Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

Die Multiplex-Bildgebungstechnologie mit Antikörper-Barcoding mit Oligonukleotiden, die mehrere Epitope im selben Gewebeabschnitt nacheinander detektiert, ist eine effektive Methode zur Tumorbewertung, die das Verständnis der Tumormikroumgebung verbessert. Die Visualisierung der Proteinexpression in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben wird erreicht, wenn ein spezifischer Fluorophor über komplementäre Oligonukleotide an einen Antikörper-gebundenen Barcode getempert wird und dann eine Probenbildgebung durchgeführt wird. Tatsächlich ermöglicht diese Methode die Verwendung von anpassbaren Panels mit mehr als 40 Antikörpern in einer einzigen Gewebefärbereaktion. Diese Methode ist mit frisch gefrorenem Gewebe, formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe, kultivierten Zellen und mononukleären Zellen des peripheren Blutes kompatibel, was bedeutet, dass Forscher diese Technologie verwenden können, um eine Vielzahl von Probentypen mit Einzelzellauflösung zu betrachten. Diese Methode beginnt mit einem manuellen Färbe- und Fixierungsprotokoll, und alle Antikörper-Barcodes werden mit einem Antikörpercocktail aufgebracht. Das Färbefluidik-Instrument ist vollständig automatisiert und führt iterative Zyklen der Markierung, Bildgebung und Entfernung spektral unterschiedlicher Fluorophore durch, bis alle Biomarker mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop abgebildet wurden. Die Bilder werden dann über alle Bildgebungszyklen hinweg gesammelt und kompiliert, um eine Einzelzellauflösung für alle Marker zu erreichen. Die einstufige Färbung und die schonende Entfernung von Fluorophoren ermöglichen nicht nur eine hochgradig gemultiplexte Biomarkeranalyse, sondern konservieren die Probe auch für zusätzliche nachgelagerte Analysen, falls gewünscht (z. B. Hämatoxylin- und Eosinfärbung). Darüber hinaus ermöglicht die Bildanalysesoftware die Bildverarbeitung – Driftkompensation, Hintergrundsubtraktion, Zellsegmentierung und Clustering – sowie die Visualisierung und Analyse der Bilder und Zellphänotypen für die Erstellung von räumlichen Netzwerkkarten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technologie ein computergestütztes Mikrofluidiksystem und ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, um fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden, die komplementär zu gewebegebundenen, Oligonukleotid-konjugierten Antikörpern sind, iterativ zu hybridisieren, abzubilden und zu streifen.