La persistenza degli antibiotici descrive la capacità di piccole sottopopolazioni all'interno di una popolazione isogena sensibile di tollerare transitoriamente alte dosi di antibiotici battericidi. Il presente protocollo combina approcci per caratterizzare il fenotipo di persistenza antibiotica a livello molecolare e cellulare dopo aver esposto Escherichia coli a dosi letali di ofloxacina.
La persistenza antibiotica si riferisce alla capacità di piccole sottopopolazioni batteriche di tollerare transitoriamente alte dosi di antibiotici battericidi. Dopo il trattamento antibiotico battericida, la maggior parte della popolazione batterica viene rapidamente uccisa. Questa prima fase rapida di uccisione è seguita da una sostanziale diminuzione del tasso di uccisione man mano che le cellule persistenti rimangono vitali. Classicamente, la persistenza è determinata a livello di popolazione da saggi time/kill eseguiti con alte dosi di antibiotici e per tempi di esposizione definiti. Mentre questo metodo fornisce informazioni sul livello delle cellule persistenti e sulla cinetica di uccisione, non riesce a riflettere l'eterogeneità intrinseca cellula-cellula alla base del fenomeno di persistenza. Il protocollo qui descritto combina i classici saggi time/kill con l'analisi a singola cellula utilizzando la microscopia a fluorescenza in tempo reale. Utilizzando appropriati reporter fluorescenti, l'imaging al microscopio delle cellule vive può fornire informazioni sugli effetti dell'antibiotico sui processi cellulari, come la replicazione e la segregazione cromosomica, l'allungamento cellulare e la divisione cellulare. La combinazione dell'analisi della popolazione e di una singola cellula consente la caratterizzazione molecolare e cellulare del fenotipo di persistenza.
Questo protocollo mira ad analizzare il fenotipo di persistenza batterica in risposta a specifici trattamenti antibiotici a livello di singola cellula e di popolazione. La persistenza descrive la capacità di piccole sottopopolazioni all'interno di una popolazione isogena di sopportare alte dosi di antibiotici battericidi (fluorochinoloni, aminoglicosidi, β-lattamici, ecc.), con la concentrazione inibitoria minima (MIC) delle cosiddette cellule persistenti identica a quella della maggior parte della popolazione. Le dinamiche di uccisione bifasica, quando misurano la sopravvivenza batterica nel tempo in presenza di un antibiotico, rivelano la presenza di cellule transitoriamente tolleranti ai farmaci, con una rapida eradicazione iniziale delle cellule non persistenti, seguita da un tasso di uccisione molto più lento delle cellule persistenti. Dopo la rimozione dell'antibiotico, queste cellule danno origine a una popolazione geneticamente identica che mostra dinamiche di uccisione simili quando trattata con lo stesso antibiotico 1,2. In contrasto con la persistenza, la resistenza agli antibiotici è definita a livello di popolazione ed è generalmente una conseguenza di mutazioni de novo o del trasferimento genico orizzontale di un plasmide 3 che conferisceresistenza. Mentre le mutazioni responsabili della resistenza sono per lo più localizzate nel bersaglio del farmaco o nelle regioni promotorie delle pompe di efflusso del farmaco, i geni che alterano la frequenza di persistenza identificati dagli approcci di analisi dei mutanti a livello di genoma e mirati si sono dimostrati numerosi e diversi 2,3,4,5,6,7,8 . Pertanto, è probabile che le cellule batteriche possano entrare nello stato di persistenza attraverso percorsi multipli 9,10,11, e sono necessari approcci per studiare il fenomeno di persistenza a livello di singola cellula per caratterizzare la fisiologia di queste cellule persistenti.
Il recente sviluppo di strumenti microfluidici utilizzati in combinazione con la microscopia a fluorescenza ha aperto la strada alla caratterizzazione del fenotipo di persistenza e ha evidenziato il ruolo dei processi cellulari chiave, come la replicazione cromosomica12, la riparazione del DNA 13 e la divisione cellulare14, nella formazione delle cellule persistenti. In questo articolo, descriviamo un approccio integrato che combina saggi di microbiologia classici con imaging live a singola cellula per caratterizzare le cellule persistenti generate in colture di Escherichia coli in crescita esponenziale trattate con un'alta dose di ofloxacina. Il protocollo qui descritto può essere applicato per studiare il fenomeno della persistenza antibiotica in altre specie batteriche, come il Bacillus subtilis15, o condizioni (ad esempio, persistenza antibiotica dopo trattamento con β-lattamici 16) e può essere facilmente modificato per indagare i numerosi fenomeni che coinvolgono l'eterogeneità fenotipica17,18,19 . Inoltre, la configurazione descritta in questo articolo può essere combinata con altri reporter fluorescenti per studiare parametri cellulari distinti di interesse, come i livelli intracellulari di pH20 o ATP21 a livello di singola cellula, che possono potenzialmente produrre nuove intuizioni sul fenomeno della persistenza antibiotica.
NOTA: Utilizzare vetreria di coltura sterile, punte per pipette e terreno di coltura. Qui, le cellule di E. coli sono state coltivate in un mezzo a bassa autofluorescenza chimicamente definito (vedi Tabella dei materiali). Le inoculazioni sono state eseguite in presenza di un bruciatore Bunsen per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.
1. Coltura cellulare e curva di crescita
2. Determinazione della concentrazione minima inibitoria degli antibiotici
NOTA: La concentrazione minima inibitoria (MIC) è definita come la dose più bassa di antibiotico alla quale non si osserva crescita batterica. La determinazione della MIC deve essere eseguita per ciascun antibiotico e ceppo. Negli esperimenti qui descritti, è stato utilizzato l'antibiotico fluorochinolone ofloxacina (OFX). La determinazione del MIC consente di confermare che la soluzione antibiotica è stata preparata correttamente, che l'antibiotico è attivo e che i ceppi sono ugualmente sensibili all'antibiotico. Qui, il metodo di diluizione dell'agar pubblicato è stato eseguito per determinare il MIC in OFX dei diversi ceppi utilizzati24. Il MIC di un dato antibiotico per un dato ceppo batterico può anche essere determinato tramite il metodo di diluizione del brodo24.
3. Saggio a campione
NOTA: Il metodo del saggio spot è un approccio qualitativo che consente la stima del numero di cellule vitali (cellule in grado di generare colonie dopo stress antibiotico). Il test spot viene eseguito prima del test time-kill per fornire informazioni sulla fattibilità del ceppo utilizzato nelle condizioni testate e per informare sulle diluizioni necessarie durante il test time-kill (vedere paragrafo 4).
4. Saggi time-kill
NOTA: Mentre i saggi spot sono un metodo facile da usare per stimare il tasso di sopravvivenza di un dato ceppo per un determinato antibiotico, i saggi time-kill danno un tasso di sopravvivenza ad alta risoluzione e vengono eseguiti per quantificare con precisione la vitalità batterica. Il profilo della curva di uccisione può essere utilizzato per determinare se un determinato ceppo batterico è sensibile, tollerante o resistente all'antibiotico in una determinata condizione. Inoltre, i saggi time-kill consentono di determinare il tempo di esposizione agli antibiotici necessario per rilevare il fenomeno di persistenza (inizio della seconda pendenza della curva di uccisione bifasica) e la frequenza di persistenza.
5. Microscopia microfluidica time-lapse
NOTA: La sezione seguente descrive la preparazione della piastra microfluidica e la procedura di acquisizione e analisi delle immagini time-lapse. Lo scopo di questo esperimento è quello di osservare e analizzare il fenotipo di persistenza dopo il trattamento antibiotico a livello di singola cellula. I dati raccolti durante questo esperimento possono essere utilizzati per generare una vasta gamma di risultati a seconda della domanda affrontata e / o dei reporter fluorescenti utilizzati durante l'esperimento. Nell'esperimento qui descritto, è stata effettuata un'analisi quantitativa della lunghezza cellulare e della fluorescenza HU-mCherry22, che riflette l'organizzazione nucleoidale nelle cellule persistenti e non persistenti.
Come descritto sopra, i ceppi utilizzati per l'analisi fenotipica a singola cellula delle cellule persistenti sono stati caratterizzati in MOPS glicerolo 0,4% medio. Il monitoraggio dell'OD600nm nel tempo non ha mostrato alcuna differenza tra i ceppi wt e hupA-mCherry (Figura 1). Ciò indica che l'espressione della proteina di fusione HU-mCherry non ha influito sulla crescita in queste condizioni. Le cellule batteriche di entrambi i ceppi inizialmente inoculati a un OD600 nm di 0,01 hanno raggiunto la fase esponenziale ±8 h dopo l'inoculazione.
Il MIC di OFX è stato determinato con metodi standardizzati (qui, diluizione seriale dell'agar)24. La MIC è definita come la concentrazione minima in cui non viene rilevata alcuna crescita visibile. Il MIC di OFX per entrambi i ceppi è stato determinato essere 0,06 μg·mL−1, indicando che la fusione hupA-mCherry non ha avuto alcun effetto sulla sensibilità all'OFX rispetto al ceppo isogenico wt (Figura 2).
Abbiamo inoltre determinato l'effetto di un trattamento OFX letale (83 volte MIC) sulla vitalità di entrambi i ceppi utilizzati in questo studio. Poiché la conta delle cellule vitali diminuisce nel tempo con l'esposizione a OFX, le diluizioni delle colture batteriche devono essere regolate in modo appropriato per raggiungere da 30 a 300 colonie per piastra. Per determinare le diluizioni appropriate nel tempo, è stato eseguito un test spot, in cui sono stati posizionati 10 μL da 0 a 10−7 diluizioni seriali 10 volte su piastre di Petri quadrate utilizzando una pipetta multicanale. Le diluizioni appropriate erano quelle in cui erano visibili cloni isolati (ad esempio, a t0 = 10−5, t1h = 10−4/10−3, t4h = 10−2/10−1) (Figura 3).
Mentre il test spot è un metodo semplice per ottenere informazioni sulla cinetica dell'uccisione mediata da OFX, non riesce a determinare con precisione le dinamiche di uccisione. Quando la vitalità delle cellule in crescita esponenziale trattate con OFX è stata monitorata dal saggio time-kill, è stata osservata una tipica curva bifasica (Figura 4). La prima pendenza della curva riflette la rapida uccisione della popolazione non persistente (linea tratteggiata rossa). Nelle condizioni qui testate, fino al 99,9% delle cellule non è stato in grado di formare colonie dopo 3 ore in presenza di OFX. Questa prima fase di uccisione è seguita da una seconda fase, che mostra un tasso di uccisione più lento (linea tratteggiata blu), che rivela la presenza di cellule persistenti tolleranti ai farmaci. Nelle condizioni testate, la fase di persistenza è iniziata circa 3 ore dopo l'aggiunta di OFX, evidenziando la necessità di esporre le cellule all'OFX per più di 3 ore per studiare i fenotipi persistenti. È importante sottolineare che la curva time-kill mostra che la proteina di fusione hupA-mCherry non ha avuto alcun effetto sulla cinetica time-kill. Il ceppo che codifica la fusione fluorescente traslazionale può quindi essere utilizzato per monitorare le cellule persistenti utilizzando la microscopia a fluorescenza.
Abbiamo inoltre studiato il fenomeno della persistenza a livello di singola cellula. Per fare ciò, il ceppo hupA-mCherry è stato introdotto in una piastra microfluidica, che ha permesso il cambiamento delle condizioni del mezzo (qui, crescita, trattamento e recupero) durante l'esecuzione della microscopia time-lapse su un dato ROI. Durante la prima fase dell'esperimento microfluidico, le cellule introdotte nel dispositivo microfluidico sono state perfuse con terreno di crescita (MOPS glicerolo 0,4%) e divise con un tempo di generazione di ~ 2 h (Figura 5 e Figura 6). Questa prima fase di crescita indica che le cellule erano vitali e si dividevano attivamente prima del trattamento OFX.
Dopo questa prima fase di crescita, le cellule sono state perfuse con terreno di crescita integrato con 5 μg·mL−1 OFX per 6 ore. Non appena l'antibiotico ha raggiunto le cellule, la divisione cellulare è stata bloccata (Figura 5 e Figura 6). Dopo 6 ore di trattamento OFX, le cellule sono state perfuse con terreno fresco. Mentre la stragrande maggioranza delle cellule non era in grado di riprendere la crescita (Figura 5 e Figura 6), una piccola sottopopolazione di batteri era in grado di allungare e generare cellule filamentose25. Queste cellule, che sono state in grado di dividersi e generare cellule figlie vitali dopo il trattamento OFX, possono essere definite come cellule persistenti.
Poiché questa configurazione consente la visualizzazione delle cellule persistenti prima, durante e dopo il trattamento, non solo fornisce informazioni sul fenotipo persistente durante la fase di recupero, ma anche sullo stato fisiologico delle cellule persistenti prima del trattamento (Figura 6). Nelle condizioni testate, le cellule persistenti si sono divise in modo simile alle cellule non persistenti prima del trattamento OFX, indicando che le cellule persistenti osservate non provenivano da una sottopopolazione dormiente (Figura 6)25.
L'analisi della lunghezza cellulare delle cellule persistenti durante la fase di recupero ha rivelato che ogni filamento aveva una velocità specifica di allungamento. La lunghezza della cella raggiunta da ciascun persistente prima della prima divisione differiva da un persister all'altro. Allo stesso modo, la tempistica dell'evento di prima divisione era altamente eterogenea (Figura 6). Il filamento persistente in divisione ha generato più cellule figlie, che hanno iniziato a crescere e dividersi, per la maggior parte, in modo simile alle cellule non trattate (Figura 7). La successiva divisione del filamento ha poi comportato una progressiva diminuzione della lunghezza della cellula, dando infine origine a cellule figlie con lunghezza cellulare simile a prima del trattamento OFX (Figura 6 e Figura 7B). La stragrande maggioranza delle cellule non è stata in grado di indurre la filamentazione dopo la rimozione di OFX. Questa grande popolazione cellulare corrisponde alle cellule morte (Figura 5 e Figura 6).
La fusione fluorescente della proteina HU associata al nucleoide consente la visualizzazione della dinamica del nucleoide22. L'analisi dell'intensità totale di fluorescenza di HU-mCherry all'interno della cellula può essere utilizzata come proxy per il contenuto di DNA22,25. Durante la fase di crescita (prima del trattamento OFX), l'intensità totale della fluorescenza mCherry variava, riflettendo la dinamica della replicazione cromosomica e della segregazione durante il ciclo cellulare (Figura 8). Dopo l'aggiunta di OFX, la fluorescenza di mCherry è aumentata a metà cellula, indicativa della compattazione nucleoide, che ha dimostrato essere indotta dalla formazione di rotture del DNA a doppio filamento28 (Figura 5). Le rotture del DNA a doppio filamento sono una conseguenza del meccanismo d'azione di OFX, che corrompe le topoisomerasi di tipo II DNA-girasi e la topoisomerasi IV29,30. In E. coli, la DNA-girasi è il bersaglio primario di OFX29,30. Legando il suo bersaglio in una fase critica del meccanismo di passaggio a doppio filamento, OFX inibisce la retrocessione dei filamenti di DNA scissi, portando infine al rilascio di rotture di DNA a doppio filamento30. Come descritto sopra, le cellule persistenti al trattamento OFX hanno iniziato a filarsi durante il recupero25 (Figura 6). L'aumento della lunghezza della cellula è correlato con un aumento dell'intensità totale della fluorescenza mCherry, che riflette il riavvio della replicazione e un aumento dell'abbondanza nucleoidale nel filamento25 (Figura 7a e Figura 8). Per le cellule morte, l'intensità totale della fluorescenza mCherry è rimasta stabile durante il trattamento e durante la fase di recupero, indicando che queste cellule non erano in grado di replicare i loro cromosomi dopo la rimozione di OFX (Figura 8). Viene anche mostrato un video microfluidico (Video 1) delle cellule di E. coli HU-mCherry prima, durante e dopo il trattamento con ofloxacina.
Figura 1: Monitoraggio della crescita dei ceppi di wt e hupA-mCherry E. coli. Monitoraggio della densità ottica (OD600 nm) di wt (nero) e hupA-mCherry (rosso). Le sfumature e le linee tratteggiate indicano le deviazioni standard dei triplicati biologici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Determinazione della MIC di OFX per i ceppi wt e hupA-mCherry E. coli. La wt () e l'hupA-mCherry (●) sono state coltivate in mezzo LB e 2 μL sono stati individuati su diluizioni seriali di agar LB contenente OFX (♦ concentrazione indicata in ciascun pannello in μg·mL−1). L'inibizione della crescita è visibile ad un minimo di 0,06 μg·mL−1. La figura è un esperimento rappresentativo di triplicati biologici. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Saggio a campione dei ceppi wt e hupA-mCherry E. coli dopo esposizione a OFX. I ceppi (A) wt e (B) hupA-mCherry sono stati coltivati in glicerolo MOPS 0,4% come descritto nel protocollo (sezione 3) e le cellule a crescita esponenziale (OD600 nm = 0,3) sono state trattate con 5 μg·mL−1 OFX. T0 corrisponde al punto temporale prima dell'aggiunta di OFX. T1, T2, T3, T4, T5 e T6 corrispondono a 1-6 h dopo l'aggiunta di OFX. La figura è un esperimento rappresentativo di triplicati biologici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Saggio time-kill dei ceppi wt e hupA-mCherry E. coli dopo esposizione a OFX. I ceppi wt () e hupA-mCherry (●) sono stati coltivati in glicerolo MOPS 0,4% come descritto nel protocollo (sezione 4) e le cellule a crescita esponenziale (♦ OD600 nm = 0,3) sono state trattate con 5 μg·mL−1 OFX. Le linee tratteggiate indicano la prima fase di uccisione "rapida" (rossa) e la seconda fase di uccisione "lenta" (blu), corrispondenti alle sottopopolazioni sensibili e persistenti (ottenute per regressione lineare tra T0 e T2, nonché tra T3 e T6, rispettivamente). Le barre di errore indicano le deviazioni standard dei triplicati biologici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Immagini rappresentative del persistente OFX e delle cellule morte utilizzando strumenti microfluidici. Immagini al microscopio rappresentative che mostrano i punti temporali rilevanti dell'esperimento microfluidico eseguito con il ceppo hupA-mCherry (contrasto di fase in grigio, segnale HU-mCherry in rosso). Le cellule che esprimono l'hupA-mCherry marcato sono state coltivate in una piastra microfluidica (qui, 4 ore), seguita da una sfida OFX (5 μg·mL−1). Dopo 6 ore in presenza di OFX, le cellule sono state perfuse con terreno fresco, consentendo alle cellule persistenti di recuperare. La cellula persistente e le sue cellule progenie durante il trattamento con OFX e dopo la rimozione di OFX sono evidenziate rispettivamente in verde e blu. I punti temporali corrispondenti sono indicati su ciascun pannello. Barra di scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Analisi time-lapse al microscopio della lunghezza delle cellule persistenti e morte. Analisi della lunghezza cellulare delle cellule morte (in rosso, n = 109) e delle cellule persistenti (in grigio, n = 13). L'inizio del trattamento OFX (5 μg·mL−1) è indicato dalla linea tratteggiata rossa (5 ore) e la rimozione di OFX è indicata dalla linea tratteggiata blu. L'inserto corrisponde alla fase di crescita prima dell'aggiunta di OFX. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia. Le sfumature e le linee tratteggiate indicano le deviazioni standard per la popolazione di cellule morte (n = 109). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Analisi time-lapse al microscopio di un persistente rappresentativo di OFX. (A) Cimografo di un persistente OFX rappresentativo e delle sue cellule figlie generate da divisioni di filamenti durante 8,5 ore dopo la rimozione di OFX (18,5 ore dopo l'inizio dell'esperimento microfluidico, comprendente 4 ore di crescita, 6 ore di 5 μg·mL−1 di trattamento OFX e 8,5 ore di recupero dopo rimozione di OFX). Un fotogramma corrisponde a 15 min. Barra della scala = 5 μm. (B) Maschera generata dal cimografo persistente in A. La cella persistente monitorata è indicata con un contorno blu e le celle figlie sono evidenziate in colori distinti. (C) Rappresentazione schematica della linea cellulare persistente generata da B. La codifica a colori è identica a B. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Analisi della lunghezza cellulare e della fluorescenza mCherry di cellule persistenti e morte rappresentative. Analisi della lunghezza della cella (asse sinistro) e dell'intensità totale della fluorescenza HU-mCherry (asse destro, mostrato in unità arbitrarie) di un persistente rappresentativo (linee nere e rosse solide) e di una cellula morta rappresentativa (linea nera e rossa tratteggiata) durante l'esperimento time-lapse microfluidico. L'inizio del trattamento con OFX (5 μg·mL−1) è indicato dalla linea tratteggiata rossa e la rimozione dell'OFX dalla linea tratteggiata blu. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Video 1: Video microfluidico di cellule di E. coli HU-mCherry prima, durante e dopo il trattamento con ofloxacina. Imaging time-lapse microfluidico che mostra cellule HU-mCherry. Le cellule sono state coltivate per 4 ore in MOPS glicerolo 0,4%. Dopo 6 ore di trattamento con OFX (5 μg·mL−1), il mezzo privo di antibiotici è stato perfuso nella piastra microfluidica per consentire alle cellule persistenti di recuperare. Barra della scala = 5 μm. Il tempo (in min) è indicato. Le fasi di crescita e recupero sono indicate da "MOPS-Gly. 0,4%" e il trattamento OFX con "OFX 5 μg/ml". Clicca qui per scaricare questo video.
MOPS 10x | |||
Soluzione madre | Volume della soluzione madre per 1 L di 10x MOPS | Concentrazione finale in base 10x MOPS | |
Acido MOPS | 1 M (regolato a pH 7,4 utilizzando KOH) | 400 ml | 0,4 M |
Patrizia | 1 M (regolato a pH 7,4 utilizzando KOH) | 40 ml | 0,04 M |
FeSO4.7H2O | 0,01 M | 10 ml | 0,0001 m |
NH4Cl | 1,9 M | 50 ml | 0,095 M |
K2SO4 | 0,276 M | 10 ml | 0,00276 m |
CaCl2.2H 2O | 0,0005 m | 10 ml | 0,000005 m |
MgCl 2.6H2O | 0,528 m | 10 ml | 0,00528 M |
NaCl | aggiungere direttamente 29,2 g | 0,5 M | |
Acqua distillata | 460 ml | ||
Micronutrimenti 1000x (vedi Tabella 2) | 10 ml |
Tabella 1: Composizione di 10x MOPS.
Micronutrienti 1000x | ||
Concentrazione in Micronutrimenti 1000x soluzione madre | Concentrazione finale in base 10x MOPS | |
(NH4)6Mo7O24.4H2O | 0,000003 m | 0,00000003 m |
H3 BO3 | 0,0004 m | 0,000004 m |
CoCl2.6H 2O | 0,00003 m | 0,0000003 m |
CuSO4.5H 2O | 0,00001 M | 0,0000001 M |
MnCl2.4H 2O | 0,00008 m | 0,0000008 m |
ZnSO.7H2O | 0,00001 M | 0,0000001M |
Tabella 2: Composizione di 1.000 micronutrienti.
MOPS glucosio 0,4% o MOPS glicerolo 0,4% | |||
Soluzione madre | Volume per 1 L MOPS glucosio 0,4 % o MOPS glicerolo 0,4 % | Concentrazione finale in glucosio MOPS 0,4% o glicerolo MOPS 0,4% | |
MOPS 10x | vedi tabella 1 | 100 ml | |
K2HPO4 | 0,132 M | 10 ml | 0,00132 M |
Glucosio (per MOPS glucosio 0,4%) | 20% (20 g in 100 ml di acqua distillata) | 20 ml | 0.40% |
Glicerolo (per MOPS glicerolo 0,4%) | ≤99% | 4 ml | 0.40% |
Acqua distillata | 870 ml per MOPS glucosio 0,4% o 886 ml per MOPS glicerolo 0,4% |
Tabella 3: Composizione di glucosio MOPS 0,4% e glicerolo MOPS 0,4%.
Il protocollo presentato in questo articolo consente l'analisi del fenotipo di persistenza osservato in risposta al trattamento antibiotico a livello di popolazione e di singola cellula. Gli esperimenti sono stati eseguiti con il ceppo E. coli MG1655, che è stato coltivato in un mezzo chimicamente definito (glicerolo MOPS 0,4%). Sono stati condotti saggi time-kill ed esperimenti di microscopia su colture in fase esponenziale. Abbiamo usato OFX, un fluorochinolone, ad una concentrazione di 5 μg·mL−1 per rivelare le cellule persistenti. Gli approcci qui descritti possono essere applicati ad altri antibiotici battericidi, come β-lattamici, aminoglicosidi o composti antimicrobici31. Di conseguenza, possono essere utilizzati altri ceppi batterici, mezzi o condizioni di crescita. Il monitoraggio di diverse fusioni fluorescenti in una configurazione simile a quella descritta qui può essere utile per seguire processi cellulari come la replicazione del DNA32, la riparazione del DNA25,33 e la divisione cellulare34 prima, durante e dopo il trattamento antibiotico. Allo stesso modo, i reporter fluorescenti possono essere sfruttati per indagare aspetti distinti della fisiologia cellulare, come i livelli intracellulari di pH35, ATP 36 o ROS37. In alternativa alle fusioni fluorescenti, potrebbero essere applicati anche coloranti chimici. Ad esempio, la fusione hupA-mCherry potrebbe essere sostituita da 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), un colorante fluorescente che colora il DNA38. L'esecuzione di microscopia time-lapse accoppiata con tali coloranti fluorescenti dovrebbe, tuttavia, essere evitata, poiché queste tecniche di colorazione possono perturbare la dinamica del ciclo cellulare durante gli esperimenti time-lapse. In alternativa, tali esperimenti possono essere sostituiti da analisi del corso temporale dell'imaging istantaneo in punti temporali rilevanti.
Mentre tali reporter fluorescenti sono utili, la quantità di informazioni che possono essere estratte attraverso l'analisi delle immagini a contrasto di fase non dovrebbe essere trascurata. Qui, abbiamo monitorato l'evoluzione della lunghezza cellulare durante le fasi di crescita, trattamento OFX e recupero. Altri parametri basati su immagini a contrasto di fase, come la larghezza della cella, l'intensità del contrasto di fase e le curvature delle cellule batteriche, possono anche essere estratti con facilità utilizzando software adeguati, come MicrobeJ27.
In sintesi, la procedura qui descritta può essere applicata ad altre condizioni e specie batteriche per monitorare le risposte cellulari a cambiamenti ambientali o fattori di stress18,19. Utilizzando altri reporter fluorescenti (reporter trascrizionali e traslazionali, coloranti chimici) in combinazione con un'analisi di popolazione, come la citometria a flusso / FACS, domande interessanti possono essere affrontate in un quadro multiscala.
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Il lavoro nel laboratorio Van Melderen è supportato dalle azioni ARC 2018-2023, il Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. è supportato da una borsa di studio ULB. T.S. è supportato da una borsa di studio FRIA (FNRS). J.C. è sostenuto da una borsa di studio post-dottorato "chargé de recherches" (FNRS).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Axio Observer | Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
CaCl2.2H2O | Merck | 1.02382.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CoCl2.6H2O | Merck | 1.02539.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
CuSO4.5H2O | Merck | 1.02790.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
D-(+)-glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium |
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) | BE10 | wt reference strain, lab strain | |
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT | BE16 | HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain | |
FeSO4.7H2O | VWR Chemicals | 24244.232 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software; Schindelin et al. if used in publication |
Glycerol | Merck | 56815 | Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate | Merck | M8812-100EA | 24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader |
H3BO3 | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Digital Image Acqusition |
K2HPO4 | Merck | 1.05099.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
KOH | Merck | 1.05029.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
K2SO4 | Merck | 1.05153.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Luria-Broth agar medium | Invitrogen | 22700041 | Growth medium for plating assay |
Luria-Broth medium | Invitrogen | 12780029 | Growth medium for MIC determination |
MgCl2.6H2O | Merck | 1.05832.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
MgSO4 | Merck | 7487-88-9 | Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM |
MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck | B04A-03-5PK | Plate for microfluidic system |
MnCl2.4H2O | Merck | 1.05927.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
MOPS, Free Acid ULTROL® Grade | Merck | 475898-500GM | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
NaCl | SIgma-Aldrich | S5886-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
(NH4)6Mo7O24.4H2O | Merck | 1.01180.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Ofloxacin | Merck | 82419-36-1 | Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x | Merck | P3813 | Dilution buffer |
GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | 840-208200 | UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm |
SoftMax Pro | Molecular Devices | Microplate reader software | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine | Merck | 1.08602.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Zeiss® immersion Oil 518F | Zeiss | Immersion oil to increase resolution of microscope | |
Zen3.2 Pro | Zeiss | Microscopic image acquisition and processing software | |
ZnSO4.7H2O | Merck | 1.08883.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
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