يتم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين 31970752 ، العلوم والتكنولوجيا ، لجنة الابتكار في بلدية شنتشن JCYJ20190809180003689 ، JSGG20200225150707332 ، JSGG20191129110812708 ، WDZC20200820173710001 ؛ التمويل المفتوح لمختبر خليج شنتشن ، SZBL2020090501004 ؛ مؤسسة الصين لعلوم ما بعد الدكتوراه 2020M680023 ؛ والإدارة العامة للجمارك في جمهورية الصين الشعبية 2021HK007.

1. تجهيز العينات
<ol><li>خذ فيروس الضفدع 3 (FV3 ، أجناس رانافيروس ، عائلة Iridoviridae) ، وهو فيروس DNA مزدوج تقطعت بهم السبل. حدد جين القفيصة الرئيسية (mcp) كهدف للكشف عن FV3 لأنه محفوظ للغاية وعادة ما يعتبر هدفا للكشف عن فيروس رانا. ويبين الجدول 1 التسلسل المستهدف المحدد. ?...

<ol>
	<li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak.">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).</li><li>The Ebola Outbreak Epidemiology Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Ebola+virus+disease+in+the+Democratic+Republic+of+the+Congo,+April-May+2018:+an+epidemiological+study.">Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study.</a> Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).</li><li>Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Middle+East+respiratory+syndrome.">Middle East respiratory syndrome.</a> Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).</li><li>Plourde, A. R., Bloch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+literature+review+of+Zika+virus.">A literature review of Zika virus.</a> Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+perspective+diagnostic+techniques+for+COVID-19.">Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19.</a> ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).</li><li>Minhaj, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monkeypox+outbreak+-+nine+states,+May+2022.">Monkeypox outbreak - nine states, May 2022.</a> MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).</li><li>Bao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+based+molecular+biosensing.">Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing.</a> ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).</li><li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2.">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li><li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity.">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a/C2c2.">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li><li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHERLOCK:+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases.">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li><li>Mukama, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+and+specific+point-of-care+CRISPR/Cas12+based+lateral+flow+biosensor+for+the+rapid+detection+of+nucleic+acids.">An ultrasensitive and specific point-of-care CRISPR/Cas12 based lateral flow biosensor for the rapid detection of nucleic acids.</a> Biosens Bioelectron. 159, 112143 (2020).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>Yin, L., Man, S., Ye, S., Liu, G., Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+based+virus+detection:+Recent+advances+and+perspectives.">CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives.</a> Biosens Bioelectron. 193, 113541 (2021).</li><li>Dronina, J., Bubniene, U. S., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+DNA+polymerases+and+Cas9+as+representative+of+DNA-modifying+enzymes+group+in+DNA+sensor+design+(review).">The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review).</a> Biosens Bioelectron. 175, 112867 (2021).</li><li>Fozouni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification-free+detection+of+SARS-CoV-2+with+CRISPR-Cas13a+and+mobile+phone+microscopy.">Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy.</a> Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).</li><li>Kumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCas9-based+CRISPR+diagnostic+for+rapid+and+accurate+detection+of+major+SARS-CoV-2+variants+on+a+paper+strip.">FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip.</a> eLife. 10, e67130 (2021).</li><li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria.">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li><li>Ganguli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hands-free+smartphone-based+diagnostics+for+simultaneous+detection+of+Zika,+Chikungunya,+and+Dengue+at+point-of-care.">Hands-free smartphone-based diagnostics for simultaneous detection of Zika, Chikungunya, and Dengue at point-of-care.</a> Biomed Microdevices. 19 (4), 73 (2017).</li><li>Yeo, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smartphone-based+fluorescent+diagnostic+system+for+highly+pathogenic+H5N1+viruses.">Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses.</a> Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).</li><li>von Chamier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Democratising+deep+learning+for+microscopy+with+ZeroCostDL4Mic.">Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic.</a> Nat Commun. 12 (1), 2276 (2021).</li><li>Shiaelis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+detection+and+identification+in+minutes+using+single-particle+imaging+and+deep+learning.">Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning.</a> ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed-UNet:+Refined+class+activation+mapping+for+weakly-supervised+semantic+segmentation+with+multi-scale+inference.">Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference.</a> Front. Comput. Sci. 4, 1036934 (2022).</li><li>Lawrimore, J., Doshi, A., Walker, B., Bloom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AI-assisted+forward+modeling+of+biological+structures.">AI-assisted forward modeling of biological structures.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 279 (2019).</li><li>Yang, Y., Hu, Y., Zhang, X., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-stage+selective+ensemble+of+CNN+via+deep+tree+training+for+medical+image+classification.">Two-stage selective ensemble of CNN via deep tree training for medical image classification.</a> IEEE Trans Cybern. 52 (9), 9194-9207 (2022).</li><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RCMNet:+A+deep+learning+model+assists+CAR-T+therapy+for+leukemia.">RCMNet: A deep learning model assists CAR-T therapy for leukemia.</a> Comput Biol Med. 150, 106084 (2022).</li><li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+prediction+from+electrocardiograms+by+deep+neural+network.">Stroke prediction from electrocardiograms by deep neural network.</a> Multimed Tools Appl. 80, 17291-17297 (2021).</li><li>Wang, J., Zhu, H., Wang, S., Zhang, Y. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+deep+learning+on+medical+image+analysis.">A review of deep learning on medical image analysis.</a> Mobile Netw Appl. 26, 351-380 (2021).</li><li>Artoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning+of+spontaneous+arousal+fluctuations+detects+early+cholinergic+defects+across+neurodevelopmental+mouse+models+and+patients.">Deep learning of spontaneous arousal fluctuations detects early cholinergic defects across neurodevelopmental mouse models and patients.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23298-23303 (2020).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeepLearnMOR:+a+deep-learning+framework+for+fluorescence+image-based+classification+of+organelle+morphology.">DeepLearnMOR: a deep-learning framework for fluorescence image-based classification of organelle morphology.</a> Plant Physiol. 186 (4), 1786-1799 (2021).</li><li>Yosinski, J., Clune, J., Bengio, Y., Lipson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+transferable+are+features+in+deep+neural+networks.">How transferable are features in deep neural networks.</a> Proceedings of the 27th International Conference on Neural Information Processing Systems. 2, 3320-3328 (2014).</li><li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+all-solution+phase+African+Swine+Fever+Virus+(ASFV)+detection+using+CRISPR-Cas12a+and+fluorescence+based+point-of-care+system.">High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system.</a> Biosens Bioelectron. 154, 112068 (2020).</li><li>Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageNet+classification+with+deep+convolutional+neural+networks.">ImageNet classification with deep convolutional neural networks.</a> Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).</li><li>Lawton, S., Viriri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+COVID-19+from+CT+lung+scans+using+transfer+learning.">Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning.</a> Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923 (2021).</li><li>Lei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+frog+virus+3+by+integrating+RPA-CRISPR/Cas12a-SPM+with+deep+learning.">Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning.</a> ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).</li><li>Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+shrimp+hemocyte+iridescent+virus+by+recombinase+polymerase+amplification+assay.">Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay.</a> Mol Cell Probes. 49, 101475 (2020).</li><li>Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+ultrasensitive+dual+detection+platform+based+on+Cas12a+for+simultaneous+detection+of+virulence+and+resistance+genes+of+drug-resistant+Salmonella.">A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella.</a> Biosens Bioelectron. 195, 113682 (2022).</li><li>Habimana, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+of+CRISPR/Cas+nucleases+for+programmable+targeting+and+early-stage+diagnosis:+A+review.">Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review.</a> Biosens Bioelectron. 203, 114033 (2022).</li><li>Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+tracking+of+Omicron+variant+of+SARS-CoV-2+using+CRISPR-Cas12a-based+assay.">Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay.</a> Biosens Bioelectron. 205, 114098 (2022).</li><li>Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+RNA+viruses+in+living+mammalian+cells+by+fluorescence+microscopy.">Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy.</a> Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).</li><li>Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging,+tracking+and+computational+analyses+of+virus+entry+and+egress+with+the+cytoskeleton.">Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton.</a> Viruses. 10 (4), 166 (2018).</li></ol>

في هذه الطريقة ، نقوم بتطوير نظام سريع وسهل التنفيذ وحساس للغاية ومحدد التسلسل وللكشف عن فيروس الحمض النووي POC بمساعدة الذكاء الاصطناعي. بعد الحصول على العينات ، يتم تطبيق RPA لتضخيم تسلسل الهدف ، ومن ثم يمكن ل CRISPR / Cas12a التعرف على الحمض النووي المستهدف وإطلاق التألق ، مما يؤدي إلى توسيع إشار...

في السنوات الأخيرة ، حدثت أوبئة الأمراض المعدية التي تسببها فيروسات مختلفة بشكل متكرر ، بما في ذلك وباء مرض فيروس الإيبولا (EVD) في عامي 20141 و 20182 ، ومتلازمة الشرق الأوسط التنفسية (MERS) في عام 20153 ، ووباء مرض فيروس زيكا في عام 20154 ، ومرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) الناجم عن فيروس كورونا 2 المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2)5 واستمرار جدري الناجم عن فيروس جدري (MKPV) في عام 20226. هذه الفاشيات المفاجئة للأمراض المعدية الوبائية تسبب عددا كبيرا من الوفيات وتجلب خسائر اقتصادية ضخمة واضطرابات اجتماعية. هناك حاجة ماسة إلى نظام كشف سريع ودقيق لتشخيص العدوى بسرعة ومنع انتشار الفيروس.
في الآونة الأخيرة ، اكتسبت التكرارات العنقودية القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) والبروتينات المرتبطة بكريسبر (Cas) اهتماما عالميا وأظهرت نتائج واعدة في الكشف عن الحمض النووي7،8،9،10،11،12،13،14،15. يرتبط بروتين كريسبر / كاس 12 أ ، الذي يسترشد ب CRISPR RNA (crRNA) ، بالحمض النووي المستهدف ويقطعه. يؤدي هذا النشاط إلى إطلاق الحمض النووي أحادي الشريط غير المحدد (ssDNA) ، والمعروف باسم الانقسام العابر ، ويمكن استخدامه لتعزيز إشارة الكشف للكشف عن الحمض النووي. بعض طرق الكشف التقليدية مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) ، ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) معقدة وتستغرق وقتا طويلا ومكلفة للكشف عن نقطة الرعاية (POC). نجح عملنا السابق في تطوير نظام كشف آلي ومتكامل وفعال من حيث التكلفة لفيروس حمى الخنازير الأفريقية (ASFV) يعتمد على تقنية CRISPR / Cas12a. في هذا النظام ، حققنا حدا للكشف يبلغ 1 pM في إطار زمني 2 ساعة دون الحاجة إلى التضخيم. يتم الجمع بين نظام CRISPR / Cas12a وتضخيم البوليميراز المؤتلف (RPA) لتحسين الحساسية والنوعية للكشف عن الحمض النووي النزرة. بالمقارنة مع تقنيات التضخيم متساوية الحرارة الأخرى ، فإن RPA بسيط في التصميم ومريح في التشغيل نظرا لأنه يتمتع بوقت رد فعل أقصر بدون معدات متطورة للتحكم في درجة الحرارة.
للكشف عن POC لمسببات الأمراض ، تم تطوير أدوات مثل الفحص المجهري للهواتف الذكية (SPM) أو مقياس الفلور المحمول أو شرائط التدفق الجانبي لقراءات النتائج16،17،18. يلتقط SPM الصور من خلال الكاميرا ويحملها إلى بعض تطبيقات الهاتف المحمول لتحليل البيانات بسرعة. يصنع هذا الفحص المجهري نظاما محمولا ورخيصا ومصغرا لاكتساب الإشارات بحساسية عالية وقد أظهر مزايا في الكشف عن مسببات الأمراض مثل H5N1 وفيروس زيكا و SARS-CoV-219,20. لذلك ، نقوم ببناء SPM محمول لالتقاط إشارات التألق الناتجة عن اكتشاف RPA-CRISPR / Cas12a لفيروس الحمض النووي المستهدف. سيتم شق مسبار مراسل ssDNA الذي يربط بين الفلوروفور والمروي عندما يتعرف CRISPR / Cas12a على فيروس الحمض النووي المستهدف ، ويمكن التقاط التألق المنبعث من الفلوروفور بواسطة SPM.
مقارنة بالبرامج الاحترافية المستخدمة عادة للحصول على معلومات النتائج من الصور الفلورية من SPM21 ، يستخدم بعض الخبراء التعلم الآلي والتعلم العميق لتحديد تركيزات الحمض النووي للفيروس بعد الحصول على صور مضان22 ، وهو ما يستغرق وقتا أطول. عندما يتعلق الأمر بتصنيف الصور الطبية ، غالبا ما تستخدم الشبكات العصبية التقليدية (CNNs) لتعلم الميزات من الصور المنقطة الخام بطريقة شاملة23،24،25،26. تم تطبيق نماذج التعلم العميق الشائعة المستندة إلى CNN مثل AlexNet و DenseNet-121 و EfficientNet-B7 بنجاح في هذا المجال27,28. ومع ذلك ، قد يكون الحصول على مجموعات بيانات كبيرة في مجالات محددة أمرا صعبا ، مما يستلزم نقل التعلم29,30. يقوم هذا النهج بتدريب نموذج التعلم العميق مسبقا باستخدام مجموعة بيانات كبيرة ، ويتم استخدام النموذج المدرب مسبقا كنقطة انطلاق لمهمة جديدة مع مجموعة بيانات صغيرة. يمكن أن تقلل هذه التقنية من الحاجة إلى مجموعات البيانات الكبيرة ، ومكافحة الإفراط في التجهيز ، وتقليل وقت التدريب31. هنا ، نستخدم نماذج التعلم العميق مع نقل التعلم للتصنيف الثنائي للصور الفلورية للعينات الموجبة والسالبة.
في هذه الطريقة ، نجمع بين RPA ونظام CRISPR / Cas12a للكشف عن تتبع فيروسات الحمض النووي. يتم تضخيم الحمض النووي المستهدف والتعرف عليه بواسطة RPA و CRISPR / Cas12a بشكل منفصل ، مما يؤدي إلى نشاط الانقسام الجانبي ل Cas12a الذي يشق مراسل الحمض النووي المسمى بالفلوروفور ويعمم التألق. نحن نبني SPM محمول لالتقاط صور الفلورسنت للكشف عن POC وتطوير نماذج التعلم العميق للتصنيف الثنائي. يظهر الرسم التخطيطي لنظام الكشف عن POC المدمج في الشكل 1. بدون مشغلين ماهرين وأدوات ضخمة، تظهر تقنية RPA-CRISPR/Cas12a-SPM المزودة بتصنيف بمساعدة الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) إمكانات كبيرة للكشف عن فيروس الحمض النووي ل POC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64833/64833fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لنظام الكشف RPA-CRISPR/Cas12-SPM إلى جانب التصنيف الذكاء الاصطناعي للصور المجمعة. يتم إطلاق الأحماض النووية للعينات المشتقة من بواسطة PINDBK. يتم تضخيم الحمض النووي المستهدف للفيروس والتعرف عليه على وجه التحديد بواسطة نظام RPA-CRISPR / Cas12a. ترتبط CRISPR / Cas12a مع crRNA والروابط المعقدة Cas12a-crRNA مع الحمض النووي المستهدف ، مما يؤدي إلى الانقسام الجانبي ل CRISPR / Cas12a على تحقيقات مراسل ssDNA. يتم إطلاق الفلوروفور على المراسل ، ويتم الكشف عن التألق بواسطة قارئ لوحة تجاري أو SPM الذي نبنيه. يتم استخدام ثلاثة نماذج مختلفة للتعلم العميق ، بما في ذلك AlexNet و DenseNet-121 و EfficientNet-B7 مع نقل التعلم ، لتصنيف الصور الفلورية. أعيد استخدام هذا الرقم بإذن من Lei et al.35. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64833/64833fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x amplification</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>OPLN20X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532 nm green laser</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PL201</td>
			<td>with 0.9 mW output power</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>535 nm cutoff wavelength</td>
			<td>chrome</td>
			<td>AT535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6x DNA loading buffer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well black microplate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3603</td>
			<td>Black with flat clear bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspherical lens</td>
			<td>Lubang</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>FF01-542/27-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bsu DNA Polymerase</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M103</td>
			<td>Large Fragment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crRNA</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA fragments</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic holders</td>
			<td>Ruicage</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichroic mirror</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>FF555-Di03-25x36</td>
			<td>with a cutoff wavelength of 535 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A Gel Extraction Kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>D2500-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnGen Lba Cas12a (Cpf1)</td>
			<td>New England Biolabs (Beijing) LTD</td>
			<td>M0653T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holders</td>
			<td>Ruicage</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore-ssDNA-Quencher reporter probes</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>TAMRA (carboxy tetramethylrhodamine) as the fluorophore at the 5 ends; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) as the quencher at the 3 ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GP32</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Open-source</td>
			<td>Version 1.53t 24</td>
			<td>Downloaded from https://imagej.nih.gov/ij/&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>SPARK, TECAN</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Block thermal Cycler PCR instrument</td>
			<td>LongGene</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1</td>
			<td>New England Biolabs (Beijing) LTD</td>
			<td>B6002S</td>
			<td>10x CRISPR/Cas12a Reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen plasma treatment&#160;</td>
			<td>Electro-Technic&#160; Products</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pathogen Inactivate, Nucleic acid extraction-free, Direct-to-PCR Buffer with Proteinase K (PINDBK)</td>
			<td>Ebio</td>
			<td>PINDBK -25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primer pairs</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPA primer pairs</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone</td>
			<td>Huawei</td>
			<td>Mate10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translation stages</td>
			<td>Ruicage</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmitted neutral density filters</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ND40A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triplet achromatic lenses</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRH127-020-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UvsX</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UvsY</td>
			<td>ATG Biotechnology</td>
			<td>M106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna virus detection system based on rpa-crispr/cas12a-spm and deep learning

لقد أبلغنا عن نظام سريع وسهل التنفيذ وحساس للغاية ومحدد التسلسل ونقطة رعاية (POC) للكشف عن فيروسات الحمض النووي ، والذي يجمع بين تضخيم بوليميراز الاتحاد (RPA) ونظام CRISPR / Cas12a للكشف عن تتبع فيروسات الحمض النووي. يتم تضخيم الحمض النووي المستهدف والتعرف عليه بواسطة RPA و CRISPR / Cas12a بشكل منفصل ، مما يؤدي إلى نشاط الانقسام الجانبي ل Cas12a الذي يشق مراسل الحمض النووي المسمى بالفلوروفور ويعمم التألق. للكشف عن POC ، تم تصميم الفحص المجهري المحمول للهواتف الذكية لالتقاط صور الفلورسنت. إلى جانب ذلك ، يتم نشر نماذج التعلم العميق للتصنيف الثنائي للعينات الإيجابية أو السلبية ، وتحقيق دقة عالية ، داخل النظام. تم اختبار فيروس الضفدع 3 (FV3 ، أجناس رانافيروس ، عائلة Iridoviridae) كمثال على نظام الكشف عن POC لفيروس الحمض النووي ، ويمكن أن تصل حدود الكشف (LoD) إلى 10 صباحا في غضون 40 دقيقة. بدون مشغلين ماهرين وأدوات ضخمة ، يظهر RPA-CRISPR / Cas12a-SPM المحمول والمصغر مع التصنيف بمساعدة الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) إمكانات كبيرة للكشف عن فيروس الحمض النووي POC ويمكن أن يساعد في منع انتشار مثل هذه الفيروسات.

تركز هذه الطريقة على نظام كشف سريع وسهل التنفيذ وحساس للغاية ونقطة رعاية (POC) لفيروسات الحمض النووي. يعد تصميم أزواج التمهيدي لتفاعل RPA وتصميم crRNA لتفاعل CRISPR / Cas12a من الأجزاء الأساسية لأنهما سيؤثران على كفاءة تفاعل RPA-CRISPR / Cas12a ويؤثران على الكشف والتصنيف اللاحقين.
ف...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning at JoVE.com

DNA Virus Detection System Based on RPA-CRISPR/Cas12a-SPM and Deep Learning

نقدم بروتوكولا يجمع بين تضخيم بوليميراز المؤتلف ونظام CRISPR / Cas12a للكشف عن تتبع فيروسات الحمض النووي ويبني مجهرا محمولا للهواتف الذكية مع تصنيف مدعوم بالذكاء الاصطناعي للكشف عن فيروس الحمض النووي في نقطة الرعاية.

نظام الكشف عن فيروسات الحمض النووي استنادا إلى تقنية RPA-CRISPR/Cas12a-SPM والتعلم العميق

We report a fast, easy-to-implement, highly sensitive, sequence-specific, and point-of-care (POC) DNA virus detection system, which combines recombinase ...

يقدم بروتوكولنا نظام كشف سريع وحساس للغاية لفيروس الضفدع 3. ومن الجدير بالذكر أن هذه الطريقة تمكن من الكشف عن فيروسات الحمض النووي في نقاط الرعاية ، وتلعب دورا حاسما في منع حدوث الأمراض الوبائية. تكمن الميزة الأساسية لهذه التقنية في دمجها لتقنية RPA مع نظام CRISPR / Cas12a ، الذي يكمله مجهر محمول قائم على الهاتف الذكي وتصنيف الذكاء الاصطناعي.يعزز هذا التكامل بشكل كبير كفاءة الكشف ودقته مع تقليل الأخطاء المنسوبة إلى العوامل البشرية في نفس الوقت. للبدء ، أضف إنزيمات RPA الرئيسية الأربعة في المخزن المؤقت للتفاعل. ثم أضف الاشعال المصممة مسبقا إلى الخليط.دوامة الخليط جيدا. أضف ميكرولترا واحدا من الحمض النووي المستهدف الذي تم الحصول عليه من فيروس الضفدع 3 إلى كل تفاعل RPA ، ودوامة للخلط جيدا. بعد ذلك، ماصة سبعة ميكرولترات من 100 مليمول كلوريد المغنيسيوم لبدء التفاعل.احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإكمال الفحص. تحضير بروتين بكتيريا Lachnospiraceae CAS12a مع CRISPR RNA لتشكيل مجمعات وظيفية. امزج البروتين البكتيري و 10 × كريسبر / كاس 12 أ عازلة للتفاعل.أضف الآن 500 مسبار مراسل نانوي أحادي الشريط من الحمض النووي. أضف ميكرولترا واحدا من منتج تفاعل RPA إلى خليط تفاعل CRISPR / Cas12a CRISPR RNA. احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.قم بقياس إشارات الفلورسنت باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة. للكشف باستخدام مجهر الهاتف الذكي ، أولا ، ماصة خليط التفاعل المحضر على شريحة زجاجية منسحبة. ثم قم بتغطيته بغطاء قبل الحضانة.ضع الشريحة على مسرح مجهر الهاتف الذكي ، واضبط البعد البؤري والوضوح. التقط صورة لقياس إشارات الفلورسنت. استخدم ImageJ لقياس متوسط القيمة الرمادية لكل صورة والانحراف المعياري لمتوسط القيمة الرمادية في مجموعة تركيز.اعتماد نموذج التعلم العميق AlexNet 33 للتصنيف. الآن استخدم Python لإعادة تشكيل الصور المدخلة إلى 224 × 224 بواسطة ثلاث قنوات. أخيرا ، استخدم شبكة أساسية مدربة مسبقا مع مجموعة بيانات ImageNet لاستخراج ميزات الصورة.قدم الزوج السادس من الاشعال أقصى كفاءة تضخيم ، وتم اختياره. أثبتت كريسبر RNA-3 أنها الأكثر كفاءة للانقسام الجانبي. أدى استخدام نظام كشف مطور مع بادئات RPA مختارة و CRISPR RNA إلى اختلافات كبيرة بين 10 aM FV3 والتحكم.النقطة الأكثر أهمية التي يجب تذكرها هي خطوة اكتشاف CAS 12a المحددة. يمكن تعديل أو إعادة تصميم الحمض النووي الريبي كريسبر للتفاعل لاستهداف فيروسات الحمض النووي الأخرى بناء على اكتشاف CAS 12a. يمكن أن تساعد الطريقة المقترحة في التقييم الأولي لكمية الفيروس المستهدف.بناء على ذلك ، يمكن استخدام طرق أخرى مثل qPCR للحصول على حمل فيروسي أكثر دقة. توفر هذه التقنية محاولة أولية نحو الكشف المحمول عن فيروسات الحمض النووي. أما بالنسبة لفيروس الضفدع 3 المستخدم في هذا البروتوكول ، فإن الكشف في الوقت المناسب يمكن أن يؤدي إلى اتخاذ تدابير وقائية فعالة ، مما يقلل من الخسائر في صناعة التربية.

نظام الكشف عن فيروسات الحمض النووي استنادا إلى تقنية RPA-CRISPR/Cas12a-SPM والتعلم العميق

Abstract