이 검출되었습니다.
변형 SW4955에 대한 접합 효율(CE)을 계산하는 방법의 예가 제시되어 있습니다. 균주 SW4955를 사용한 분석으로부터, 172 CFU의 트랜스콘쥬간체를 희석 10-2로부터 플레이트에서 계수하였다; 해당 희석(10-2)의 수용자 수는 10,300,000 CFU/mL였습니다(표 4).
CE는 다음과 같이 계산됩니다.
CE = (174 CFU/mL)/(10,300,000 CFU/mL)
CE= 1.67 x 10-5 transconjugants/recipient
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="2">LMB100 시리즈</td>
			<td>Carbelicillin으로 선택된 균주 SW4955의 Transconjugants</td>
			<td rowspan="2">활용 효율</td>
		</tr><tr><td>희석</td>
			<td>CFU(계산 가능한 플레이트)</td>
			<td>약 CFU/mL</td>
			<td>CFU(계산 가능한 플레이트)</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>합류하는</td>
			<td>1.03E+09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-1</td>
			<td>합류하는</td>
			<td>1.03E+08</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-2</td>
			<td>합류하는</td>
			<td>10300000</td>
			<td>172</td>
			<td>1.67 x 10-5 transconjugants/recipient</td>
		</tr><tr><td>10-3</td>
			<td>합류하는</td>
			<td>1030000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-4</td>
			<td>합류하는</td>
			<td>103000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-5</td>
			<td>합류하는</td>
			<td>10300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-6</td>
			<td>합류하는</td>
			<td>1030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10-7</td>
			<td>103</td>
			<td>103</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="5">CE를 계산하는 데 사용되는 값은 굵게 강조 표시됩니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 4: 균주 SW4955에 대한 접합 효율(CE)을 계산하는 방법의 예.
그 결과를 수용자당 접합 효율로 나타내어 표 5에 나타내었다. 기증자로서 균주 SW4955를 사용하여 얻은 5가지 접합 효율은 모두 동일한 크기 내에 있었습니다. 이러한 결과는 접합성 플라스미드의 동원이 형질접합체 식별에 사용되는 선택에 관계없이 검출될 수 있음을 나타낸다.
균주 SW7037을 공여체로 사용하여 얻은 접합 효율은 3배 더 낮았습니다. 이러한 결과를 통해 동일한 수용자와 서로 다른 기증자 및 플라스미드 유형의 접합 효율을 비교할 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="5">활용 효율</td>
		</tr><tr><td>거르다</td>
			<td>카르베니실린(100mg/L)</td>
			<td>겐타마이신(2mg/L)</td>
			<td>클로람페니콜 (25 mg/L)</td>
			<td>테트라사이클린(10mg/L)</td>
			<td>트리메토프림(20mg/L)</td>
		</tr><tr><td>SW4955 시리즈</td>
			<td>1.67 x 10-5</td>
			<td>5.67 엑스 10-5</td>
			<td>2.17 엑스 10-5</td>
			<td>7.62 엑스 10-5</td>
			<td>1.36 엑스 10-5</td>
		</tr><tr><td>SW7037 시리즈</td>
			<td>2.14 x 10-6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>표 5: 선택에 사용된 항생제에 따른 대장균 기증자 균주 SW4955 및 SW7037의 접합 효율.
트랜스컨쥬간체에서, 시험된 2개의 컨쥬게이션 플라스미드에 코딩된 레플리콘 및 모든 내성 유전자의 존재 및 이들의 상응하는 리플리콘을 PCR에 의해 확인하였다. 이들 진단용 PCR 반응에 사용된 조건은 표 3에 제시되어 있다.
진단 젤은 그림 4에 나와 있습니다. 이 겔은 transconjugants (p1347975의 IncFIC 및 IncFIB 및 p101718의 IncI1)에서 예상되는 replicon의 존재를 확인합니다. 또한 예상되는 항생제 내성 유전자, 즉 p1347975에 대한 bla CTX-M-55 그룹 (베타-락탐), aac (3) -II 및 aadA (아미노 글리코 시드), catA2 (페니 콜), tet (A) (테트라 사이클린), dfrA14 (트리 메토 프림) 및 sul3 (sulphonamide) 및 p1347975에 대한 blaCMY-2 (그림 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64523/64523fig04.jpg"> 그림 4: 진단용 전기영동 젤. 공여 세포(각각 SW4955 및 SW7037 균주) 및 상응하는 LMB100 형질접합체에서 접합 플라스미드 p134797 및 p101718에서 발견되는 항생제 내성 유전자 및 플라스미드 레플리콘의 PCR 산물의 겔 전기영동. 카르베니실린은 플라스미드 선별에 사용되었다. 약어. - 음성 대조군 (LMB100 균주의 DNA는 음성 대조군으로 사용되었다); D: 기증자; T: transconjugant. 예상 앰플리콘 크기: blaCTX-M-55: 864 pb; AAC(3)-IIa: 237bp; aadA1: 283 bp; catA2: 225bp; 테트(A): 957bp; dfrA14: 302 bp; 술3: 799 bp; IncFIC (FII) : 262 bp; IncFIB: 683 bp; ᄏᄏ�� IncI1-I: 139bp. 겔은 1% 아가로스를 함유한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64523/64523fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

접합은 두 개의 서로 다른 세포에 걸쳐 플라스미드 DNA를 동원하여 유익한 유전자의 확산을 촉진함으로써 수평적 유전자 전달을 매개합니다. 이 연구는 접합 플라스미드, 공여체 및 수용자에서 차등 마커를 사용하여 형질전환을 검출하는 것을 기반으로 접합 플라스미드 전달의 효율적인 검출을 위해 널리 사용되는 방법을 설명합니다.

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

대장균과 같은 박테리아는 접합 플라스미드에서 항생제 내성 유전자를 가지고 있습니다. 이 박테리아는 병원, 동물 및 수생 환경에서 공생으로 살 수 있습니다. 천연 접합 플라스미드는 서로 다른 박테리아 계통 사이에서 유전자를 수평적으로 전달합니다.우리는 접합 플라스미드 및 형성 접합 효율의 검출을 위한 금속을 제시합니다. 이 기술은 간단하고 민감합니다. 플라스미드, 기증자 및 수혜자에 대한 마커를 사용하기 때문에 민감합니다.이러한 마커는 선택 가능하며, 이는 매우 큰 모집단에서 단일 이벤트를 식별할 수 있음을 의미합니다. 우리가 제시하는 프로토콜은 항생제 내성의 진화를 연구하고 역학 감시, 즉 약물 내성 유전자의 흐름을 모니터링하는 데 유용합니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Caison Warner와 CAMS 연구실의 학부생 인 Pepper St.Clair가 될 것입니다.첫째 날에는 항생제가 없는 MacConkey 한천인 배지 C에 글리세롤 스톡의 기증자와 수혜자를 별도로 줄무늬로 만들고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 둘째 날에는 각 기증자와 수혜자에 대해 14밀리리터 배양 튜브에 라벨을 붙입니다. 각 기증자와 수혜자의 단일 콜로니를 선택하고 섭씨 37도에서 18시간 동안 200RPM의 Mueller Hinton Broth 2밀리리터에서 재배합니다.3일째에, 식염수의 10배 희석된 배양물을 볼텍싱 없이 600 나노미터에서 하룻밤 동안 배양하여 광학 밀도를 측정하였다. 필요한 경우 멸균된 식염수를 사용하여 광학 밀도를 2로 조정합니다. 1.5밀리리터 미세 원심분리기 튜브를 짝짓기 튜브로 표시하여 기증자와 수혜자 균주를 표시합니다.각 기증자와 수혜자의 조정된 현탁액 500 마이크로리터를 짝짓기 튜브에 옮기고 현탁액을 반전으로 부드럽게 혼합합니다. 500G에서 실온에서 10분 동안 결합 튜브를 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 결합 튜브에서 800마이크로리터의 상청액을 피펫팅하고 튜브에 200마이크로리터를 남깁니다. 섭씨 37도에서 18시간 동안 짝짓기 튜브를 배양합니다.또한, 음성 대조군으로서 배지 B의 기증자와 배지 A의 수혜자의 하룻밤 배양을 줄무늬로 만들고 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 4일째에 800마이크로리터의 식염수를 짝짓기 튜브에 넣고 볼텍싱에 의해 재현탁합니다. 짝짓기 현탁액을 연속적으로 희석하고 각 희석액 100 마이크로 리터를 배지 플레이트에 첨가하십시오.플레이트가 건조되면 섭씨 37도에서 18시간 동안 배양하고 원고에 설명된 대로 기증자 또는 수혜자당 접합 빈도를 계산합니다. 간단한 끓임 준비 추출 방법을 사용하여 박테리아 세포벽에서 DNA를 추출한 후 1.5밀리리터 튜브를 유전자 및 샘플의 이름과 함께 필요한 PCR 튜브의 풀로 표시합니다. 풀이라고 표시된 튜브에 멸균수, PCR 마스터 믹스, 프라이머 및 중합효소를 추가합니다.차가운 환경에서 최소 10회 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하십시오. 해당 튜브에 템플릿 DNA를 추가하고 PCR 튜브를 캡으로 고정합니다. PCR 튜브를 열순환기에 넣고 원고에 설명된 대로 내성 유전자 및 레플리콘에 대한 프로그램을 시작합니다.앰플리콘 확인을 위해, 250 밀리리터 플라스크에 아가로스와 TAE 완충액을 첨가하여 1%아가로스 겔을 제조하고, 마이크로웨이브를 이용하여 아가로스를 녹인다. 아가로스 용액이 약 섭씨 55도까지 냉각되면, 흄 후드 아래에서, 6 마이크로리터의 SYBR 그린을 첨가하고 혼합한다. 엎지르지 않도록 접착 테이프로 밀봉된 트레이에 젤을 붓고 탁도가 나타날 때까지 젤을 15-25분 동안 그대로 둡니다.접착 테이프를 제거한 후 겔을 전기 영동 챔버에 넣고 TAE 버퍼를 첨가하여 겔을 덮습니다. 6배 DNA 겔 로딩 염료 5마이크로리터를 각 반응물 25마이크로리터와 최소 10회 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 거품을 피하여 혼합물을 우물에 넣으십시오.4 마이크로리터의 1킬로염기쌍 DNA 래더를 제1 웰에 첨가한 후, 챔버 뚜껑을 닫고 120 볼트 및 400 밀리암페어에서 60 분 동안 겔을 작동시킨다. 자외선 아래에서 젤을 시각화하고 이미지를 기록합니다. MacConkey 한천은 큰 분홍색 콜로니를 생성하는 유당 양성 기증자와 유당 음성이고 더 작은 옅은 노란색 콜로니를 생성하는 수혜자 및 transconjugants를 구별했습니다.공여체 균주 SSW4955의 5가지 접합 효율은 모두 동일한 크기 차수 내에 있었으며, 이는 접합 플라스미드의 동원이 형질접합체 식별에 사용된 선택에 관계없이 검출될 수 있음을 나타냅니다. 반면 공여체 균주 SSW7037은 접합 효율이 3배 더 낮은 것으로 나타났으며, 이를 통해 동일한 수용자와 서로 다른 공여체 및 플라스미드 유형의 접합 효율을 비교할 수 있습니다. PCR 산물의 겔 전기영동은 transconjugants에서 예상되는 replicon의 존재를 확인했습니다.이 분석은 선택 가능한 마커에 전적으로 의존합니다. 각 선택이 작동하는지 확인하기 위한 제어가 있어야 하며 transconjugants는 비색계 또는 PCR로 확인해야 합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 생체 내 접합 또는 생물막 모델 연구 및 접합 효율을 조절하는 변수 연구에 적용할 수 있습니다.대규모로 동원 가능한 플라스미드를 검출하기 위한 이 프로토콜은 환경 전반에 걸친 유전자의 흐름에 대한 우리의 이해와 접합의 효율성에 영향을 미치는 변수를 연구하는 데 크게 도움이 될 것입니다.

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

Abstract