ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

Summary

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

Abstract

אתרי מגע עם ממברנות (MCSs) הם אזורים של קרבה קרובה לממברנה המאפשרים ומווסתים את החילוף הדינמי של ביומולקולות מגוונות (כלומר, סידן ושומנים) בין האברונים הסמוכים זה לזה מבלי לערב איחוי ממברנה. MCSs חיוניים להומאוסטזיס תאי, ותפקודם מובטח על ידי המרכיבים המקומיים, אשר קיימים לעתים קרובות כקומפלקסים חלבונים מולטימריים. MCS מערבת לעתים קרובות את הרשתית האנדופלסמית (ER), אתר עיקרי של סינתזת שומנים ואחסון סידן תאי, והם חשובים במיוחד עבור אברונים, כגון המיטוכונדריה, אשר אינם נכללים במסלולי ההובלה השלפוחית הקלאסיים. בשנים האחרונות, MCS בין חדר המיון למיטוכונדריה נחקרו בהרחבה, שכן תפקודיהם משפיעים מאוד על חילוף החומרים בתאים/ביו-אנרגטיקה. מספר חלבונים החלו להיות מזוהים באתרי מגע אלה, כולל קשירת ממברנה, תעלות סידן וחלבונים להעברת שומנים, מה שמעלה את הצורך במתודולוגיות חדשות ובגישות טכניות לחקר רכיבי MCS אלה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המורכב מגישות טכניות משולבות, הכוללות בדיקת קשירת קרבה (PLA), צביעת מיטוכונדריה וסגמנטציה של הדמיה תלת-ממדית, המאפשרת זיהוי חלבונים הקרובים פיזית (>40 ננומטר) זה לזה ושוכנים על אותו קרום ב-MCS של ER-מיטוכונדריה. לדוגמה, השתמשנו בשני חלבוני העברת שומנים מעוגני ER, ORP5 ו-ORP8, שהוכחו בעבר כמתקשרים ומתמקמים ב-MCS של קרום המיטוכונדריה והפלזמה של ER. על ידי שיוך ORP5-ORP8 PLA עם ניתוח תוכנה להדמיית תאים, ניתן היה להעריך את המרחק של קומפלקס ORP5-ORP8 מפני השטח המיטוכונדריאליים ולקבוע כי כ-50% מהאינטראקציה של ORP5-ORP8 PLA מתרחשת בתת-תחומים של ER בסמיכות למיטוכונדריה.

Introduction

תקשורת בין אברונים היא מאפיין מגדיר של תאים אאוקריוטים. אחת הדרכים שבהן אברונים מתקשרים היא על ידי יצירת אתרי מגע עם ממברנות (MCS), שהם ניגודי קרום קרובים בין שני אברונים הנשמרים על ידי חלבונים מבניים ופונקציונליים, כגון קשירה, חלבוני העברת שומנים ותעלות סידן¹. MCS יכולים להיווצר בין אברונים דומים או שונים, והם מתווכים את חילופי המרכיבים התאיים, אשר חשוב לשמירה על הומאוסטזיס תאי. עד כה זוהו מספר MCS, כולל רטיקולום אנדופלסמי (ER)-מיטוכונדריה, קרום פלזמה ER (PM) ומגעי טיפות ליפידים ER (LD)¹. ביניהם, אלה שנוצרו בין ER לבין המיטוכונדריה (MERCSs) הם בין הנחקרים ביותר כפי שהם מעורבים ברגולציה של כמה פונקציות התאים, כולל שומנים....

Protocol

1. צביעה מיטוכונדריאלית ובדיקת קשירת קרבה (PLA)

1. צלחת 0.5 x 10 5-2 x 10 5 תאי HeLa, מתוחזקים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% חומצות אמינו לא חיוניות ב-37°C עם 5% CO₂, בזכוכית 13 מ"מ מכסה את החלקות בלוחות^1.5 ב-24 בארות בדילול המאפשר מפגש תאים של 75%-90% ביום ההליך.
   הערה: יש לציין כי ניתן לשלוח תאי HeLa לטיפולים נוספים, כגון טיפול siRNA ו / או טרנספקציה פלסמיד DNA, לפני צביעה מיטוכונדריאלית ו- PLA.
2. צביעת מיטוכונדריה
   1. יש לשטוף את התאים פעם אחת בתווך ללא סרום שחומם מראש ב-37°C. יש לדגור על התאים עם מדיום שחומם מראש ללא סרום למשך 10 דקות בטמפרטורה ....

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, זיהינו את אתרי האינטראקציה של שני חלבוני העברת שומנים מעוגני ER, ORP5 ו- ORP8, והערכנו את התרחשותם בתת-תחומים של קרום ER במגע עם אברונים אחרים, בפרט, עם המיטוכונדריה. לשם כך, הרשת המיטוכונדריאלית בתאי HeLa הוכתמה בסמן מיטוכונדריאלי אדום, וכתמים ירוקים ORP5-ORP8 PLA זוהו לאחר .......

Discussion

פרוטוקול זה נועד לזהות ולכמת אינטראקציות PLA בין אברונים של חלבונים בMCSs, במיוחד ב- MERCSs. החידוש של הפרוטוקול הוא שהוא משלב PLA עם תיוג של אברונים מרובים, מיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח תמונה תלת-ממדית כדי למקם ולכמת אינטראקציות PLA בין שני חלבונים השוכנים באותו ממברנה, במקרה זה בתוך קרום המיון בסמיכ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)	Gibco	14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)	VWR	21236.291
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5	Agar Scientific	L46R13-15
CMXRos red MitoTracker	Invitrogen	M7512	red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X	Leica	DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates	Merck	CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma	DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	51985026	serum free medium
Imaris software v 9.3	Bitplane	N/A	cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10	VWR	390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)	Knittel Glass
mouse anti-ORP8	Santa Cruz	134409
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
rabbit anti-ORP5	Sigma	HAP038712
Saponin	Sigma	84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free	Invitrogen	10977-035