Enkeltcelleanalyse av ekspresjonen av Pseudomonas syringae-gener i plantevevet

En mengde patogene mikroorganismer angriper stadig planter. Artskomplekset Pseudomonas syringae omfatter gramnegative plantepatogene bakterier av spesiell relevans for et stort antall verter. P. syringae kommer inn i planten fra bladoverflaten og multipliserer raskt i apoplasten, og danner mikrokolonier som opptar det intercellulære rommet. Det konstitutive uttrykket av fluorescerende proteiner av bakteriene muliggjør visualisering av mikrokoloniene og overvåking av utviklingen av infeksjonen på mikroskopisk nivå. Nylige fremskritt innen enkeltcelleanalyse har avslørt den store kompleksiteten som nås av klonale isogene bakteriepopulasjoner. Denne kompleksiteten, referert til som fenotypisk heterogenitet, er konsekvensen av celle-til-celle-forskjeller i genuttrykk (ikke knyttet til genetiske forskjeller) blant bakteriesamfunnet. For å analysere uttrykket av individuelle loci på enkeltcellenivå, har transkripsjonsfusjoner til fluorescerende proteiner blitt mye brukt. Under stressforhold, som de som oppstår under kolonisering av planteapoplasten, skiller P. syringae seg ut i forskjellige subpopulasjoner basert på det heterogene uttrykket av viktige virulensgener (dvs. Hrp type III sekresjonssystem). Imidlertid er enkeltcelleanalyse av en gitt P. syringae-populasjon gjenvunnet fra plantevev utfordrende på grunn av det cellulære rusket som frigjøres under den mekaniske forstyrrelsen som er iboende for inokulasjons- og bakterieekstraksjonsprosessene. Denne rapporten beskriver en metode utviklet for å overvåke ekspresjonen av P. syringae-gener av interesse på enkeltcellenivå under koloniseringen av Arabidopsis og bønneplanter. Fremstillingen av plantene og bakterielle suspensjoner som brukes til inokulering ved hjelp av et vakuumkammer er beskrevet. Utvinningen av endofytiske bakterier fra infiserte blader ved apoplastisk væskeekstraksjon er også forklart her. Både bakteriell inokulasjon og bakteriell ekstraksjonsmetoder er empirisk optimalisert for å minimere plante- og bakteriell celleskade, noe som resulterer i bakterielle preparater som er optimale for mikroskopi og flowcytometrianalyse.