다이어그램 작성을 해준 시카고 대학교의 데일 메르테스(Dale Mertes), 이스탄불 메디폴 대학교 보건 과학 및 기술 연구소의 기술 지원을 해준 메흐메트 세리프 아이딘 박사, 원고 편집을 해준 말테페 대학교의 라나 카제미 박사에게 감사드립니다.

1. 오가노이드 및 스페로이드 배양
<ol><li>하이드로겔을 얼음 위에 밤새도록(냉장고 또는 차가운 방에서) 넣어 해동합니다.</li>
	<li>시판되는 다목적 장치(MD; 재료 표 참조)를 실험 1일 전에 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에 넣고 따뜻하게 한다.</li>
	<li>멸균된 넓은 피펫 팁을 4°C의 냉장고에 넣습니다. 참고: 1.1-1.3단계는 0일차에 수행되고 1.4-1.11단계는 1일에 수행됩니다.<...

여기에 설명된 제형 및 프로토콜을 보완하는 MD는 보다 통제된 환경에서 오가노이드 및 스페로이드의 빠르고 자발적인 3D 성장을 촉진하고 동일한 조건에서 실험을 계속합니다. 표본은 전체 프로세스 동안 동일한 환경에 유지되며 3D 성장 아키텍처의 거의 100%가 컨테이너에 그대로 유지됩니다. 이는 순차적 실험 동안 균질성을 향상시키고 연장된 배양 기간을 허용합니다. 또한 오가노이드 및 스페?...

세포 연구 및 치료의 미래는 3D 세포 배양 1,2,3에 있습니다. 오가노이드 및 스페로이드 모델은 인체 발달, 생리학 및 질병 4,5,6,7,8,9 를 모방하는 더 나은 모델을 만들어 시험관 내 실험과 동물 모델 간의 격차를 좁힙니다. 그러나 이러한 모델의 재현성과 반복성은 여전히 어렵습니다. 또한 현재 기술로 이러한 구조를 취급, 수확, 이송 및 원심분리하면 많은 조건에서 오가노이드 및 스페로이드가 손실되거나 손상되어 결과에 큰 영향을 미칩니다.

조직학적 염색, 면역조직화학 염색, 면역형광 표지 및 동결보존을 위한 많은 프로토콜에도 불구하고 실험 조건을 표준화하고 이러한 섬세한 구조를 손실하거나 손상시키지 않고 취급 및 처리하는 것과 관련된 보편적인 접근 방식은 없습니다. 현재 프로토콜은 며칠에서 몇 주까지 번갈아 가며 엄청나게 길며 다양한 시약10,11,12,13,14를 사용한 복잡한 절차를 포함합니다. 또한 세포 배양 용기와 냉동 비알 간의 3D 성장 구조를 수확, 피펫팅, 원심분리 및 이송하면 구조의 위치와 기계적 힘이 변경되고 궁극적으로 오가노이드 및 스페로이드의 분화 및 성숙에 영향을 미칩니다. 조직 토폴로지, 세포의 위치 및 기계적 힘이 세포 분화 및 성숙에 상당한 영향을 미치는 것으로 보고되었습니다 6,15,16,17.

따라서, 현재의 종래식 기술을 개선하여 안정적인 품질의 오가노이드 및 스페로이드를 생성하는 것이 바람직하다. 위에서 설명한 원심분리 및 기타 단계를 건너뛰고 여러 공정의 시작부터 끝까지 단일 안전한 환경에서 재료를 제공하는 방법/장치는 가장 일관되고 신뢰할 수 있는 데이터에 도달하는 데 도움이 될 것입니다. 또한 시간, 노동 및 비용 제약을 줄일 수 있습니다.
여기에 설명된 다목적 장치(MD)는 오가노이드 및 스페로이드의 여러 공정을 위한 단일 안전 환경을 제공합니다(보충 그림 1). 이 장치와 보완 프로토콜은 수확, 피펫팅, 이송 및 원심분리 단계를 제거합니다. 오가노이드와 스페로이드는 순차적 과정 동안 시험관 내 환경에 남아 있습니다. 이 환경은 주로 상업적으로 이용 가능한 하이드로 겔과 같은 천연 또는 합성 세포 외 기질 성분으로 구성됩니다. 즉, 여기에 설명된 방법을 사용하면 오가노이드/스페로이드의 전체 장착 샘플을 하이드로겔 방울에 있는 동안 처리, 검사 및 냉동할 수 있습니다.
생체 적합성 장치는 60 ° C에서 -160 ° C 사이의 온도에 견딜 수 있으므로 -160 ° C의 액체 질소 탱크에서 유기체 / 스테로이드를 복원하거나 60 ° C에서 전자 현미경 용 수지 블록을 준비 할 수 있습니다. 이 장치의 틈새는 3D 성장 구조를 위한 제한된 공간을 정의하고 이전 연구 18,19,20,21,22,23을 기반으로 스페로이드 또는 오가노이드의 형성을 자극하도록 설계되었습니다. 장치의 해당 부분은 투명하며 높은 광학 품질을 제공하는 특정 플라스틱을 포함합니다(굴절률: 1.43, abbe 값: 58, 두께: 7.8mil[0.0078in 또는 198μm]). 틈새와 주변의 '측면'부분 모두자가 형광을 유발합니다. 중앙의 투명한 틈새는 80mm 2 면적이고 측면 부분은 600mm2입니다. 용기의 깊이는 15mm이고 두께는 1.5mm입니다. 이러한 기능은 장치의 크기와 디자인 외에도 다양한 유형의 첨단 현미경에서 관찰하고 전자 현미경 검사를 위해 샘플을 준비 할 수있게합니다 (그림 2). 장치의 폐쇄 시스템은 냉동실에 밀봉 된 위치와 인큐베이터에서 가스 흐름을 허용하는 두 가지 위치를 제공합니다. CCK8 증식 및 세포 독성 분석은 전통적인 세포 배양 접시와 비교하여 세포에 대한 유사한 효과를 보여줍니다 (보충 그림 2). 트리판 블루 배제 테스트는 MD에서 세포 배양 중 높은 세포 생존율(94%)을 보여줍니다(그림 3).
단일 장치에서 하나의 샘플에 대해 수행할 수 있는 공정은 (1) 배양, (2) 조직학적 염색, (3) 면역조직화학 및 면역형광 표지를 포함한 면역염색, (4) 동결, (5) 해동, (6) 명시야, 암시야, 형광, 공초점 및 초고해상도 현미경과 같은 광학 현미경으로 검사, (7) 주사 전자 현미경으로 직접 코팅 및 검사, 또는 (8) 투과 전자 현미경 준비( 그림 2).
조직학적 염색, 면역조직화학적 표지 또는 형광 표지 오가노이드 및 스페로이드 10,11,12,13,14,24,25에 대한 다양한 방법론이 존재합니다. 하이드로겔에서 이를 수확하는 것은 현재 기술의 첫 번째이자 주요 단계입니다. 이 단계 후에 일부 방법은 전체 마운트 면역 표지를 허용합니다. 수확된 오가노이드는 파라핀에 포매되고, 절편화되고, 다른 오가노이드의 염색 및 면역염색을 위해 표지됩니다. 그러나 섹션은 전체 샘플을 제공하지 않을 수 있으며 구조의 3D 아키텍처와 관련된 제한된 데이터만 제공할 수 있습니다. 또한 이러한 3D 구조의 손상과 항원성 손실은 이러한 기술의 잘 알려진 부작용입니다.
이 기사의 현미경 검사를 위한 보완적인 새로운 프로토콜을 통해 여전히 하이드로겔에 있는 전체 마운트 샘플을 분석할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 면역조직화학용 용액(S-IHC)과 면역형광표지용 용액(S-IF)이라는 두 가지 새로 개발된 제형이 포함됩니다. 이러한 솔루션을 사용한 방법을 통해 연구원은 섬세한 구조의 원심분리, 피펫팅 및 이송과 같은 기존 워크플로의 유해한 영향이 없기 때문에 보다 정확한 데이터를 얻을 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 또한 수확, 차단, 제거 및 항원 검색 단계의 필요성을 제거하고 전체 절차를 6-8시간으로 단축합니다. 또한, 상기 방법론은 동일한 S-IF에 1 내지 3개의 항체를 동시에 첨가하는 것을 허용한다. 따라서 여러 표지 실험 후에도 같은 날에 결과를 얻을 수 있으며 이는 여기에 설명된 프로토콜의 또 다른 이점입니다. 기존의 전체 마운트 면역형광 표지 프로토콜은 일반적으로 3일에서 몇 주가 소요됩니다 10,11,12,13,14.
항원성을 감소시키는 또 다른 유해한 단계인 파라핀 임베딩도 생략됩니다. 3D 구조는 현미경 검사의 시작부터 끝까지 체외 환경에 남아 있습니다. 3D 구조가 성장 조건에 남아 있기 때문에 단백질 발현 및 위치 파악 데이터가 생체 내 조건을 더 잘 모방합니다. 이 방법론은 샘플의 항원 발현에 영향을 미치는 단계를 제거하기 때문에 더 정확한 결과가 예상됩니다. 표 1과 표 2는 이러한 새로운 프로토콜이 기존 워크플로에 비해 단계를 제거하고 실험실에서 시간과 노동력을 절약하며 비용과 폐기물을 줄이는 방법을 보여줍니다. 
위에서 설명한 중요한 단계 외에도 또 다른 문제는 더 높은 세포 생존율 26,27,28,29,30,31로 샘플의 3D 구조를 보존하는 동결 보존 배지 및 방법을 제공하는 것입니다. 냉동 보존은 안정적인 모델 시스템을 만들고 오가노이드 및 스페로이드32,33의 바이오뱅킹을 가능하게 하는 데 필수적입니다. 바이오 뱅킹 전체 원래 3D 구조는 건강 또는 질병의 자연 상태를보다 충실하게 요약 할 수 있습니다. 주요 고려 사항은 동결 보존의 편의성과 신뢰성 및 오가노이드/스페로이드의 해동입니다. 해동 후 오가노이드 회수율은 대부분의 최신 기술에서 매우 낮으며 종종 50% 미만입니다. 그러나 최근 연구에 따르면 생존율이26,27,28,29 향상되어 유망한 결과가 나타났습니다. Lee 등은 스페로이드 세포의 78%가 15% DMSO28을 함유한 위스콘신 대학 용액을 사용했을 때 동결보존 후 생존했음을 입증했습니다. 세포 생존율은 Arai et al.29의 연구에서 83 %로 증가했습니다. 그러나 동결 보존 후 결과는 3D 구조가 동일한 특성과 품질을 유지할 수 없기 때문에 크게 영향을받습니다. 또한 무혈청 시약은 제약 및 진단 환경에서 우수한 제조 관행에 필요합니다. 전통적인 워크플로우는 느린 냉동 방법을 위해 소 태아 혈청(FBS)과 디메틸설폭사이드(DMSO)가 포함된 배지를 사용하며, 둘 다 장애와 관련이 있습니다. FBS는 동물 유래 제품이며 배치 변형이 있을 수 있습니다. DMSO는 매우 성공적인 동결 방지제이지만 장기간 노출, 특히 해동 중에 세포 독성 효과를 유발할 수 있습니다30,31.
이 기사는 또한 하이드로겔에 있는 동안 전체 오가노이드 또는 스페로이드의 동결/해동 방법론에 대해 설명합니다. 이 연구에는 오가노이드 및 스페로이드 냉동을 위한 두 가지 공식이 사용되었습니다: (1) 전통적인 동결 용액(FS)을 함유한 10% DMSO 및 (2) 혈청 및 DMSO가 없는 동결 보존 배지. 이 동결 보존 배지에는 현재 공식과 다른 세포 외 기질 성분이 포함되어 있습니다. 세포외 기질은 거대분자, 프로테오글리칸 및 섬유질 단백질의 두 가지 주요 부류로 구성되며, 이는 세포 구성 요소에 대한 물리적 스캐폴딩에 필수적이지만 조직 형태 형성, 분화 및 항상성에 필요한 과정을 시작합니다. 34,35,36,37,38,39,40 . 콜라겐은 인장 강도를 제공하고, 세포 접착을 조절하고, 화학 주성 및 이동을 지원하고, 조직 발달을 지시합니다37. 또한, 엘라스틴 섬유는 반복적 인 스트레칭(38)을 겪는 조직에 반동을 제공한다. 제 3 섬유질 단백질인 피브로넥틴은 간질 세포외 기질의 조직을 지시하고, 세포 부착을 매개하는데 결정적인 역할을 하고, 세포외 메카노-조절자로서 기능한다(39). Du 등은 천연 악토미오신 모델 시스템41에 대한 닭 콜라겐 가수분해물의 동결보호 효과를 입증하였다. 그들의 결과는 콜라겐 가수 분해물이 얼음 결정 성장을 억제하고 상업용 동결 방지제와 유사하게 단백질 동결 변성 및 산화를 감소 시키며 동결-해동주기 후에 더 나은 겔 구조를 제공 할 수 있음을 시사합니다. 따라서 동결 보존 배지에 세포 외 매트릭스 성분을 추가하면 샘플에보다 안전하고 보호적인 환경을 제공하고 동결 - 해동 후 치유 할 수있는 살아있는 구조를 지원합니다.
또한, 본 연구는 살아있는 오가노이드 및 스페로이드의 세포질 막과 핵이 여전히 하이드로겔에 있는 동안 라벨링하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

세포 배양 실험실에서 3차원 성장 구조인 오가노이드와 스페로이드는 인체를 더 잘 모방하고 동물 연구에 비해 이점이 있기 때문에 2차원 배양 모델에 비해 우수한 모델로 점점 더 인식되고 있습니다. 그러나 이러한 연구는 일반적으로 재현성 및 일관성 문제에 직면합니다. 서로 다른 세포 배양 용기 간의 오가노이드 및 스페로이드 이동, 피펫팅 및 원심분리와 같은 긴 실험 과정에서 이러한 취약하고 깨지기 쉬운 3D 성장 구조는 종종 손상되거나 손실됩니다. 궁극적으로 3D 구조는 동일한 특성과 품질을 유지할 수 없기 때문에 결과에 큰 영향을 미칩니다. 여기에 설명된 방법은 이러한 스트레스가 많은 단계를 최소화하고 오가노이드 및 스페로이드가 다목적 장치의 하이드로겔에 있는 동안 처리 시퀀스 전반에 걸쳐 안전하고 일관된 환경을 보장합니다. 연구원들은 단일 다목적 장치를 사용하여 컨포칼에서 전자 현미경에 이르기까지 다양한 첨단 장비에서 오가노이드 또는 스페로이드의 구조를 성장, 냉동, 해동, 가공, 염색, 라벨링 및 검사할 수 있습니다. 이 기술은 연구의 재현성, 신뢰성 및 타당성을 개선하는 동시에 처리 중 3D 성장 구조에 대한 안정적이고 보호적인 환경을 유지합니다. 또한 스트레스가 많은 단계를 제거하면 취급 오류를 최소화하고 소요 시간을 줄이며 오염 위험을 줄일 수 있습니다.

본 논문은 고유하게 설계된 단일 환경에서 하이드로겔에 있는 동안 전체 오가노이드 또는 스페로이드의 배양, 냉동, 해동, 조직학적 염색, 면역조직화학 염색, 면역형광 라벨링, 코팅 및 처리를 위한 다목적 장치(MD) 및 보완 방법론을 나타냅니다. 현재 연구는 2 MD에서 35 개의 하이드로 겔 방울로 HepG35 간암 스페로이드를 준비하도록 설계되었습니다. 실험은 정확성을 보장하기 위해 삼중으로 수행?...

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Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

본 연구는 다양한 현미경으로 전체 스페로이드 및 오가노이드를 배양, 냉동, 해동, 가공, 염색, 라벨링 및 검사하는 방법론을 설명하지만 다목적 장치 내의 하이드로겔에 그대로 유지됩니다.

배양, 냉동, 처리 및 전체 오가노이드 및 스페로이드의 이미징 상태를 하이드로겔에 있는 동안

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

유기체와 스페로이드는 매우 약해서 취급 중에 심각하게 손상됩니다. 당사의 프로토콜은 이러한 3D 성장 구조가 다양한 공정 중에 그대로 유지되도록 하여 정확성, 재현성, 신뢰성 및 반복성을 높입니다. 연구원은 단일 다목적 장치 내에서 하이드로겔에 손상되지 않은 상태로 유지하면서 다양한 현미경으로 전체 오가노이드와 스페로이드를 배양, 냉동, 해동, 처리, 염색, 라벨링 및 검사할 수 있습니다.하나의 다목적 장치에서 질병 모델을 생성하고 순차적 단계를 추적할 수 있습니다. 이 기술은 질병의 진단 및 예후를 위해 바이오마커를 검사할 때 더 높은 정확도를 제공합니다. 이 방법은 오가노이드, 스페로이드, 개별 세포 또는 살아있는 유기체를 포함한 모든 3D 성장 시스템에 적용할 수 있습니다.오가노이드 또는 스페로이드 배양을 시작하려면 적절하게 해동된 하이드로겔을 층류 후드 내부의 얼음 위에 15분 동안 두십시오. 또한 간세포 암종 또는 HEPG2 세포의 펠릿이 들어있는 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 예열된 다목적 장치의 틈새 내에 30 내지 35 마이크로리터의 100% 하이드로겔을 플레이트하여 겔 드롭을 만들고, 하이드로겔 드롭의 상단 중앙에 10, 000개의 HEPG2 세포를 놓고, 섭씨 37도에서 15분 동안 셋업한다.배양 후 하이드로겔 드롭을 200마이크로리터의 Dulbecco의 변형 독수리 배지 또는 DMEM(10% 태아 소 혈청 또는 FBS)으로 덮습니다. 인큐베이터에 넣기 전에 가스 흐름을 허용하여 장치의 뚜껑을 올바르게 놓습니다. 격일로 세포에 10% FBS를 함유한 200마이크로리터의 DMEM을 공급한다.도립 현미경으로 스페로이드의 성장을 확인하십시오. 오가노이드의 면역형광 라벨링을 시작하기 전에 필요한 배지와 용액을 섭씨 37도까지 예열합니다. 하이드로겔 방울 주변의 세포 배양액을 흡인하여 섭씨 37도로 예열한 4% 파라포름알데히드 200마이크로리터를 추가하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 15-30분 동안 넣어 고정합니다.이어서, 고정액을 흡인하고, 면역형광 표지 또는 SIF를 위해 용액을 세척하고, 섭씨 37도까지 예열하여 각각 10분 동안 3회 가온한다. 다음 단계를 진행하기 전에 틈새 주변 영역에 증류수를 추가하여 습도를 제공하십시오. 하이드로겔 방울을 둘러싸고 있는 SIF를 흡인하고, SIF에 예열된 1차 항체 용액 100마이크로리터를 하이드로겔에 첨가한 후 섭씨 37도에서 30 내지 60분 동안 배양한다.이어서, 1차 항체 용액을 흡인하고, 섭씨 37도로 예열된 SIF로 각각 10분 동안 3회 세척한다. 세척 후, 남은 SIF를 흡인하고, SIF에 예열된 100 마이크로리터의 2차 항체 용액을 하이드로겔에 첨가한다. 하이드로겔을 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30 내지 60분 동안 배양한다.배양 후, 2차 항체 용액을 흡인하고 PBS로 떨어뜨린 하이드로겔을 섭씨 37도에서 각각 10분 동안 암실에서 3회 세척한다. 다음으로, 잔류 PBS를 흡인하고, 하이드로겔을 장착 배지 또는 글리세롤을 함유하는 100 마이크로리터의 핵 DNA 염색과 함께 어둠 속에서 섭씨 37도에서 배양한다. 하이드로 겔이 들어있는 다목적 장치를 단단히 닫기 전에 건조를 피하기 위해 틈새를 글리세롤로 채우십시오.컨포칼 현미경으로 오가노이드를 검사하려면 원고에 제공된 지침에 따라 현미경 매개변수를 설정하십시오. 오가노이드를 동결하려면 세포 배양 배지를 흡인하고 예열된 동결 용액 200마이크로리터를 추가하고 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 폼 상자 안에 넣기 전에 장치의 뚜껑을 단단히 닫으십시오.이 폼 상자를 다른 폼 상자에 넣고 두 폼 상자를 단단히 닫습니다. 상자를 영하 20도에서 2시간 동안 보관한 다음 영하 80도의 냉동고에 밤새 두십시오. 오가노이드를 6개월 이상 보관하려면 상자에서 오가노이드가 포함된 다목적 장치를 꺼내 액체 질소 탱크로 옮깁니다.오가노이드를 해동하려면 냉동고 또는 액체 질소 탱크에서 샘플이 들어 있는 다목적 장치를 꺼내 섭씨 37도의 인큐베이터에 직접 넣으십시오. 해동되면 배지와 동결 용액 혼합물을 부드럽게 흡인하여 새로운 배지를 추가하고 전체 마운트 오가노이드 하이드로겔을 이미지화합니다. 라이브 이미징에서 하이드로겔 내부의 성장하는 유기체는 세포 펠릿을 삽입한 후 3-5일 후, 특히 하이드로겔 돔 주변에서 볼 수 있었습니다.도립 위상차 현미경에서 스페로이드를 포함하는 하이드로겔의 다양한 수준에서 시계열 이미지가 여기에 표시됩니다. 세포막과 핵을 생염색한 후 전체 마운트 리빙 오가노이드의 공초점 현미경 이미지는 주변과 중앙에서 유사한 표지 밀도를 보여주었습니다. 또한, 전체 장착 스테로이드의 면역 형광 표지는 1 개의 항체, 2 개의 항체 및 3 개의 항체로 성공적으로 수행 될 수 있으므로 추가 치료 단계가 필요하지 않습니다.대표적인 분석은 장치에서 두 개의 면역형광 표지된 기도 유기체를 보여줍니다. 다목적 장치에 있는 전체 스페로이드의 SEM 이미지와 절편된 스테로이드의 10개 이미지는 스페로이드, 세포질 소기관 및 기타 초구조적 세포 특징의 잘 보존된 3D 아키텍처를 나타내어 설명된 프로토콜의 효과를 보여줍니다. 하이드로겔 돔의 경계에서의 불규칙성은 샘플을 동결시킨 후에 명백하였다.그러나 스페로이드의 크기와 진원도는 비슷하게 유지되었습니다. 동결된 시료를 해동한 후 배양 표면상의 세포 이동을 관찰하였다. 이 기술은 매우 간단합니다.그러나 연구원은 샘플 손상을 방지하기 위해 하이드로겔 방울 주변의 액체를 흡입하거나 추가하는 동안 매우 부드러워야 합니다. 연구원은 첨단 현미경을 사용하여 단일 장치에서 동일한 샘플을보고 상관 연구를 수행 할 수 있습니다.

배양, 냉동, 처리 및 전체 오가노이드 및 스페로이드의 이미징 상태를 하이드로겔에 있는 동안

Abstract