تحليلات التعبير الجيني في البصيلات البشرية

المبيض هو عضو غير متجانس يتكون من أنواع مختلفة من الخلايا. لدراسة الآليات الجزيئية التي تحدث أثناء تكوين الجريب ، يمكن إجراء توطين البروتينات والتعبير الجيني على الأنسجة الثابتة. ومع ذلك ، لتقييم مستويات التعبير الجيني بشكل صحيح في جريب بشري ، يجب عزل هذا الهيكل المعقد والدقيق. ومن ثم ، تم تطوير بروتوكول معدل سبق وصفه من قبل مختبر وودروف لفصل البصيلات (البويضة والخلايا الحبيبية) عن البيئة المحيطة بها. تتم معالجة الأنسجة القشرية المبيضية يدويا أولا للحصول على شظايا صغيرة باستخدام أداتين: قطاعة الأنسجة ومفرمة الأنسجة. ثم يتم هضم الأنسجة إنزيميا مع 0.2 ٪ كولاجيناز و 0.02 ٪ DNase لمدة 40 دقيقة على الأقل. يتم تنفيذ خطوة الهضم هذه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ ويرافقها ماصة ميكانيكية للوسط كل 10 دقائق. بعد الحضانة ، يتم جمع البصيلات المعزولة يدويا باستخدام ماصة شعرية دقيقة معايرة تحت تكبير المجهر. إذا كانت البصيلات لا تزال موجودة في قطع الأنسجة ، يتم الانتهاء من الإجراء بالتشريح المجهري اليدوي. يتم جمع البصيلات على الجليد في وسط استزراع ويتم شطفها مرتين في قطرات من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يجب التحكم في عملية الهضم هذه بعناية لتجنب تدهور الجريب. بمجرد أن يبدو أن بنية البصيلات معرضة للخطر أو بعد 90 دقيقة كحد أقصى ، يتم إيقاف التفاعل بمحلول مانع 4 درجات مئوية يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. يجب جمع ما لا يقل عن 20 جريبا معزولا (بحجم أقل من 75 ميكرومتر) للحصول على كمية كافية من إجمالي الحمض النووي الريبي بعد استخراج الحمض النووي الريبي لتفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-qPCR). بعد الاستخراج ، يصل القياس الكمي للحمض النووي الريبي الكلي من 20 بصيلة إلى قيمة متوسطة تبلغ 5 نانوغرام / ميكرولتر. ثم يتم نسخ الحمض النووي الريبي الكلي إلى cDNA ، ويتم تحليل الجينات ذات الأهمية باستخدام RT-qPCR.