Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

Multiplexed imaging-technologie met behulp van antilichaam barcoding met oligonucleotiden, die sequentieel meerdere epitopen in dezelfde weefselsectie detecteert, is een effectieve methodologie voor tumorevaluatie die het begrip van de tumormicro-omgeving verbetert. De visualisatie van eiwitexpressie in formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde weefsels wordt bereikt wanneer een specifieke fluorofoor wordt gegloeid tot een antilichaamgebonden barcode via complementaire oligonucleotiden en vervolgens monsterbeeldvorming wordt uitgevoerd; Inderdaad, deze methode maakt het gebruik van aanpasbare panelen van meer dan 40 antilichamen in een enkele weefselkleuringsreactie mogelijk. Deze methode is compatibel met vers bevroren weefsel, formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed weefsel, gekweekte cellen en perifere bloed mononucleaire cellen, wat betekent dat onderzoekers deze technologie kunnen gebruiken om een verscheidenheid aan monstertypen te bekijken met een eencellige resolutie. Deze methode begint met een handmatig kleurings- en fixatieprotocol en alle barcodes van antilichamen worden aangebracht met behulp van een antilichaamcocktail. Het kleuringsvloeistofinstrument is volledig geautomatiseerd en voert iteratieve cycli uit van etikettering, beeldvorming en het verwijderen van spectraal verschillende fluoroforen totdat alle biomarkers zijn afgebeeld met behulp van een standaard fluorescentiemicroscoop. De beelden worden vervolgens verzameld en gecompileerd over alle beeldvormingscycli om een eencellige resolutie voor alle markers te bereiken. De eenstapskleuring en zachte fluorofoorverwijdering maken niet alleen een sterk gemultiplexte biomarkeranalyse mogelijk, maar behouden ook het monster voor aanvullende downstream-analyse indien gewenst (bijv. Hematoxyline- en eosinekleuring). Bovendien maakt de beeldanalysesoftware beeldverwerking mogelijk - driftcompensatie, achtergrondaftrekking, celsegmentatie en clustering - evenals de visualisatie en analyse van de afbeeldingen en celfenotypen voor het genereren van ruimtelijke netwerkkaarten. Samenvattend maakt deze technologie gebruik van een gecomputeriseerd microfluïdicasysteem en fluorescentiemicroscoop om iteratief gelabelde DNA-sondes te hybridiseren, in beeld te brengen en te strippen die complementair zijn aan weefselgebonden, oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen.