איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן ההלנית למחקר וחדשנות (#3222 עד A.C). אנה חג'יהמבי ממומנת על ידי מכון רוג'ר ויליאמס להפטולוגיה, הקרן לחקר הכבד.

כל ההליכים בוצעו על ידי אנשי ביומטק בהתאם לתקנות הרווחה האירופיות והלאומיות ואושרו על ידי הרשויות הלאומיות (מספר רישיון: EL 25, BIOexp 45/PN 49553, 21/01/20). כל הניסויים תוכננו ודווחו בהתאם להנחיות ARRIVE26. העכברים נרכשו ממכון פסטר ההלני, אתונה, יוון.
הערה: בעלי החיים שוכנו בקבוצ...

השיטה המומלצת כיום לאבחון והיערכות NAFLD בבני אדם היא ביופסיית כבד, הטומנת בחובה סיכון לדימום מורכב, כמו גם לאי דיוקי דגימה40. להיפך, במודלים של בעלי חיים, אבחון כזה מבוצע על ידי היסטולוגיה לאחר המוות, אם כי פרוטוקולים לביופסיה של כבד שרידות זמינים כיום ומומלצים כאשר תכנון המחקר מ...

מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא מחלה מטבולית המשפיעה על כ -25% מהאוכלוסייה ו ->80% מהאנשים הסובלים מהשמנת יתר חולנית1. על פי הערכות, שליש מהאנשים הללו מתקדמים לסטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), המאופיינת בסטאטוזיס כבד, דלקת ופיברוזיס2. NASH הוא שלב מחלה עם סיכון גבוה משמעותית להתפתחות שחמת הכבד וקרצינומה הפטוצלולרית (HCC)3,4. מסיבה זו, NASH הוא כיום הגורם השני בשכיחותו להשתלת כבד, והוא גם צפוי להפוך בקרוב למנבא החשוב ביותר להשתלת כבד 5,6,7. למרות שכיחותו וחומרתו, אין טיפול ספציפי למחלה זמין עבור NAFLD, והטיפולים הקיימים נועדו רק להתמודד עם פתולוגיות הקשורות למחלה כגון עמידות לאינסולין והיפרליפידמיה 5,6.
בשנים האחרונות, התפקיד הפתופיזיולוגי וההתאמות של האנדותל, ובכלל, של רשת כלי הדם של רקמות מטבוליות, כגון רקמת השומן והכבד, צוברים חשיבות רבה יותר במחקר, במיוחד במהלך השמנת יתר וחוסר ויסות מטבולי 7,8. האנדותל הוא חד-שכבה תאית המרפדת את רשת כלי הדם באופן פנימי, ופועלת כמחסום תפקודי ומבני. הוא גם תורם לתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים, כגון פקקת, הובלת מטבוליטים, דלקת ואנגיוגנזה 9,10. במקרה של הכבד, רשת כלי הדם מאופיינת בין היתר בנוכחות של תאים מיוחדים מאוד, המוגדרים כתאי אנדותל סינוסואידים בכבד (LSECs). תאים אלה חסרים קרום מרתף ויש להם fenestrae מרובים, המאפשר העברה קלה יותר של מצעים בין הדם ואת parenchyma הכבד. בשל מיקומם האנטומי הייחודי ומאפייניהם, סביר להניח של-LSECs יש תפקיד מכריע בתהליכים הפתופיזיולוגיים של הכבד, כולל התפתחות דלקת כבד ופיברוזיס במהלך NAFLD/NASH. ואכן, ההתאמות הפתולוגיות, המולקולריות והתאיות שעוברות LSECs במהלך NAFLD תורמות להתקדמות המחלה11. באופן ספציפי, אנגיוגנזה בכבד תלוית LSEC המתרחשת במהלך NAFLD קשורה באופן משמעותי עם התפתחות דלקת והתקדמות המחלה ל- NASH או אפילו HCC12. חוץ מזה, NAFLD מוקדם הקשור להשמנת יתר מאופיין בהתפתחות עמידות לאינסולין ב- LSECs, אשר מקדימה את התפתחות דלקת הכבד או סימני NAFLD מתקדמים אחרים13.
בנוסף, LSECs התגלו לאחרונה כרגולטורים מרכזיים של זרימת הדם בכבד והתאמות רשת כלי הדם במהלך מחלת כבד של מספר אטיולוגיות14,15. ואכן, מחלת כבד כרונית מאופיינת בהתכווצות כלי דם תוך כבדית בולטת ובהתנגדות מוגברת לזרימת הדם, התורמות להתפתחות יתר לחץ דם פורטלי16. במקרה של NAFLD, מספר מנגנונים הקשורים ל-LSEC תורמים לתופעה זו. לדוגמה, תנגודת לאינסולין ספציפית ל-LSEC, כפי שהוזכר לעיל, קשורה להרחבת כלי דם מופחתת תלוית אינסולין של כלי הדם בכבד13. חוץ מזה, במהלך המחלה, כלי הדם בכבד הופך רגיש יותר vasoconstrictors, תורם עוד יותר לפגיעה בזרימת הדם בכבד ומוביל את הופעתה של מתח גזירה, אשר שניהם לגרום לשיבוש של microcirculation סינוסואידלי17. עובדות אלה מצביעות על כך שכלי הדם הם יעד מרכזי במחלות כבד. עם זאת, גורמים מגבילים המעכבים את האבחון והניטור בזמן של NAFLD/NASH, כמו גם את הפיתוח של טיפולים פוטנציאליים, הם הליקויים באפיון עקבי של מיקרו-סביבה בכבד ומבנה (מיקרו) כלי דם, כמו גם הניקוד של שלב המחלה באופן מרחבי-זמני ולא פולשני.
הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (CT) היא כיום שיטת ההדמיה הלא פולשנית הסטנדרטית לתיאור מדויק של מידע אנטומי בתוך אורגניזם חי. מיקרו-CT ו-MRI מייצגים שתי שיטות הדמיה משלימות שיכולות לכסות מגוון רחב של פתולוגיות ולספק רזולוציה ופירוט יוצאי דופן במבנים וברקמות המודמיים. מיקרו-CT, בפרט, הוא כלי מהיר ומדויק מאוד המשמש לעתים קרובות לחקר פתולוגיות כגון מחלות עצם ושינויים הקשורים לפני השטח של העצם18, הערכת התקדמות פיברוזיס ריאתי לאורך זמן19, אבחון סרטן ריאות והיערכות20, או אפילו בחינת פתולוגיות שיניים21, ללא כל הכנה מיוחדת (או הרס) של הדגימות להיות דמות.
טכנולוגיית ההדמיה של מיקרו-CT מבוססת על תכונות ההנחתה השונות של איברים שונים מבחינת האינטראקציה של קרני רנטגן עם חומר. איברים המציגים הבדלי הנחתה גבוהים בקרני רנטגן מתוארים בניגודיות גבוהה בתמונות CT (כלומר, הריאות נראות כהות והעצמות בהירות). איברים בעלי תכונות הנחתה דומות מאוד (רקמות רכות שונות), מאתגרים להבחנה בתמונות CT22. כדי להתמודד עם מגבלה זו, חומרי ניגוד מיוחדים המבוססים על יוד, זהב וביסמוט נחקרו בהרחבה לשימוש in vivo . חומרים אלה משנים את תכונות ההנחתה של הרקמות שבהן הם מצטברים, מנוקים לאט ממחזור הדם, ומאפשרים אופסיפיקציה אחידה ויציבה של מערכת כלי הדם כולה או רקמות נבחרות23.
באבחון אנושי, הדמיית CT וטכניקות דומות, כגון מקטע שומן צפיפות פרוטונים הנגזר מ- MRI, כבר נמצאות בשימוש לקביעת תכולת שומן בכבד24,25. בהקשר של NAFLD, ניגודיות גבוהה של רקמות רכות חיונית להבחנה מדויקת בין נגעים פתולוגיים או כלי דם קטנים. למטרה זו נעשה שימוש בחומרי ניגוד המספקים ניגודיות משופרת של מאפייני רקמת הכבד. כלים וחומרים כאלה מאפשרים לחקור מאפייני כבד מרובים וביטויים פתולוגיים אפשריים, כגון ארכיטקטורה וצפיפות של רשת כלי הדם, שקיעת שומנים/סטאטוזיס וספיגת רקמה תפקודית/העברת שומנים (כילומיקרון) בכבד. בנוסף, ניתן להעריך גם את נפח הדם היחסי בכבד ואת קוטר הווריד הפורטלי. בזמן סריקה קצר מאוד, כל הפרמטרים הללו מספקים מידע שונה ומשלים על הערכה והתקדמות של NAFLD, אשר יכול לשמש לפיתוח אבחנה לא פולשנית ומפורטת.
במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב לשימוש בטכניקות הדמיה מיקרו-CT חדשניות in vivo כשיטה לא פולשנית להערכת שלבי ההתקדמות של NAFLD. באמצעות פרוטוקול זה, ניתוח אורך של סטאטוזיס בכבד וספיגת רקמות תפקודיות, כמו גם הערכה של נפח הדם היחסי, קוטר הווריד הפורטלי וצפיפות רשת כלי הדם, ניתן לבצע וליישם במודלים עכבריים של מחלת כבד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>eXIA160</td>
			<td>Binitio Biomedical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.binitio.com/?Page=Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High fat diet with 60% of kilocalories from fat</td>
			<td>Research Diets, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fructose corn syrup&#160;</td>
			<td>Best flavors, CA</td>
			<td>hfcs-1gallon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrinorm ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal diet with 10% of kilocalories from fat&#160;</td>
			<td>Research Diets, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>D12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscover ExiTron nano 12000&#160;</td>
			<td>Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoQuant</td>
			<td>Invicro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CUBE&#160;</td>
			<td>Molecubes, Belgium</td>
			<td></td>
			<td>https://www.molecubes.com/systems/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques for assessing the progression of non-alcoholic fatty liver disease

מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) היא בעיה בריאותית עולמית הולכת וגדלה, וההשפעה של NAFLD מורכבת על ידי היעדר טיפולים יעילים כיום. גורמים מגבילים ניכרים המעכבים אבחון מדויק ועדכני (כולל דירוג) וניטור של NAFLD, כמו גם פיתוח טיפולים פוטנציאליים, הם הליקויים הנוכחיים באפיון מבנה המיקרו-סביבה בכבד ובניקוד שלב המחלה באופן מרחבי-זמני ולא פולשני. באמצעות מודל עכבר NAFLD המושרה על ידי דיאטה, חקרנו את השימוש בטכניקות הדמיה של טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת in vivo (CT) כשיטה לא פולשנית להערכת שלבי ההתקדמות של NAFLD, תוך התמקדות בעיקר ברשת כלי הדם בכבד בשל מעורבותה המשמעותית בחוסר ויסות בכבד הקשור ל- NAFLD. מתודולוגיית הדמיה זו מאפשרת ניתוח אורך של סטאטוזיס בכבד וספיגת רקמות תפקודיות, כמו גם הערכה של נפח הדם היחסי, קוטר הווריד הפורטלי וצפיפות רשת כלי הדם. הבנת ההתאמות של רשת כלי הדם בכבד במהלך התקדמות NAFLD וקורלציה זו עם דרכים אחרות לאפיון התקדמות המחלה (סטאטוזיס, דלקת, פיברוזיס) באמצעות השיטה המוצעת יכולה לסלול את הדרך לקראת הקמת גישות חדשות, יעילות יותר וניתנות לשחזור לחקר NAFLD בעכברים. פרוטוקול זה צפוי גם לשדרג את ערכם של מודלים פרה-קליניים בבעלי חיים לחקר פיתוח טיפולים חדשניים נגד התקדמות המחלה.

במחקר מייצג זה, הדמיית מיקרו-CT ללא כל חומר ניגוד הצביעה על אחוז גבוה יותר של שומן בכבד בעכברים עם NAFLD בהשוואה לבקרות (טבלה 2), ואישרה את הפתולוגיה. באמצעות חומר הניגוד ExiTron וארכיטקטורת רשת כלי הדם בכבד וניתוח הצפיפות שתוארו לעיל, צפיפות הנפח הכוללת של רשת כלי הדם בכבד נמצאה גבוהה יות?...

Watch this Scientific Journal Video about Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease at JoVE.com

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

באמצעות מודל עכבר של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) הנגרמת על ידי דיאטה, אנו מתארים את השימוש בטכניקות הדמיה מיקרו-ממוחשבות חדשניות in vivo כשיטה לא פולשנית להערכת שלבי ההתקדמות של NAFLD, תוך התמקדות בעיקר ברשת כלי הדם בכבד בשל מעורבותה המשמעותית בחוסר ויסות כבד הקשור ל- NAFLD.

רומן in vivo טכניקות הדמיה טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להערכת ההתקדמות של מחלת כבד שומני לא אלכוהולי

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective ...

אנו רואים פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מדגים שיטה לא פולשנית, פשוטה וקלה להעריך לאורך זמן אינדיקטורים מרכזיים לאבחון מחלת כבד. מתודולוגיית הדמיה זו מאפשרת ניתוח לאורך זמן של סטטוס הכבד, הערכת נפח הדם היחסי, קוטר הווריד הפורטלי, עוצמת רשת כלי הדם, כל הפרמטרים החשובים של פתולוגיית הכבד. הבנת ההתאמות של רשת כלי הדם בכבד במהלך התקדמות NAFLD וקורלציה זו עם סמנים ספציפיים כגון סטאטוזיס, דלקת ופיברוזיס יכולה לעזור לבסס תוכניות טיפול יעילות חדשות.טכניקה זו מסייעת בזיהוי סמנים כאלה וגם משדרגת את ערכם של עכברים במחקרים פרה-קליניים המתמקדים בפיתוח טיפולים חדשניים נגד התקדמות המחלה. כדי להתחיל, הניחו את בעל החיים המורדם בעריסה של סורק ה-CT. מרחו משחה אופתלמית, הדקו את חרוט האף והגדירו את פרמטרי הסריקה בסורק ה-CT.הכינו את צנתר ורידי הזנב והניחו את העכבר על מצע כדי לחמם את הזנב במים חמים. יש להחדיר את הצנתר לווריד הזנב ולתת את חומר הניגוד הראשון באמצעות זריקה, המבוצעת לאט ובאופן ידני למשך של דקה עד שלוש דקות. לאחר מכן, לרכוש סריקות כל הגוף והכבד בנקודות זמן שונות.בצע את אותו הליך לניהול סוכן הניגוד השני, 10 ימים לאחר הקריאה הסופית עם סוכן הניגוד הראשון. לאחר טעינת קובץ DICOM של סריקת קדם-ניגודיות, התאם את הניגודיות כדי לראות בבירור את רקמת הכבד, הטחול והשומן הלבן. תחת הכלי 3D ROI, בחר הוסף ROI כדי ליצור ROI מרובים לביצוע דגימה באזורים שבהם רקמת הכבד, הטחול והשומן נראים צלולים ללא כלי דם ושומן נראים לעין.במצב צביעה, בחרו 'כדור'. סמן את התיבה דו-ממדית בלבד ובחר קוטר של שמונה פיקסלים מהתפריט הנפתח כדי לצבוע החזר השקעה על נתונים. מתוך תכונת הרחבת השחיקה, בחר מינוס שחיקה אחת.בצע דגימה על ידי פילוח ROI דו-ממדי על תחומי העניין באמצעות הכלי Sphere במישור הרוחבי. עבור אל ניווט ובחר הצג טבלה כדי להציג את טבלת הכימות המכילה את ערכי יחידות השדה המחושבים עבור כל החזר השקעה. לאחר מכן, חבר את הערכים למשוואה זו.חשב את אחוז השומן בכבד. טען את קובץ DICOM של סריקת eXIA, והתאם את הניגודיות כדי לראות בבירור את הכבד, הטחול והחדר השמאלי. תחת הכלי החזר השקעה תלת-ממדי, בחר הוסף החזר השקעה כדי לפלח ROIS מרובים עבור הכבד.במצב צביעה, בחרו 'דו-ממד בלבד' ובחרו 'כדור' הוסף קוטר של שמונה פיקסלים כדי לצבוע החזר השקעה על נתונים. מתוך תכונת הרחבת השחיקה, בחר מינוס שחיקה אחת. ציין שם וצבע לכל החזר השקעה ובחר הצג טבלה כדי להציג את טבלת הכימות המכילה את ערכי HU המחושבים עבור כל החזר השקעה.לאחר חזרה על שלבים אלה לקבלת איבר PV t0, הכנס את הערכים למשוואה המוצגת על המסך כדי לחלץ את אחוז הניגודיות המתאים להעברת השומנים בספיגת הרקמה הפונקציונלית. טען את קובץ ה-DICOM של סריקת ExiTron וכוונן את הניגודיות כדי לראות בבירור את רשת כלי הדם בכבד. בחר הוסף החזר ROI כדי ליצור החזר השקעה תלת-ממדי עבור הכבד.הגדירו את החזר ההשקעה על הכבד על ידי סימון האזור הרצוי. לאחר מכן בחר את החזר ההשקעה ברקע מתוך בורר החזר ההשקעה. לחץ על בצע חיתוך סמל, כדי להסיר את הרקע מבלי לשנות את החזר ההשקעה על הכבד.הפעל את מציג ההקרנה בעוצמה מרבית. לאחר מכן, תחת אלגוריתמי סגמנטציה המסומנים על ידי סמל שרביט הקסם, בחר סף מחובר כדי לפלח מחדש את החזר ההשקעה על הכבד. הגדר את ערכי הסף על ידי הזנת ערכי המינימום והמקסימום וקבל את רשת כלי הדם.שוב, להסיר את רקמת הכבד רקע כדי לקבל ייצוג ברור של רשת כלי הדם. לאחר טעינת קובץ DICOM של סריקת ExiTron, התאם את הניגודיות כדי לראות בבירור את הכבד, הטחול והחדר השמאלי. בחר הוסף ROI ומקטעים ROI עבור הכבד וכלי דם גדול.הגדר את שכבות הסגמנטציה כדי ליצור ROI דו-ממדי עבור כל רקמה. חזור על השלבים עבור קובץ DICOM לפני הניגודיות כדי לקבל את הבהירות הממוצעת של הכבד לפני הזרקת חומר הניגוד. עבור קוטר הווריד הפורטלי, אתר את המישורים הרוחביים של שלוש עד ארבע פרוסות מעל צומת הוורידים המזנטריים והספלניים העליונים, ולאחר מכן עבור לניווט ואחריו תברואה מרחק, בחר קו כדי למדוד את המרחק המדויק בין שתי נקודות.ערכי הניגודיות הממוצעים מוצגים על-ידי נתונים מקובצים אלה. בדיקת ספיגת הרקמה התפקודית הצביעה על הצטברות גבוהה יותר וסילוק איטי יותר של חומר הניגוד eXIA בעכברים עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולית בהשוואה לבקרות בריאות. תוצאות מייצגות אלה מצביעות על הבדלים באחוז השומן בכבד, נפח רשת כלי הדם בכבד, קוטר הווריד הפורטלי ונפח הדם היחסי בכבד בין עכברים עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולית לבין קבוצת ביקורת בריאה.הדמיית מיקרו-CT ללא כל חומר ניגוד, הצביעה על אחוז גבוה יותר של שומן בכבד בעכברים עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולית בהשוואה לקבוצת הביקורת. באופן דומה, נפח גבוה יותר של רשת כלי הדם בכבד, נפח הדם היחסי בכבד וקוטר וריד פורטלי גדול יותר נמצאו בעכברים עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי בהשוואה לקבוצת ביקורת בריאה. הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון טכניקה זו היא להיות כל הזמן מדויק על האזור האנטומי שנבחר.בחירת נקודה אנטומית לא נכונה יכולה להוביל לתוצאות לא מדויקות. על ידי ביצוע מתודולוגיה ופרוטוקול זה, ניתן לבצע הערכה מדויקת של היערכות מחלות כבד. לפיכך, הוא יכול לשמש פלטפורמה מוגדרת להערכת יעילות תרופות חדשות.טכניקה זו סוללת את הדרך לדרכים חדשות, קלות ומדויקות יותר להעריך פתולוגיות כבד וליזום בדיקות פיתוח תרופות רלוונטיות.