Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Мы описываем протокол, подробно описывающий изоляцию крипт толстой кишки мышей для развития трехмерных колоноидов. Затем сформированные колоноиды могут быть терминально дифференцированы, чтобы отразить клеточный состав эпителия хозяина до того, как они получат воспалительную инструкцию или будут направлены на создание эпителиального монослоя.

Abstract

Кишечный эпителий играет важнейшую роль в здоровье человека, обеспечивая барьер между хозяином и внешней средой. Этот высокодинамичный клеточный слой обеспечивает первую линию защиты между микробными и иммунными популяциями и помогает модулировать иммунный ответ кишечника. Нарушение эпителиального барьера является отличительным признаком воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) и представляет интерес для терапевтического таргетирования. 3-мерная колоноидная культуральная система является чрезвычайно полезной моделью in vitro для изучения динамики стволовых клеток кишечника и физиологии эпителиальных клеток в патогенезе ВЗК. В идеале, создание колоноидов из воспаленной эпителиальной ткани животных было бы наиболее полезным для оценки генетического и молекулярного влияния на заболевание. Однако мы показали, что эпителиальные изменения in vivo не обязательно сохраняются у колоноидов, полученных от мышей с острым воспалением. Чтобы устранить это ограничение, мы разработали протокол лечения колоноидов коктейлем медиаторов воспаления, которые обычно повышены во время ВЗК. Несмотря на то, что эта система может применяться повсеместно в различных условиях культивирования, этот протокол делает акцент на обработке как дифференцированных колоноидов, так и двухмерных монослоев, полученных из установленных колоноидов. В условиях традиционной культуры колоноиды обогащаются стволовыми клетками кишечника, обеспечивая идеальную среду для изучения ниши стволовых клеток. Однако эта система не позволяет провести анализ особенностей физиологии кишечника, таких как барьерная функция. Кроме того, традиционные колоноиды не дают возможности изучать клеточный ответ терминально дифференцированных эпителиальных клеток на провоспалительные раздражители. Методы, представленные здесь, представляют собой альтернативную экспериментальную основу для устранения этих ограничений. Двухмерная монослойная культуральная система также дает возможность проведения терапевтического скрининга лекарственных средств ex vivo. Этот поляризованный слой клеток может быть обработан медиаторами воспаления на базальной стороне клетки и одновременно с предполагаемой терапией апикально, чтобы определить их полезность в лечении ВЗК.

Introduction

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) — это хроническое, ремиттирующее и рецидивирующее заболевание, характеризующееся эпизодами воспаления и клиническим покоем. Этиология ВЗК является многофакторной, но ключевыми характерными особенностями заболевания являются дефектная барьерная функция и повышенная проницаемость кишечного эпителия, а также провоспалительные сигнальные каскады, активированные в эпителиальном компартменте 1,2. Для повторения эпителиального ответа во время ВЗК было использовано несколько моделей in vitro и in vivo, включая клеточные культуры и мышиные модели воспаления

Protocol

Все эксперименты с использованием мышиных тканей, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга и проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по исследованиям и уходу за животными в .......

Representative Results

3D система культивирования кишечных колоноидов является бесценным инструментом для изучения внутреннего вклада эпителия в гомеостаз слизистой оболочки кишечника. Описанный протокол содержит подробные инструкции о том, как изолировать крипты от мышей C57BL/6J (WT) в возрасте 8 недель и созд.......

Discussion

Разработка органоидов произвела революцию в том, как научное сообщество изучает системы органов in vitro , с возможностью частичного повторения клеточной структуры и функции животного или человека в чашке. Кроме того, органоидные системы, полученные от людей с заболеваниями, предлаг?.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения R01DK120986 (K.P.M.).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4-μM transparent transwell, 24-wellGreiner Bio-one662-641
15-mL conical tubesThermo Fisher 12-565-269
50-mL conical tubesThermo Fisher 12-565-271
70-μM cell strainerVWR76327-100
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-010Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement Invitrogen12587-010Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVOWorld Precision InstrumentsSTX2
Corning Matrigel GFR Membrane MixCorning354-230Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)Sigma-AldrichD0632-5GStock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucoseThermo Fisher11960-069Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and MagnesiumGibco 14190-144Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)Sigma-AldrichE7889Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine SerumBio-TechneS11150HStock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mmThermo Fisher 12-550-15
G418InvivoGenant-ga-1Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin ReagentGibco/Fisher15750-060Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1Fisher Scientific35050-061Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 MGibco15630-080Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγR&D Systems285-IFStock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1βR&D Systems201-LBStock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFαR&D Systems210-TAStock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide SigmaH1009Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B GoldInvivoGenant-hg-1Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell LineATCCCRL-3276
mEGFNovusNBP2-35176Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplementInvitrogen17502-048Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteineSigma A9165-5GStock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
NogginPeprotech250-38Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher15140-122Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposableVWR25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterileGreiner Bio-one5666-2160
R-SpondinR&D Systems3474-RS-050Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE ExpressThermo Fisher12604-013Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water Invitrogen10977-023Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride Abcamab120129Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)

References

  1. Martini, E., Krug, S. M., Siegmund, B., Neurath, M. F., Becker, C. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (1), 33-46 (2017).
  2. McGuckin, M. A., Rajaraman, E., Simms, L. A., Florin, T. H. J., Radford-Smith, G.

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved