La Figura 1 è stata creata con BioRender.com. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Ellenica per la Ricerca e l'Innovazione (#3222 ad A.C.). Anna Hadjihambi è finanziata dal Roger Williams Institute of Hepatology, Foundation for Liver Research.

Tutte le procedure sono state eseguite dal personale BIOEMTECH in conformità con le normative europee e nazionali in materia di benessere e sono state approvate dalle autorità nazionali (numero di licenza EL 25 BIOexp 45/PN 49553 21/01/20). Tutti gli esperimenti sono stati progettati e riportati in conformità alle linee guida ARRIVE26. I topi sono stati acquistati dall'Istituto Ellenico Pasteur di Atene, in Grecia.
NOTA: Gli animali sono stati alloggiati in gruppo in...

L'attuale metodo raccomandato per la diagnosi e la stadiazione della NAFLD nell'uomo è la biopsia epatica, che comporta il rischio di complessità emorragiche, nonché di imprecisioni di campionamento40. Al contrario, nei modelli animali, tale diagnosi viene eseguita mediante istologia post-mortem, anche se sono ora disponibili protocolli per la biopsia epatica sopravvissuta e sono raccomandati quando il disegno dellostudio lo consente. L'uso dell'istologia post-mortem sig...

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è una malattia metabolica che colpisce circa il 25% della popolazione e il >80% delle persone patologicamente obese1. Si stima che un terzo di questi individui progredisca verso la steatoepatite non alcolica (NASH), che è caratterizzata da steatosi epatica, infiammazione e fibrosi2. La NASH è uno stadio della malattia con un rischio significativamente più elevato di sviluppo di cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC)3,4. Per questo motivo, la NASH è attualmente la seconda causa più comune di trapianto di fegato e si prevede che presto diventerà anche il più importante predittore di trapianto di fegato 5,6,7. Nonostante la sua prevalenza e gravità, non è disponibile alcuna terapia specifica per la NAFLD e i trattamenti esistenti mirano solo ad affrontare le patologie associate alla malattia come l'insulino-resistenza e l'iperlipidemia 5,6.
Negli ultimi anni, il ruolo fisiopatologico e gli adattamenti dell'endotelio e, in generale, della rete vascolare dei tessuti metabolici, come il tessuto adiposo e il fegato, stanno acquisendo maggiore importanza nella ricerca, soprattutto durante l'obesità e la disregolazione metabolica 7,8. L'endotelio è un monostrato cellulare che riveste internamente la rete vascolare, fungendo da barriera funzionale e strutturale. Contribuisce inoltre a vari processi fisiologici e patologici, come la trombosi, il trasporto di metaboliti, l'infiammazione e l'angiogenesi 9,10. Nel caso del fegato, la rete vascolare è, tra le altre caratteristiche, caratterizzata dalla presenza di cellule altamente specializzate, definite cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSEC). Queste cellule sono prive di una membrana basale e hanno più fenestrae, consentendo un più facile trasferimento di substrati tra il sangue e il parenchima epatico. A causa della loro posizione anatomica e delle loro caratteristiche distintive, gli LSEC hanno probabilmente un ruolo cruciale nei processi fisiopatologici del fegato, compreso lo sviluppo dell'infiammazione e della fibrosi epatica durante la NAFLD/NASH. Infatti, gli adattamenti patologici, molecolari e cellulari che le LSEC subiscono nel corso della NAFLD contribuiscono alla progressione della malattia11. In particolare, l'angiogenesi epatica LSEC-dipendente che avviene durante la NAFLD è significativamente associata allo sviluppo dell'infiammazione e alla progressione della malattia verso la NASH o addirittura l'HCC12. Inoltre, la NAFLD precoce correlata all'obesità è caratterizzata dallo sviluppo di insulino-resistenza nelle LSEC, che precede lo sviluppo di infiammazione epatica o altri segni avanzati di NAFLD13.
Inoltre, le LSEC sono recentemente emerse come regolatori centrali del flusso sanguigno epatico e degli adattamenti della rete vascolare durante le malattie epatiche di diverse eziologie14,15. Infatti, la malattia epatica cronica è caratterizzata da una prominente vasocostrizione intraepatica e da una maggiore resistenza al flusso sanguigno, che contribuiscono allo sviluppo dell'ipertensione portale16. Nel caso della NAFLD, diversi meccanismi correlati alla LSEC contribuiscono a questo fenomeno. Ad esempio, l'insulino-resistenza specifica per LSEC, come accennato in precedenza, è associata a una ridotta vasodilatazione insulino-dipendente della vascolarizzazione epatica13. Inoltre, nel corso della malattia, la vascolarizzazione del fegato diventa più sensibile ai vasocostrittori, contribuendo ulteriormente alla compromissione del flusso sanguigno epatico e portando all'insorgenza di stress da taglio, che si traducono entrambi in un'interruzione della microcircolazione sinusoidale17. Questi fatti suggeriscono che la vascolarizzazione è un bersaglio chiave nelle malattie del fegato. Tuttavia, i fattori limitanti che ostacolano la diagnosi e il monitoraggio tempestivi della NAFLD/NASH, nonché lo sviluppo di potenziali terapie, sono le inadeguatezze nella caratterizzazione coerente del microambiente epatico e della struttura (micro)vascolare, nonché il punteggio dello stadio della malattia in modo spazio-temporale e non invasivo.
L'imaging con tomografia microcomputerizzata (TC) è attualmente il metodo di imaging non invasivo gold standard per rappresentare accuratamente le informazioni anatomiche all'interno di un organismo vivente. La micro-TC e la risonanza magnetica rappresentano due metodi di imaging complementari in grado di coprire una vasta gamma di patologie e fornire una risoluzione e un dettaglio eccezionali nelle strutture e nei tessuti ripresi. La micro-TC, in particolare, è uno strumento molto veloce e preciso che viene spesso utilizzato per studiare patologie come le malattie ossee e le alterazioni della superficie ossea associate18, valutare la progressione della fibrosi polmonare nel tempo19, diagnosticare il cancro del polmone e la sua stadiazione20, o ancora esaminare le patologie dentali21, senza alcuna particolare preparazione (o distruzione) dei campioni sottoposti a imaging.
La tecnologia di imaging della micro-TC si basa sulle diverse proprietà di attenuazione dei vari organi in termini di interazione dei raggi X con la materia. Gli organi che presentano elevate differenze di attenuazione dei raggi X sono rappresentati con un contrasto elevato nelle immagini TC (ad esempio, i polmoni appaiono scuri e le ossa chiare). Gli organi che presentano proprietà di attenuazione molto simili (tessuti molli diversi) sono difficili da distinguere nelle immagini TC22. Per affrontare questa limitazione, agenti di contrasto specializzati a base di iodio, oro e bismuto sono stati ampiamente studiati per l'uso in vivo . Questi agenti alterano le proprietà di attenuazione dei tessuti in cui si accumulano, vengono eliminati lentamente dalla circolazione e consentono l'opacizzazione uniforme e stabile dell'intero sistema vascolare o dei tessuti scelti23.
Nella diagnostica umana, l'imaging TC e tecniche analoghe, come la frazione grassa a densità protonica derivata dalla risonanza magnetica, sono già in uso per la determinazione del contenuto di grasso epatico24,25. Nel contesto della NAFLD, un elevato contrasto dei tessuti molli è essenziale per distinguere con precisione le lesioni patologiche o i piccoli vasi. A tale scopo, vengono utilizzati agenti di contrasto che forniscono un maggiore contrasto delle caratteristiche del tessuto epatico. Tali strumenti e materiali consentono lo studio di molteplici caratteristiche epatiche e di possibili espressioni patologiche, come l'architettura e la densità della rete vascolare, la deposizione/steatosi lipidica e l'assorbimento funzionale del tessuto/trasferimento di lipidi (chilomicroni) nel fegato. Inoltre, è possibile valutare anche il volume ematico relativo epatico e il diametro della vena porta. In un tempo di scansione molto breve, tutti questi parametri forniscono informazioni diverse e complementari sulla valutazione e la progressione della NAFLD, che possono essere utilizzate per sviluppare una diagnosi non invasiva e dettagliata.
In questo articolo, forniamo un protocollo passo-passo per l'uso di nuove tecniche di imaging micro-CT in vivo come metodo non invasivo per valutare le fasi di progressione della NAFLD. Utilizzando questo protocollo, l'analisi longitudinale della steatosi epatica e dell'assorbimento funzionale del tessuto, nonché la valutazione del volume ematico relativo, del diametro della vena porta e della densità della rete vascolare, possono essere eseguite e applicate in modelli murini di malattia epatica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
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			<td>Binitio Biomedical, Inc.</td>
			<td></td>
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		</tr>
		<tr>
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			<td>Research Diets, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td>hfcs-1gallon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrinorm ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal diet with 10% of kilocalories from fat&#160;</td>
			<td>Research Diets, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>D12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CUBE&#160;</td>
			<td>Molecubes, Belgium</td>
			<td></td>
			<td>https://www.molecubes.com/systems/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques for assessing the progression of non-alcoholic fatty liver disease

La steatosi epatica non alcolica (NAFLD) è un problema di salute globale in crescita e l'impatto della NAFLD è aggravato dall'attuale mancanza di trattamenti efficaci. Considerevoli fattori limitanti che ostacolano la diagnosi tempestiva e accurata (incluso il grading) e il monitoraggio della NAFLD, nonché lo sviluppo di potenziali terapie, sono le attuali inadeguatezze nella caratterizzazione della struttura del microambiente epatico e nella valutazione dello stadio della malattia in modo spazio-temporale e non invasivo. Utilizzando un modello murino di NAFLD indotto dalla dieta, abbiamo studiato l'uso di tecniche di imaging con micro-tomografia computerizzata (TC) in vivo come metodo non invasivo per valutare le fasi di progressione della NAFLD, concentrandoci prevalentemente sulla rete vascolare epatica a causa del suo significativo coinvolgimento nella disregolazione epatica correlata alla NAFLD. Questa metodologia di imaging consente l'analisi longitudinale della steatosi epatica e dell'assorbimento funzionale del tessuto, nonché la valutazione del volume ematico relativo, del diametro della vena porta e della densità della rete vascolare. Comprendere gli adattamenti della rete vascolare epatica durante la progressione della NAFLD e correlarli con altri modi di caratterizzare la progressione della malattia (steatosi, infiammazione, fibrosi) utilizzando il metodo proposto può aprire la strada alla creazione di nuovi approcci più efficienti e riproducibili per la ricerca sulla NAFLD nei topi. Si prevede inoltre che questo protocollo migliorerà il valore dei modelli animali preclinici per lo studio dello sviluppo di nuove terapie contro la progressione della malattia.

In questo studio rappresentativo, l'imaging micro-CT senza alcun mezzo di contrasto ha indicato una percentuale maggiore di grasso epatico nei topi con NAFLD rispetto ai controlli (Tabella 2), confermando la patologia. Utilizzando l'agente di contrasto ExiTron e l'architettura della rete vascolare epatica e l'analisi della densità sopra descritte, la densità volumetrica totale della rete vascolare epatica è risultata più elevata nei topi con NAFLD rispetto ai controlli sani (Figu...

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Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Utilizzando un modello murino di steatosi epatica non alcolica (NAFLD) indotto dalla dieta, descriviamo l'uso di nuove tecniche di imaging di tomografia microcomputerizzata in vivo come metodo non invasivo per valutare le fasi di progressione della NAFLD, concentrandoci prevalentemente sulla rete vascolare epatica a causa del suo significativo coinvolgimento nella disregolazione epatica correlata alla NAFLD.

Nuove tecniche di imaging con tomografia microcomputerizzata in vivo per valutare la progressione della steatosi epatica non alcolica

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective ...

Riteniamo che questo protocollo sia significativo perché dimostra un metodo non invasivo, semplice e facile per valutare nel tempo gli indicatori chiave per la diagnosi di malattia epatica. Questa metodologia di imaging consente l'analisi nel tempo degli stati epatici, la valutazione del volume ematico relativo, il diametro della vena porta, l'intensità della rete vascolare, tutti parametri importanti della patologia epatica. Comprendere gli adattamenti della rete vascolare epatica durante la progressione della NAFLD e correlarli con marcatori specifici come la steatosi, l'infiammazione e la fibrosi può aiutare a stabilire nuovi schemi terapeutici efficienti.Questa tecnica aiuta nell'identificazione di tali marcatori e migliora anche il valore dei topi negli studi preclinici incentrati sullo sviluppo di nuove terapie contro la progressione della malattia. Per iniziare, posizionare l'animale anestetizzato nella culla dello scanner CT. Applicare un unguento oftalmico, fissare l'ogiva nasale e impostare i parametri di scansione sullo scanner CT.Preparare il catetere della vena caudale e posizionare il topo su un letto per riscaldare la coda in acqua tiepida. Inserire il catetere nella vena caudale e somministrare il primo mezzo di contrasto tramite iniezione, eseguita lentamente e manualmente con una durata da uno a tre minuti. Quindi, acquisisci scansioni di tutto il corpo e del fegato in diversi momenti.Seguire la stessa procedura per la somministrazione del secondo mezzo di contrasto, 10 giorni dopo la lettura finale con il primo mezzo di contrasto. Dopo aver caricato il file DICOM della scansione pre-contrasto, regolare il contrasto per vedere chiaramente il fegato, la milza e il tessuto adiposo bianco. Nello strumento ROI 3D, seleziona aggiungi ROI per generare più ROI per eseguire il campionamento nelle aree in cui il fegato, la milza e il tessuto adiposo appaiono chiari senza vasi sanguigni e grasso apparenti.In modalità disegno, scegli Sfera. Seleziona la casella Solo 2D e seleziona un diametro di otto pixel dal menu a discesa per dipingere il ROI sui dati. Dalla funzione di dilatazione dell'erosione, scegliere meno un'erosione.Eseguire il campionamento segmentando le ROI 2D sulle aree di interesse utilizzando lo strumento Sfera sul piano trasversale. Vai alla navigazione e seleziona mostra tabella per visualizzare la tabella di quantificazione contenente i valori dell'unità di campo dei segugi calcolati per ogni ROI. Quindi, inserisci i valori in questa equazione.Calcola la percentuale di grasso del fegato. Caricare il file DICOM di scansione eXIA e regolare il contrasto per vedere chiaramente il fegato, la milza e il ventricolo sinistro. Sotto lo strumento ROI 3D, seleziona aggiungi ROI per segmentare più ROI per il fegato.In modalità disegno, seleziona Solo 2D e scegli Sfera aggiungi un diametro di otto pixel per dipingere il ROI sui dati. Dalla funzione di dilatazione dell'erosione, scegliere meno un'erosione. Specificare un nome e un colore per ogni ROI e selezionare mostra tabella per visualizzare la tabella di quantificazione contenente i valori HU calcolati per ogni ROI.Dopo aver ripetuto questi passaggi per ottenere l'organo PV t0, inserire i valori nell'equazione mostrata a video per estrarre il contrasto percentuale corrispondente al trasferimento lipidico funzionale di captazione tissutale. Caricare il file DICOM di scansione ExiTron e regolare il contrasto per vedere chiaramente la rete vascolare epatica. Seleziona Aggiungi ROI per generare un ROI 3D per il fegato.Definisci il ROI del fegato segnando l'area desiderata. Quindi scegli il ROI in background dal selettore ROI. Fare clic sull'icona Esegui taglio, per rimuovere lo sfondo senza modificare il ROI del fegato.Attivare il visualizzatore di proiezione di massima intensità. Quindi, sotto gli algoritmi di segmentazione indicati dall'icona della bacchetta magica, seleziona la soglia connessa per risegmentare il ROI del fegato. Impostare le soglie inserendo i valori minimo e massimo e ottenere la rete vascolare.Anche in questo caso, rimuovere il tessuto epatico di fondo per ottenere una chiara rappresentazione della rete vascolare. Dopo aver caricato il file DICOM di scansione ExiTron, regolare il contrasto per vedere chiaramente il fegato, la milza e il ventricolo sinistro. Seleziona aggiungi ROI e segmenta ROI per il fegato e un vaso sanguigno di grandi dimensioni.Definisci i livelli di segmentazione per generare ROI 2D per ogni tessuto. Ripetere i passaggi per il file DICOM pre-contrasto per ottenere la luminosità media del fegato prima dell'iniezione del mezzo di contrasto. Per il diametro della vena porta, individuare i piani trasversali di tre o quattro fette sopra la giunzione delle vene mesenterica e splenica superiore, quindi passare alla navigazione seguita dalla sanificazione della distanza, selezionare la linea per misurare la distanza esatta tra due punti.I valori medi di contrasto sono presentati da questi dati raggruppati. Il test di captazione funzionale del tessuto ha indicato un maggiore accumulo e una clearance più lenta dell'agente di contrasto eXIA nei topi con steatosi epatica non alcolica rispetto ai controlli sani. Questi risultati rappresentativi indicano le differenze nella percentuale di grasso epatico, nel volume della rete vascolare epatica, nel diametro della vena porta e nel volume ematico relativo epatico tra i topi con steatosi epatica non alcolica e i controlli sani.L'imaging micro-CT senza alcun mezzo di contrasto, ha indicato una percentuale più elevata di grasso epatico nei topi con steatosi epatica non alcolica rispetto ai controlli. Allo stesso modo, un volume di rete vascolare epatica più elevato, un volume di sangue relativo epatico e un diametro della vena porta più grande sono stati trovati nei topi con steatosi epatica non alcolica rispetto ai controlli sani. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa tecnica è di essere costantemente precisi sulla regione anatomica selezionata.La scelta del punto anatomico sbagliato può portare a risultati non accurati. Seguendo questa metodologia e protocollo, è possibile eseguire una valutazione accurata della stadiazione della malattia epatica. Pertanto, può fungere da piattaforma specifica per valutare l'efficacia di nuovi farmaci.Questa tecnica apre la strada a modi nuovi, più semplici e più accurati per valutare le patologie epatiche e avviare saggi di sviluppo di farmaci pertinenti.

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Nuove tecniche di imaging con tomografia microcomputerizzata in vivo per valutare la progressione della steatosi epatica non alcolica

Abstract