Изучение эпителиальных эффектов воспаления кишечника in vitro на установленных колоноидах мышей

Summary

Мы описываем протокол, подробно описывающий изоляцию крипт толстой кишки мышей для развития трехмерных колоноидов. Затем сформированные колоноиды могут быть терминально дифференцированы, чтобы отразить клеточный состав эпителия хозяина до того, как они получат воспалительную инструкцию или будут направлены на создание эпителиального монослоя.

Abstract

Кишечный эпителий играет важнейшую роль в здоровье человека, обеспечивая барьер между хозяином и внешней средой. Этот высокодинамичный клеточный слой обеспечивает первую линию защиты между микробными и иммунными популяциями и помогает модулировать иммунный ответ кишечника. Нарушение эпителиального барьера является отличительным признаком воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) и представляет интерес для терапевтического таргетирования. 3-мерная колоноидная культуральная система является чрезвычайно полезной моделью in vitro для изучения динамики стволовых клеток кишечника и физиологии эпителиальных клеток в патогенезе ВЗК. В идеале, создание колоноидов из воспаленной эпителиальной ткани животных было бы наиболее полезным для оценки генетического и молекулярного влияния на заболевание. Однако мы показали, что эпителиальные изменения in vivo не обязательно сохраняются у колоноидов, полученных от мышей с острым воспалением. Чтобы устранить это ограничение, мы разработали протокол лечения колоноидов коктейлем медиаторов воспаления, которые обычно повышены во время ВЗК. Несмотря на то, что эта система может применяться повсеместно в различных условиях культивирования, этот протокол делает акцент на обработке как дифференцированных колоноидов, так и двухмерных монослоев, полученных из установленных колоноидов. В условиях традиционной культуры колоноиды обогащаются стволовыми клетками кишечника, обеспечивая идеальную среду для изучения ниши стволовых клеток. Однако эта система не позволяет провести анализ особенностей физиологии кишечника, таких как барьерная функция. Кроме того, традиционные колоноиды не дают возможности изучать клеточный ответ терминально дифференцированных эпителиальных клеток на провоспалительные раздражители. Методы, представленные здесь, представляют собой альтернативную экспериментальную основу для устранения этих ограничений. Двухмерная монослойная культуральная система также дает возможность проведения терапевтического скрининга лекарственных средств ex vivo. Этот поляризованный слой клеток может быть обработан медиаторами воспаления на базальной стороне клетки и одновременно с предполагаемой терапией апикально, чтобы определить их полезность в лечении ВЗК.

Introduction

Воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) — это хроническое, ремиттирующее и рецидивирующее заболевание, характеризующееся эпизодами воспаления и клиническим покоем. Этиология ВЗК является многофакторной, но ключевыми характерными особенностями заболевания являются дефектная барьерная функция и повышенная проницаемость кишечного эпителия, а также провоспалительные сигнальные каскады, активированные в эпителиальном компартменте ^1,2. Для повторения эпителиального ответа во время ВЗК было использовано несколько моделей in vitro и in vivo, включая клеточные культуры и мышиные модели воспаления

Protocol

Все эксперименты с использованием мышиных тканей, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Питтсбурга и проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по исследованиям и уходу за животными в .......

Discussion

Разработка органоидов произвела революцию в том, как научное сообщество изучает системы органов in vitro , с возможностью частичного повторения клеточной структуры и функции животного или человека в чашке. Кроме того, органоидные системы, полученные от людей с заболеваниями, предлаг?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4-μM transparent transwell, 24-well	Greiner Bio-one	662-641
15-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-269
50-mL conical tubes	Thermo Fisher	12-565-271
70-μM cell strainer	VWR	76327-100
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
B-27 supplement	Invitrogen	12587-010	Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x)
Chopsticks Electrode Set for EVO	World Precision Instruments	STX2
Corning Matrigel GFR Membrane Mix	Corning	354-230	Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%)
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632-5G	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water)
DMEM high glucose	Thermo Fisher	11960-069	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium	Gibco	14190-144	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA)	Sigma-Aldrich	E7889	Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM)
Fetal Bovine Serum	Bio-Techne	S11150H	Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm	Thermo Fisher	12-550-15
G418	InvivoGen	ant-ga-1	Final Concentration (400 µg/µL)
Gentamicin Reagent	Gibco/Fisher	15750-060	Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL)
GlutaMAX-1	Fisher Scientific	35050-061	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
HEPES 1 M	Gibco	15630-080	Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM)
hIFNγ	R&D Systems	285-IF	Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hIL-1β	R&D Systems	201-LB	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
hTNFα	R&D Systems	210-TA	Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water)
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009	Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media)
Hygromycin B Gold	InvivoGen	ant-hg-1	Final Concentration (400 µg/µL)
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
mEGF	Novus	NBP2-35176	Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165-5G	Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water)
Noggin	Peprotech	250-38	Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher	15140-122	Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x)
Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable	VWR	25384-342
Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile	Greiner Bio-one	5666-2160
R-Spondin	R&D Systems	3474-RS-050	Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA)
Tryp LE Express	Thermo Fisher	12604-013	Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA)
UltraPure Water	Invitrogen	10977-023	Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x)
Y-27632 dihyddrochloride	Abcam	ab120129	Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water)