עבודה זו נתמכה על ידי יוזמת InnoHK וממשלת האזור המנהלי המיוחד של הונג קונג; מרכז המחקר לראייה חדה; ומרכז המחקר לחדשנות ברפואה סינית (RCMI) באוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג.

הנבדקים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני השתתפותם במחקר. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה האנושית של האוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג ודבק בעקרונות הצהרת הלסינקי.
1. איסוף נוזל דמעות אנושי עם רצועת שירמר
<ol><li>יש ללבוש כפפות ולחטא כדי למנוע זיהום דגימה.</li>
	<li>בדקו שהאריזה הפנימית שלמה, סטרילית ולא פג תוקפה.</li>
	<li>כופפו מעט את החלק העליון של רצועת שירמר פנימה בסימן 0 מ"מ, כפי שמצוין ליד קצה חצי העיגול של הרצועה (איור 1).</li>
	<li>הסר את הרצועה מהחבילה הפנימית על ידי החזקת קצה הרצועה, והימנע ממגע ישיר עם אזור איסוף הדגימה מ- 0 עד 25 מ"מ.</li>
	<li>בקש מהנבדק להסיט את מבטו ממיקום הרצועה שיש למקם.</li>
	<li>משכו מטה את העפעף התחתון בעדינות וחברו את קצה הרצועה בפורניקס התחתון ליד אזור הקנטוס הצידי (איור 2). חזור על אותו הליך בעין השנייה.</li>
	<li>בקשו מהנבדק לסגור בעדינות את העפעפיים כדי למזער גירוי.</li>
	<li>יש לאסוף נוזל דמעות למשך כ-5 דקות או רצוי דגימת דמעות בקוטר 15-20 מ"מ.</li>
	<li>בקשו מהנבדק לפקוח את שתי העיניים, משכו מטה את העפעף התחתון בעדינות והסירו את הרצועות מהנושא.</li>
	<li>בדוק את אורך הלחות ברצועת שירמר ורשום את הכמות שנאספה במ"מ.</li>
	<li>יבשו את הרצועה עם מחמם מסגרת אחיד ונקי עד שהנוזל יבש לחלוטין. הערה: יש להימנע מחימום עודף שעלול לחרוך את נייר הפילטר.</li>
	<li>הכניסו כל רצועת שירמר מיובשת לצינור קריו-צינור מסומן ואחסנו אותה במקום קריר ויבש בחושך עד לעיבוד נוסף.</li>
</ol>2. הכנת כימיקלים וריאגנטים
<ol><li>חיץ ליזיס (5% SDS, 50 mM TEAB, pH 7.5), 20 מ"ל<ol><li>פיפטה 1 מ"ל של 1 M TEAB ו 80 μL של 12% חומצה זרחתית. מערבלים וסוניק לזמן קצר כדי להסיר בועות. למעלה עד 20 מ"ל עם מים deionized.</li>
		<li>שוקלים 1 גרם SDS ומוסיפים לתמיסה עם תנודה עד להמסה.</li>
	</ol></li>
	<li>מאגר משקעים חלבוני (90% מתנול, 100 mM TEAB, pH 7.1), 10 מ"ל<ol><li>הוסף 893 μL של 1 M TEAB ו 92 μL של מים deionized.</li>
		<li>הוסף 15 μL של 85 wt. % חומצה זרחתית ו 9 מ"ל של מתנול לתמיסה מערבולת לזמן קצר.</li>
	</ol></li>
	<li>חיץ עיכול (50 מ"מ TEAB), 1 מ"ל<ol><li>הוסף 50 μL של 1 M TEAB וממלא עד 1 מ"ל עם מים נטולי יונים.</li>
	</ol></li>
	<li>200 mM dithiothreitol (DTT) פתרון, 500 μL<ol><li>שוקלים 15 מ"ג של DTT ומתמוססים ב 500 μL של מים deionized; מערבולת בקצרה. הערה: יש להכין לפני השימוש.</li>
	</ol></li>
	<li>תמיסת יודואצטמיד (IAA) 400 mM, 200 מיקרוליטר<ol><li>שוקלים 15 מ"ג של IAA ומתמוססים ב 200 מיקרוליטר של מים נטולי יונים; מערבולת בקצרה. הערה: יש להכין לפני השימוש ולהימנע מאור.</li>
	</ol></li>
	<li>0.2% חומצה פורמית, 50% אצטוניטריל, 10 מ"ל<ol><li>להכין 10 מ"ל של 50% acetonitrile במים deionized.</li>
		<li>מוסיפים 20 μL של חומצה פורמית ומערבולת לזמן קצר.</li>
	</ol></li>
	<li>0.2% תמיסת חומצה פורמית, 10 מ"ל<ol><li>הוסף 20 μL של חומצה פורמית ל 10 מ"ל של מים deionized מערבולת לזמן קצר.</li>
	</ol></li>
	<li>0.1% תמיסת חומצה פורמית, 10 מ"ל<ol><li>הוסף 10 μL של חומצה פורמית ל 10 מ"ל של מים deionized; מערבולת בקצרה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. מיצוי חלבון ברצועת שירמר
<ol><li>גזור והשלך את הקצה הקדמי מעבר לסימן 0 מ"מ של הרצועה כדי להסיר זיהום פוטנציאלי עקב מגע של רקמות הלחמית עם מספריים נקיים מנירוסטה.</li>
	<li>חתכו את הרצועה במרווחים של 1 מ"מ לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל (איור 3).</li>
	<li>הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס לצינור המיקרוצנטריפוגה, ומערבלים ב-1,000 סל"ד, טמפרטורת החדר למשך שעה בתרמומיקסר.</li>
	<li>צנטריפוגה לזמן קצר ולהעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ"ל.</li>
	<li>מעבירים את הרצועות לקצוות פיפטה של 200 μL בעזרת מלקחיים נקיים. הכניסו את הקצוות לאותו צינור משלב 3.4 עם מחזיק וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-4,000 × גרם למשך דקה אחת נוספת להתאוששות מרבית של הדגימה הנותרת ברצועה.</li>
	<li>יש למדוד את ריכוז החלבון באמצעות חומצה ביכומונית (BCA) או בדיקת חלבון תואם.</li>
</ol>4. הכנת דגימת לכידת מתלים
<ol><li>נרמל דגימות ל 50 מיקרוגרם של חלבון בהתבסס על תוצאת בדיקת החלבון.</li>
	<li>הוסף DTT של 200 mM ביחס של 1:10 (v/v, DTT: sample) לריכוז סופי של 20 mM DTT ודגור ב- 95 ° C למשך 10 דקות.</li>
	<li>מצננים את תמיסת החלבון לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הוסף 400 mM IAA ביחס של 1:10 (v/v, IAA: מדגם) לריכוז סופי של 40 mM IAA ודגור בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.</li>
	<li>הוסף 12% חומצה זרחתית מימית ביחס של 1:10 (v/v, חומצה: דגימה) לריכוז סופי של 1.2% חומצה זרחתית ומערבולת לזמן קצר.</li>
	<li>הוסף חיץ קשירת חלבון ביחס של 1:6 (v/v, מדגם: חוצץ) ומערבולות לזמן קצר. הערה: בשלב זה יש ליצור חלקיקי חלבון קולואידיים, והתמיסה תיראה שקופה אם כמות החלבון מספקת.</li>
	<li>פתח את מכסה עמוד המיקרו ספין של לכידת המתלים והרכיב את עמוד הספין על צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל כדי לאסוף זרימה.</li>
	<li>הוסף עד 200 μL של תערובת חלבון ליזט חומצי לתוך העמודה.</li>
	<li>צנטריפוגה את העמוד ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות. חלקיקי חלבון נלכדו; חזור על הפעולה עד לטעינת הדגימות לעמודה.</li>
	<li>הוסף 150 μL של חיץ קשירת חלבון וצנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות כדי לשטוף את החלבון מרחף. חזור על הפעולה 3x.</li>
	<li>הרכיבו את עמוד המיקרו לכידת המתלים על צינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 20 μL של 50mM מאגר עיכול TEAB המכיל פרוטאז ביחס של 1:25 (w/w, טריפסין: חלבון) למסנן בתוך עמוד הסחרור, ובכך הימנע מבועות ומרווח אוויר בין המסנן לתמיסת העיכול.</li>
	<li>כבשו את עמוד המיקרו-ספין של לכידת המתלים כדי למנוע אידוי. לדגור ב 47 ° C במשך 1 שעה ב thermomixer; אין לרעוד או לערבל במהלך העיכול.</li>
	<li>פפטידים Elute עם 40 μL של 50 mM TEAB על ידי כוח צנטריפוגלי ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות.</li>
	<li>הוסף 40 μL של 0.2% FA וצנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות.</li>
	<li>הוסף 35 μL של 0.2% FA, 50% acetonitrile, וצנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות.</li>
	<li>בריכה שלוש פולטת ומיובשת עם צנטריפוגת ואקום.</li>
	<li>יש לאחסן במקפיא בטמפרטורה אולטרה-נמוכה של -80°C עד לניתוח נוסף. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>5. שחזור פפטידים לניתוח ספקטרומטריית מסות
<ol><li>הרכיבו מחדש את הדגימה עם 12 μL של 0.1% FA, מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר.</li>
	<li>מדוד ריכוז פפטיד באמצעות ערכת בדיקת פפטידים.</li>
	<li>נרמל את ריכוז הפפטיד ל-0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר ב-0.1% FA.</li>
	<li>מעבירים את תערובת הפפטיד לבקבוקון אוטודוגר ומוכנים לניתוח ספקטרומטריית מסות.</li>
</ol>6. רכישת דגימה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם
<ol><li>טען 3 מיקרוגרם של הפפטיד עם מאגר העמסה איזוקרטית (0.1% FA, 5% ACN) לעמוד מלכודת (C18, 5 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 20 מ"מ) בקצב זרימה של 2 מיקרוליטר/דקה למשך 15 דקות.</li>
	<li>שבר את הפפטידים באמצעות טור ננו-אנליטי הפוך (C18, 5 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 300 מ"מ) בקצב זרימה של 350 nL/min בשיפוע הפרדה של 155 דקות. השתמש בפאזה A ניידת הכוללת תערובת של 0.1% חומצה פורמית (v/v), 5% ACN (v/v) במים ושלב B נייד המכיל 0.1% FA (v/v), 98% ACN (v/v) במים. השתמש במעבר הצבע הבא: 0-0.5 דקות: 5% B, 0.5-90 דקות: 10% B, 90-120 דקות: 20% B, 120-130 דקות: 28% B, 130-135 דקות: 45% B, 135-141 דקות: 80% B, 141-155 דקות: 5% B.</li>
	<li>בצע רכישה תלוית נתונים (DDA) עם טווח סריקת TOF-MS בין 350 ל- 1800 m/z עם זמן הצטברות של 250 ms וזמן אי-הכללת יעד דינמי של 18 שניות. לאחר מכן, בצע סריקת MS/MS במהירות של 100 עד 1,800 m/z במצב רגישות גבוהה עם זמן הצטברות של 50 ms עבור 50 המבשרים המובילים בכל מחזור עם סף של 125 cps עבור אות MS/MS עם מצב טעינה מ- +2 עד +4.</li>
	<li>נתח נתונים גולמיים באמצעות התוכנה שבוצעה אליה הפניה או מנועים תואמים אחרים עם מסד נתונים סימוכין ב- FASTA ממסד הנתונים UniProt הנגיש לציבור.</li>
</ol>

Non-Invasive Biomarker Discovery for Tear Proteomics Using LC-MS

<ol>
	<li>Ma, J. Y. W., Sze, Y. H., Bian, J. F., Lam, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+mass+spectrometry+proteomics+in+tear+biomarker+discovery+for+multifactorial+ocular+diseases+(Review).">Critical role of mass spectrometry proteomics in tear biomarker discovery for multifactorial ocular diseases (Review).</a> International Journal of Molecular Medicine. 47 (5), 83 (2021).</li><li>Tse, J. S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+clinical+data+and+tear+proteomics+to+assess+efficacy,+ocular+surface+status,+and+biomarker+response+after+orthokeratology+lens+wear.">Integrating clinical data and tear proteomics to assess efficacy, ocular surface status, and biomarker response after orthokeratology lens wear.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 10 (11), 18 (2021).</li><li>Cheung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tear+proteome+dataset+in+response+to+daily+wear+of+water+gradient+contact+lens+using+SWATH-MS+approach.">Human tear proteome dataset in response to daily wear of water gradient contact lens using SWATH-MS approach.</a> Data in Brief. 36, 107120 (2021).</li><li>Tse, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+on+assessment+of+safety+and+tear+proteome+change+in+response+to+orthokeratology+lens+-+Insight+from+integrating+clinical+data+and+next+generation+proteomics.">Data on assessment of safety and tear proteome change in response to orthokeratology lens - Insight from integrating clinical data and next generation proteomics.</a> Data in Brief. 29, 105186 (2020).</li><li>Zhan, X., Li, J., Guo, Y., Golubnitschaja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+analysis+of+human+tear+fluid+biomarkers+specific+for+ocular+and+systemic+diseases+in+the+context+of+3P+medicine.">Mass spectrometry analysis of human tear fluid biomarkers specific for ocular and systemic diseases in the context of 3P medicine.</a> The EPMA Journal. 12 (4), 449-475 (2021).</li><li>Ponzini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+tear+proteomics+for+noninvasive+biomarker+discovery.">Mass spectrometry-based tear proteomics for noninvasive biomarker discovery.</a> Mass Spectrometry Reviews. 41 (5), 842-860 (2022).</li><li>HaileMariam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S-Trap,+an+ultrafast+sample-preparation+approach+for+shotgun+proteomics.">S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).</li><li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urine+proteomics:+evaluation+of+different+sample+preparation+workflows+for+quantitative,+reproducible,+and+improved+depth+of+analysis.">Urine proteomics: evaluation of different sample preparation workflows for quantitative, reproducible, and improved depth of analysis.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).</li><li>Ludwig, K. R., Schroll, M. M., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+in-solution,+FASP,+and+S-Trap+based+digestion+methods+for+bottom-up+proteomic+studies.">Comparison of in-solution, FASP, and S-Trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2480-2490 (2018).</li><li>Sze, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pH+reversed-phase+fractionated+neural+retina+proteome+of+normal+growing+C57BL/6+mouse.">High-pH reversed-phase fractionated neural retina proteome of normal growing C57BL/6 mouse.</a> Scientific Data. 8 (1), 27 (2021).</li><li>Marchione, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HYPERsol:+High-quality+data+from+archival+FFPE+tissue+for+clinical+proteomics.">HYPERsol: High-quality data from archival FFPE tissue for clinical proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 19 (2), 973-983 (2020).</li><li>Chhuon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+S-Trap-based+approach+to+the+analysis+of+T+cell+lipid+raft+proteome.">A sensitive S-Trap-based approach to the analysis of T cell lipid raft proteome.</a> Journal of Lipid Research. 61 (11), 1512-1523 (2020).</li><li>Hayoun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+fast+proteotyping+of+microorganisms+by+tandem+mass+spectrometry.">Evaluation of sample preparation methods for fast proteotyping of microorganisms by tandem mass spectrometry.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1985 (2019).</li><li>Templeton, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SPEED,+S-Trap,+and+in-solution-based+sample+preparation+methods+for+mass+spectrometry+in+kidney+tissue+and+plasma.">Comparison of SPEED, S-Trap, and in-solution-based sample preparation methods for mass spectrometry in kidney tissue and plasma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6290 (2023).</li><li>Ding, Z., Wang, N., Ji, N., Chen, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+technologies+for+cancer+liquid+biopsies.">Proteomics technologies for cancer liquid biopsies.</a> Molecular Cancer. 21 (1), 53 (2022).</li><li>N&#228;ttinen, J., Aapola, U., Jylh&#228;, A., Vaajanen, A., Uusitalo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+capillary+and+Schirmer+strip+tear+fluid+sampling+methods+using+SWATH-MS+proteomics+approach.">Comparison of capillary and Schirmer strip tear fluid sampling methods using SWATH-MS proteomics approach.</a> Translational Vision Science &amp; Technology. 9 (3), 16 (2020).</li><li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid:+from+sampling+to+preanalytical+processing.">Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing.</a> Scientific Reports. 11 (1), 10064 (2021).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

כדי להשיג תוצאות מדויקות בשיטה זו, יש ללבוש כפפות חד פעמיות ללא חשמל בכל ההליכים מאיסוף דגימת הדמעות כדי למנוע זיהום דגימה. חשוב להימנע מבועות ומרווחי אוויר בין המסנן לתמיסת הדגימה בכל שלב על ידי שימוש בעמודים מסתובבים זעירים. אם נפח הדגימה גדול מקיבולת העמודות, מומלץ לחזור על התהליך. פרוטוקול זה הוכח כיעיל יותר מהפרוטוקול המסורתי בתמיסה במונחים של זמן הכנה, התאוששות חלבון וזיהוי חלבון כולל. הסיבה העיקרית לכך היא שהדגימות עוברות את רוב הפרוצדורות הנדרשות על אותה עמודה, בניגוד לשיטת התמיסה הכוללת שלבי העברה מרובים כגון משקעים אצטון, עיכול וניקוי (התפלה), מה שמגדיל את הסבירות לשינויים בנתונים המתקבלים.
בנוסף לדגימות הדמעות שנאספו בשיטת מיקרו-נימים16,17, תהליך עבודה זה של FASP עם מיקרו-עמוד לכידת מתלים מספק שיטת הכנת דגימות חלופית המאפשרת הכנת דגימת דמעות מהירה וחזקה שנאספה באמצעות רצועות Schirmer, עם הכנת חומר מינימלית וצעדים ידידותיים למשתמש לביצוע. זה מאפשר הכנת דגימת דמעות הניתנת לשחזור עבור מחקרי עוקבה גדולים על פני מחלות עיניים מרובות או מצבים עם התאוששות פפטיד משופרת וזיהוי חלבון על ידי טרשת נפוצה על פני הליכים בתמיסה. תהליך אמין זה יכול לשמש באופן קבוע להכנת דגימות סמנים ביולוגיים של דמעות למחקר ולמטרות קליניות אחרות. והכי חשוב, זה דורש הכשרה מינימלית של הצוות לאיסוף באתר ושולל את הצורך באחסון דגימות במקפיא. הדגימות מיובשות במקום כדי למזער אוטוליזה של חלבון והתפרקותו. לפיכך, זה מאפשר משלוח נוח בדואר כדי להקל על ניתוח במורד הזרם, בניגוד לשימוש בצינורות מיקרו-נימיים.

פרוטאומיקה של דמעות קיבלה תשומת לב לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים למחלות עיניים ומצבים 1,2,3,4,5,6, כדי לגשת לפתוגנזה של המצב העיני והמערכתי, כמו גם לנצל את היתרון של איסוף דגימות דמעות לא פולשניות באמצעות רצועות שירמר. ההתקדמות הטכנולוגית של ספקטרומטריית המסות של הדור הבא אפשרה לכמת חלבונים בדמעות בקנה מידה מיקרוליטרי בדיוק ובדיוק שלא היו אפשריים בעבר. שיטות הכנה לדוגמה עדיין אינן סטנדרטיות. תהליך עבודה חזק וסטנדרטי להכנת דגימות חיוני להצלחת היישום הקליני במחקר סמנים ביולוגיים של חלבון דמעות. תהליך הכנת הדגימה של לכידת המתלים (S-Trap) דווח לאחרונה כשיטת הכנת דגימה יעילה ורגישה לניתוח פרוטאומי רחב במורד הזרם 7,8. עם זאת, אסטרטגיה זו לא דווחה היטב בניתוח של פרוטאום דמעות אנושי, ביצועים טובים יותר מהכנת דגימות בעזרת מסנן (FASP) ועיכול בתמיסה במונחים של יעילות עיכול אנזימטית והמספר הגדול יותר של זיהוי חלבונים על ידי ניתוח ספקטרומטרי מסה9. הגישה מבוססת מלכודת ה-S הודגמה בהכנת רקמת רשתית 10, רקמה קבועה פורמלין, משובצת פרפין (FFPE) 11, תאים 12, מיקרואורגניזם 13 וביופסיות נוזליות14,15.
פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה כמותית משולבת מדגימות קליניות לחלבון מעוכל אנזימטי לגילוי פאנל סמנים ביולוגיים של חלבון דמעות לא פולשני עם אסטרטגיה טכנית מהירה, ניתנת לשחזור וחזקה. בקצרה, נוזל הדמעות נאסף באמצעות רצועת שירמר סטנדרטית ומיד יובש עם מחמם מסגרת עיניים כדי למנוע אוטוליזה של חלבון בטמפרטורת החדר. סך החלבונים המשובצים חולצו באמצעות חיץ ליזיס של 5% נתרן דודציל סולפט (SDS) על פי הצעת היצרן, ולאחר מכן מדידת בדיקת חלבונים. לאחר מכן עבר הליזט המופק הפחתה סטנדרטית עם dithiothreitol (DTT) ואלקילציה עם iodoacetamide (IAA).
לאחר החמצה עם חומצה זרחתית, חיץ משקעים של חלבון עמוד לוכד תרחיף המכיל 90% מתנול ו-100 מילימטר טריאתילמוניום ביקרבונט (TEAB) נוסף לחלבונים מצטברים. לאחר מכן הועברה הדגימה לעמודת מיקרו חדשה ללכידת מתלים. עיכול אנזימטי עם טריפסין בדרגת ריצוף ביחס של 1:25 (w/w, טריפסין: חלבון) ב-47°C למשך שעה אחת. הפפטידים שהתקבלו סולקו באמצעות צנטריפוגה, ברצף עם 50 מילימטר TEAB, 0.2% חומצה פורמית מימית (FA) ו-50% אצטוניטריל (ACN) שהכילו 0.2% FA. הפפטידים המדוללים יובשו בוואקום והורכבו מחדש ב-0.1% FA. ריכוז הפפטיד נמדד והותאם ל-0.5 מק"ג/מיקרוליטר לצורך אנליזה ספקטרומטרית של מסות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>9 mm Plastic Screw Thread Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C4000-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile, LCMS Grade</td>
			<td>Anaqua</td>
			<td>AC-1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge MiniSpin plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-dithiothreitol (DTT), BioUltra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid, ACS reagent, &#8805;96%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frame Heater OPTIMONSUN Electronic</td>
			<td>Breitfeld &#38; Schliekert GmbH</td>
			<td>1203166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide (IAA), BioUltra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, HPLC Grade</td>
			<td>Anaqua</td>
			<td>MA-1292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes, 2 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>368632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid, 85 wt.% in H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>345245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A53225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>TripleTOF 6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schirmer Ophthalmic Strips</td>
			<td>Entod Research Cell UK Ltd</td>
			<td>I-DEW Tearstrips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-Trap Micro Column</td>
			<td>Protifi</td>
			<td>C02-micro-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSTART 9 mm Screw Caps</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CHSC9-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylammonium bicarbonate (TEAB), 1 M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-performance Liquid Chromatography</td>
			<td>Eksigent</td>
			<td>NanoLC 400&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15525017</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protein suspension-trapping sample preparation for tear proteomics by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

נוזל דמעות הוא אחד הנוזלים הביולוגיים הנגישים בקלות שניתן לאסוף באופן לא פולשני. לפרוטאומיקה של דמעות יש פוטנציאל לגלות סמנים ביולוגיים למספר מחלות ומצבים עיניים. עמודת לכידת המתלים דווחה כזרימת עבודה יעילה וידידותית להכנת דגימות ליישום רחב של אנליזה פרוטאומית במורד הזרם. עם זאת, אסטרטגיה זו לא נחקרה היטב בניתוח של פרוטאום דמעות אנושי. הפרוטוקול הנוכחי מתאר זרימת עבודה משולבת מדגימות דמעות אנושיות קליניות לפפטידים מטוהרים למחקר סמנים ביולוגיים לא פולשניים של חלבון דמעות באמצעות ספקטרומטריית מסות, המספקת תובנות לגבי סמנים ביולוגיים של מחלות וניטור בשילוב עם ניתוח ביואינפורמטיקה. הכנת דגימת לכידת תרחיף חלבונים יושמה והדגימה את גילוי פרוטאום הדמעות בהליכים מהירים, ניתנים לשחזור וידידותיים למשתמש, כהכנת דגימה אוניברסלית ואופטימלית לניתוח נוזל דמעות אנושי. בפרט, הליך לכידת התרחיף השיג ביצועים טובים יותר מהכנת הדגימה בתמיסה במונחים של התאוששות פפטידים, זיהוי חלבונים וזמן הכנת דגימה קצר יותר.

Tear proteomics has received attention to explore potential biomarkers for ocular diseases and conditions1,2,3,4,5,6, to access the pathogenesis of the ocular and systemic condition, as well as to exploit the advantage of non-invasive tear sample collection using Schirmer strips. The technological advancement of next-generation mass spectrometry has enabled protein quantification in microliter-scale tears with accuracy and precision not possible in the past. Sample preparation methods are not yet standardized. A robust and standardized sample preparation workflow is essential for the success of clinical application in tear protein biomarker research. The suspension trapping (S-Trap) sample preparation workflow was recently reported as an effective and sensitive sample preparation method for broad downstream proteomic analysis7,8. Yet, this strategy has not been well-reported in the analysis of human tear proteome, outperformed filter-aided sample preparation (FASP) and in-solution digestion in terms of enzymatic digestion efficiency and the greater number of protein identification by mass spectrometric analysis9. The S-Trap-based approach was demonstrated in the preparation of retinal tissue 10, formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue11, cells12, microorganism13, and liquid biopsies14,15.
This protocol describes an integrated quantitative workflow from clinical samples to enzymatically digested protein for the discovery of a non-invasive tear protein biomarker panel with a rapid, reproducible, and robust technical strategy. Briefly, tear fluid was collected using a standard Schirmer strip and immediately dried with an ophthalmic frame heater to prevent protein autolysis at room temperature. Embedded total proteins were extracted using 5% sodium dodecyl sulfate (SDS) lysis buffer according to the manufacturer&#39;s suggestion, followed by protein assay measurement. The extracted lysate then underwent standard reduction with dithiothreitol (DTT) and alkylation with iodoacetamide (IAA).
After acidification with phosphoric acid, suspension trapping column protein precipitation buffer containing 90% methanol and 100 mM triethylammonium bicarbonate (TEAB) was added to aggregate proteins. The sample was then transferred into a new suspension trapping micro column. Enzymatic digestion with done with sequencing grade trypsin at a 1:25 ratio (w/w, trypsin: protein) at 47 &#176;C for 1 h. The resulting peptides were then eluted via centrifugation, sequentially with 50 mM TEAB, 0.2% aqueous formic acid (FA), and 50% acetonitrile (ACN) containing 0.2% FA. The eluted peptides were vacuum-dried and reconstituted in 0.1 % FA. The peptide concentration was measured and adjusted to 0.5 &#181;g/&#181;L for mass spectrometric analysis.

Author Spotlight: Advancing Tear Fluid Analysis Using a Standardized Protocol for Proteomics Research 

הכנת דגימה ללכידת תרחיף חלבונים עבור פרוטאומיקה של דמעות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם

פרוטוקול זה מאפשר איסוף דגימות דמעות עם רצועות Schirmer המאוחסנות יבשות בטמפרטורת החדר לפני הכנת הדגימה הבאה לניתוח ספקטרומטריית מסות. זרימת עבודה של הכנת דגימות בעזרת מסנן (FASP) עם מיקרו-עמודה עם לכידת מתלים אפשרה הכנת דגימה מהירה תוך שעות, בהשוואה לנוהלי עיכול נפוצים המקובלים בתמיסה בימים הדורשים דגירה בלילה. תפוקת ההתאוששות של הפפטיד הייתה גבוהה משמעותית (p < 0.001) מאשר פרוטוקול העיכול הסטנדרטי בתמיסה ועם יכולת שחזור טובה במקדם שונות (%CV) < 7%. שלולית של דגימות דמעות חזרה על עצמה בשישה עותקים טכניים עם 74.2 ± 5.0% התאוששות פפטיד ו-52.8 ± שחזור פפטיד של 1.6% בדגימות שהוכנו עם הליכים בתמיסה. דגימת דמעות מאוגמת עם כמות חלבון של 36.3 מיקרוגרם הוקפצה לרצועת שירמר וחולצה כפי שתואר קודם לכן, יעילות המיצוי של חלבון הייתה 81% (29.5 ± 6.8 מיקרוגרם, ממוצע ± SD).
שני תהליכי העבודה העמיסו 3 מיקרוגרם של פפטידים על הטרשת הנפוצה, וחיפוש ה-DDA הניב סך של 1,183 ±-118 חלבונים (5,757 ±-537 פפטידים שונים) ו-874 ±-70 חלבונים (4,400 ±-328 פפטידים) ב-1% FDR בקבוצת לכידת התרחיף ובקבוצת התמיסה, בהתאמה. ניתוח של אונטולוגיה גנטית (GO) באמצעות מערכת סיווג PANTHER גילה פרוטאומים דומים מאוד עבור שתי הגישות, כאשר קשירה, פעילות קטליטית וויסות תפקוד מולקולרי הם הפונקציות המולקולריות העיקריות שלהם (איור 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig01.jpg"> איור 1: כופפו את החלק העליון של רצועת Schirmer בסימן 0 מ"מ לפני היישום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig02.jpg"> איור 2: מיקום רצועת שירמר במהלך איסוף הדמעות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig03.jpg"> איור 3: איור של טיפול ברצועת Schirmer לפני מיצוי חלבונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64617/64617fig04.jpg"> איור 4: תרשים עוגה שמדגים את ניתוח האונטולוגיה הגנטית עבור הפרוטאומים שזוהו באמצעות זרימת העבודה בתוך הפתרון וזרימת העבודה של לכידת מתלים, באמצעות מערכת הסיווג PANTHER. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64617/64617fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Tear Fluid Analysis Using a Standardized Protocol for Proteomics Research at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאיסוף דגימות דמעות באמצעות רצועות Schirmer ותהליך עבודה כמותי משולב לגילוי סמנים ביולוגיים לא פולשניים של חלבון דמעות. תהליך העבודה של הכנת דגימת לכידת מתלים מאפשר הכנת דגימת דמעות מהירה וחזקה וניתוח ספקטרומטרי מסה, וכתוצאה מכך תפוקות שחזור פפטידים וזיהוי חלבונים גבוהים יותר מאשר הליכים סטנדרטיים בתמיסה.

Tear fluid is one of the easily accessible biofluids that can be collected non-invasively. Tear proteomics has the potential to discover biomarkers for ...

מטרת המחקר שלנו היא להדגים את השימוש בהכנת דגימת לכידת תרחיף חלבון, המכונה מלכודת S למחקר מבוסס ספקטרומטריית מסות. פרוטוקול זה משתמש בהכנת דגימה מהירה, ניתנת לשחזור ומתוקננת של דגימת נוזל דמעות אנושי שנאספה באמצעות מחקר תרגומי ברפואת עיניים. נוזל דמעות אנושי הוא נוזל גוף שניתן לאסוף לבדיקות מולקולריות לא פולשניות ברפואת עיניים.יש הרבה שיטות סטנדרטיות של איסוף נוזל דמעות והכנת דגימה, שהן קריטיות למחקר קליני מוצלח של מחלות ותנאים. שיטות לא סטנדרטיות קשות להשוואה ולפירוש בין מתודולוגיות ולכן משפיעות על התוצאות הכימיות. פרוטוקול זה מאפשר דגימה ואחסון של נוזלי גוף הדמעות בטמפרטורת החדר.זה עוזר עם איסוף דוגמאות ומשלוח קלים יותר. הוא מספק מיצוי פפטידים מהיר וחזק לניתוח ספקטרומטר מסות, המשפר את התאוששות הפפטידים. פרוטוקול זה כולל שלבי הכנת מדגם מינימליים כדי למזער שגיאות ואי ודאויות.הביצועים המהירים והמעולים של זיהוי וכימות חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסות יקלו על רופאים וחוקרים בפיתוח בדיקות מולקולריות לא פולשניות. אופטימיזציה של הכנת הדגימה תמיד תהיה אחד השלבים הקריטיים. ללא קשר לשיטת האיתור, הערך הקליני של נוזל הדמעות האנושי טרם נחקר במלואו.יש לקוות ששיטת הכנת דוגמת ההצעה תפתח את הדלת ליישום קליני פוטנציאלי בעתיד הקרוב.