Triagem de espermatozoides para o isolamento rápido de edições germinativas em peixes-zebra

O advento de tecnologias nucleases CRISPR-Cas direcionadas revolucionou a capacidade de realizar a edição precisa do genoma em sistemas modelo estabelecidos e emergentes. Os sistemas de edição do genoma CRISPR-Cas usam um RNA guia sintético (sgRNA) para direcionar uma endonuclease associada a CRISPR (Cas) para loci específicos de DNA genômico, onde a endonuclease de Cas gera uma quebra de fita dupla. O reparo de quebras de fita dupla por mecanismos intrínsecos propensos a erros leva a inserções e/ou deleções, interrompendo o locus. Alternativamente, a inclusão de doadores de DNA de fita dupla ou oligonucleotídeos de DNA de fita simples nesse processo pode provocar a inclusão de edições precisas do genoma variando de polimorfismos de nucleotídeo único a pequenas etiquetas imunológicas ou mesmo grandes construções de proteínas fluorescentes. No entanto, um grande gargalo nesse procedimento pode ser encontrar e isolar a edição desejada na linha germinativa. Este protocolo descreve um método robusto para triagem e isolamento de mutações germinativas em loci específicos em Danio rerio (zebrafish); no entanto, esses princípios podem ser adaptáveis em qualquer modelo onde a coleta de espermatozoides in vivo seja possível.