Analisi di immagini di codici a barre multiplexed per l'immunoprofilazione e la caratterizzazione della mappatura spaziale nell'analisi a singola cellula di campioni di tessuto di paraffina

La tecnologia di imaging multiplexed che utilizza il codice a barre anticorpale con oligonucleotidi, che rileva sequenzialmente più epitopi nella stessa sezione di tessuto, è una metodologia efficace per la valutazione del tumore che migliora la comprensione del microambiente tumorale. La visualizzazione dell'espressione proteica in tessuti fissati in formalina e incorporati in paraffina si ottiene quando uno specifico fluoroforo viene ricotto a un codice a barre legato agli anticorpi tramite oligonucleotidi complementari e quindi viene eseguita l'imaging del campione; Infatti, questo metodo consente l'uso di pannelli personalizzabili di oltre 40 anticorpi in una singola reazione di colorazione tissutale. Questo metodo è compatibile con tessuto fresco congelato, tessuto fissato in formalina, tessuto incorporato in paraffina, cellule in coltura e cellule mononucleate del sangue periferico, il che significa che i ricercatori possono utilizzare questa tecnologia per visualizzare una varietà di tipi di campioni a risoluzione singola cellulare. Questo metodo inizia con un protocollo di colorazione e fissaggio manuale e tutti i codici a barre degli anticorpi vengono applicati utilizzando un cocktail di anticorpi. Lo strumento di fluidica di colorazione è completamente automatizzato ed esegue cicli iterativi di etichettatura, imaging e rimozione di fluorofori spettralmente distinti fino a quando tutti i biomarcatori non sono stati ripresi utilizzando un microscopio a fluorescenza standard. Le immagini vengono quindi raccolte e compilate in tutti i cicli di imaging per ottenere una risoluzione a cella singola per tutti i marcatori. La colorazione in un'unica fase e la delicata rimozione dei fluorofori non solo consentono un'analisi dei biomarcatori altamente multiplexata, ma conservano anche il campione per ulteriori analisi a valle, se lo si desidera (ad esempio, colorazione con ematossilina ed eosina). Inoltre, il software di analisi delle immagini consente l'elaborazione delle immagini - compensazione della deriva, sottrazione dello sfondo, segmentazione cellulare e clustering - nonché la visualizzazione e l'analisi delle immagini e dei fenotipi cellulari per la generazione di mappe di rete spaziali. In sintesi, questa tecnologia impiega un sistema di microfluidica computerizzato e un microscopio a fluorescenza per ibridare iterativamente, visualizzare e strisciare sonde di DNA marcate con fluorescenza che sono complementari agli anticorpi coniugati con oligonucleotidi legati ai tessuti.