Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma Hellenic Foundation for Research and Innovation (#3222 - A.C.) tarafından desteklenmiştir. Anna Hadjihambi, Roger Williams Hepatoloji Enstitüsü, Karaciğer Araştırmaları Vakfı tarafından finanse edilmektedir.

Tüm prosedürler BIOEMTECH personeli tarafından Avrupa ve ulusal refah yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiş ve ulusal makamlar tarafından onaylanmıştır (lisans numarası EL 25 BIOexp 45 / PN 49553 21/01/20). Tüm deneyler ARRIVE yönergelerine26 bağlı kalınarak tasarlanmış ve raporlanmıştır. Fareler, Yunanistan'ın Atina kentindeki Hellenic Pasteur Enstitüsü'nden satın alındı.
NOT: Hayvanlar, 20-22 °C'de, %50-60 bağıl nem ve 12 saatl...

İnsanlarda NAFLD tanısı ve evrelemesi için önerilen güncel yöntem, örnekleme yanlışlıklarının yanı sıra kanama karmaşıklığı riskini de barındıran karaciğer biyopsisidir40. Aksine, hayvan modellerinde, bu tür bir tanı ölüm sonrası histoloji ile gerçekleştirilir, ancak hayatta kalabilir karaciğer biyopsisi için protokoller artık mevcuttur ve çalışma tasarımı izin verdiğinde önerilir41. Ölüm sonrası histolojinin kullanılması, bu has...

Alkole bağlı olmayan yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), toplumun yaklaşık %25'ini ve morbid obez kişilerin %>80'ini etkileyen metabolik bir hastalıktır1. Bu bireylerin yaklaşık üçte biri, hepatik steatoz, inflamasyon ve fibroz2 ile karakterize alkolsüz steatohepatit (NASH) hastalığına ilerler. NASH, siroz ve hepatosellüler karsinom (HCC) gelişimi için önemli ölçüde daha yüksek risk taşıyan bir hastalık evresidir3,4. Bu nedenle, NASH şu anda karaciğer transplantasyonunun en sık görülen ikinci nedenidir ve yakın zamanda karaciğer transplantasyonunun en önemli belirleyicisi haline gelmesi beklenmektedir 5,6,7. Prevalansına ve ciddiyetine rağmen, NAFLD için hastalığa özgü bir tedavi mevcut değildir ve mevcut tedaviler sadece insülin direnci ve hiperlipidemi gibi hastalıkla ilişkili patolojilerle mücadele etmeyi amaçlamaktadır 5,6.
Son yıllarda, endotelin ve genel olarak yağ dokusu ve karaciğer gibi metabolik dokuların vasküler ağının patofizyolojik rolü ve adaptasyonları, özellikle obezite ve metabolik düzensizlik sırasında araştırmalarda daha fazla önem kazanmaktadır 7,8. Endotel, vasküler ağı dahili olarak kaplayan, fonksiyonel ve yapısal bir bariyer görevi gören hücresel bir tek tabakadır. Ayrıca tromboz, metabolit taşınması, inflamasyon ve anjiyogenez gibi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlere de katkıda bulunur 9,10. Karaciğer durumunda, vasküler ağ, diğer özelliklerin yanı sıra, karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC'ler) olarak tanımlanan oldukça özelleşmiş hücrelerin varlığı ile karakterize edilir. Bu hücreler bir bazal membrandan yoksundur ve kan ve karaciğer parankimi arasında substratların daha kolay transferine izin veren çoklu fenestralara sahiptir. Ayırt edici anatomik konumları ve özellikleri nedeniyle, LSEC'ler, NAFLD/NASH sırasında karaciğer iltihabı ve fibroz gelişimi de dahil olmak üzere karaciğerin patofizyolojik süreçlerinde muhtemelen çok önemli bir role sahiptir. Gerçekten de, LSEC'lerin NAFLD seyri sırasında maruz kaldığı patolojik, moleküler ve hücresel adaptasyonlar hastalığın ilerlemesine katkıda bulunur11. Spesifik olarak, NAFLD sırasında meydana gelen LSEC'ye bağlı hepatik anjiyogenez, inflamasyon gelişimi ve hastalığın NASH'e ve hatta HCC12'ye ilerlemesi ile önemli ölçüde ilişkilidir. Ayrıca, obezite ile ilişkili erken NAFLD, hepatik inflamasyon veya diğer ileri NAFLD belirtilerinin gelişmesinden önce gelen LSEC'lerde insülin direncinin gelişmesi ile karakterizedir13.
Ek olarak, LSEC'ler son zamanlarda çeşitli etiyolojilerin karaciğer hastalığı sırasında hepatik kan akışının ve vasküler ağ adaptasyonlarının merkezi düzenleyicileri olarak ortaya çıkmıştır14,15. Gerçekten de, kronik karaciğer hastalığı, portal hipertansiyonun gelişimine katkıda bulunan belirgin intra-hepatik vazokonstriksiyon ve kan akışına karşı artan direnç ile karakterizedir16. NAFLD söz konusu olduğunda, LSEC ile ilgili birkaç mekanizma bu fenomene katkıda bulunur. Örneğin, yukarıda bahsedildiği gibi LSEC'ye özgü insülin direnci, hepatik vaskülatürün insüline bağlı vazodilatasyonunun azalmasıyla ilişkilidir13. Ayrıca, hastalığın seyri boyunca, karaciğer damar sistemi vazokonstriktörlere karşı daha duyarlı hale gelir, bu da hepatik kan akışının bozulmasına katkıda bulunur ve her ikisi de sinüzoidal mikrosirkülasyonun bozulmasına neden olan kayma stresinin ortaya çıkmasına neden olur17. Bu gerçekler, damar sisteminin karaciğer hastalığında önemli bir hedef olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, NAFLD/NASH'ın zamanında tanı ve izlenmesini ve potansiyel tedavilerin geliştirilmesini engelleyen sınırlayıcı faktörler, hepatik mikroçevrenin ve (mikro)vasküler yapının tutarlı karakterizasyonundaki yetersizliklerin yanı sıra hastalık evresinin uzay-zamansal ve non-invaziv bir şekilde skorlanmasıdır.
Mikro bilgisayarlı tomografi (BT) görüntüleme, canlı bir organizmadaki anatomik bilgileri doğru bir şekilde tasvir etmek için şu anda altın standart non-invaziv görüntüleme yöntemidir. Mikro-BT ve MRG, çok çeşitli patolojileri kapsayabilen ve görüntülenen yapılarda ve dokularda olağanüstü çözünürlük ve ayrıntı sağlayabilen iki tamamlayıcı görüntüleme yöntemini temsil eder. Özellikle mikro-BT, kemik hastalıkları ve ilişkili kemik yüzeyi değişiklikleri18 gibi patolojileri incelemek, pulmoner fibrozun zaman içindeki ilerlemesini değerlendirmek19, akciğer kanserini ve evrelemesiniteşhis etmek 20 ve hatta diş patolojileriniincelemek 21 için sıklıkla kullanılan çok hızlı ve doğru bir araçtır.
Mikro-BT'nin görüntüleme teknolojisi, X-ışınlarının madde ile etkileşimi açısından çeşitli organların farklı zayıflama özelliklerine dayanmaktadır. Yüksek X-ışını zayıflama farklılıkları gösteren organlar, BT görüntülerinde yüksek kontrastla gösterilir (yani, akciğerler karanlık ve kemikler açık görünür). Çok benzer zayıflama özellikleri gösteren organların (farklı yumuşak dokular) BT görüntülerinde ayırt edilmesi zordur22. Bu sınırlamayı ele almak için, iyot, altın ve bizmut bazlı özel kontrast maddeler, in vivo kullanım için kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. Bu ajanlar, içinde biriktikleri dokuların zayıflama özelliklerini değiştirir, dolaşımdan yavaşça temizlenir ve tüm vasküler sistemin veya seçilen dokuların düzgün ve stabil opaklaşmasını sağlar23.
İnsan teşhisinde, BT görüntüleme ve MRI'dan türetilen proton yoğunluğu yağ fraksiyonu gibi karşılaştırılabilir teknikler, hepatik yağ içeriğinin belirlenmesi için halihazırda kullanılmaktadır24,25. NAFLD bağlamında, patolojik lezyonları veya küçük damarları doğru bir şekilde ayırt etmek için yüksek yumuşak doku kontrastı gereklidir. Bu amaçla karaciğer dokusu karakteristiklerinin arttırılmasını sağlayan kontrast maddeler kullanılır. Bu tür araçlar ve materyaller, vasküler ağın mimarisi ve yoğunluğu, lipid birikimi/steatozu ve karaciğerde fonksiyonel doku alımı/lipid (şilomikron) transferi gibi çoklu karaciğer özelliklerinin ve olası patoloji ifadelerinin incelenmesine izin verir. Ek olarak, hepatik bağıl kan hacmi ve portal ven çapı da değerlendirilebilir. Çok kısa bir tarama süresinde, tüm bu parametreler NAFLD'nin değerlendirilmesi ve ilerlemesi hakkında farklı ve tamamlayıcı bilgiler sağlar, bu da non-invaziv ve ayrıntılı bir tanı geliştirmek için kullanılabilir.
Bu makalede, NAFLD'nin progresyon aşamalarını değerlendirmek için non-invaziv bir yöntem olarak yeni in vivo mikro-BT görüntüleme tekniklerinin kullanımı için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol kullanılarak, karaciğer yağlanması ve fonksiyonel doku alımının uzunlamasına analizinin yanı sıra nispi kan hacminin, portal ven çapının ve vasküler ağın yoğunluğunun değerlendirilmesi, karaciğer hastalığının fare modellerinde gerçekleştirilebilir ve uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>eXIA160</td>
			<td>Binitio Biomedical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>https://www.binitio.com/?Page=Products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High fat diet with 60% of kilocalories from fat</td>
			<td>Research Diets, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fructose corn syrup&#160;</td>
			<td>Best flavors, CA</td>
			<td>hfcs-1gallon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lacrinorm ophthalmic ointment&#160;</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal diet with 10% of kilocalories from fat&#160;</td>
			<td>Research Diets, New Brunswick, NJ, USA</td>
			<td>D12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viscover ExiTron nano 12000&#160;</td>
			<td>Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Germany</td>
			<td>130-095-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VivoQuant</td>
			<td>Invicro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-CUBE&#160;</td>
			<td>Molecubes, Belgium</td>
			<td></td>
			<td>https://www.molecubes.com/systems/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques for assessing the progression of non-alcoholic fatty liver disease

Alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) büyüyen bir küresel sağlık sorunudur ve NAFLD'nin etkisi, mevcut etkili tedavilerin eksikliği ile birleşmektedir. NAFLD'nin zamanında ve doğru tanısını (derecelendirme dahil) ve izlenmesini ve potansiyel tedavilerin geliştirilmesini engelleyen önemli sınırlayıcı faktörler, hepatik mikroçevre yapısının karakterizasyonundaki mevcut yetersizlikler ve hastalık evresinin uzay-zamansal ve non-invaziv bir şekilde skorlanmasıdır. Diyete bağlı bir NAFLD fare modeli kullanarak, NAFLD'nin progresyon aşamalarını değerlendirmek için invaziv olmayan bir yöntem olarak in vivo mikro-bilgisayarlı tomografi (BT) görüntüleme tekniklerinin kullanımını araştırdık ve ağırlıklı olarak hepatik vasküler ağa odaklandık. Bu görüntüleme metodolojisi, karaciğer yağlanması ve fonksiyonel doku alımının uzunlamasına analizinin yanı sıra nispi kan hacminin, portal ven çapının ve vasküler ağın yoğunluğunun değerlendirilmesine izin verir. NAFLD progresyonu sırasında hepatik vasküler ağın adaptasyonlarını anlamak ve bunu, önerilen yöntemi kullanarak hastalığın ilerlemesini (steatoz, inflamasyon, fibrozis) karakterize etmenin diğer yollarıyla ilişkilendirmek, farelerde NAFLD araştırmaları için yeni, daha verimli ve tekrarlanabilir yaklaşımların oluşturulmasına giden yolu açabilir. Bu protokolün ayrıca, hastalığın ilerlemesine karşı yeni tedavilerin geliştirilmesini araştırmak için klinik öncesi hayvan modellerinin değerini yükseltmesi beklenmektedir.

Bu temsili çalışmada, herhangi bir kontrast madde içermeyen mikro-BT görüntüleme, NAFLD'li farelerde kontrollere kıyasla daha yüksek bir karaciğer yağı yüzdesi gösterdi (Tablo 2), bu da patolojiyi doğruladı. ExiTron kontrast maddesi ve yukarıda açıklanan hepatik vasküler ağ mimarisi ve yoğunluk analizi kullanılarak, hepatik vasküler ağın toplam hacim yoğunluğunun NAFLD'li farelerde sağlıklı kontrollere kıyasla daha yüksek olduğu bulunmuştur (Şekil ...

Watch this Scientific Journal Video about Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease at JoVE.com

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Diyete bağlı alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) fare modeli kullanarak, NAFLD'nin progresyon aşamalarını değerlendirmek için non-invaziv bir yöntem olarak yeni in vivo mikro-bilgisayarlı tomografi görüntüleme tekniklerinin kullanımını, ağırlıklı olarak hepatik vasküler ağa odaklanarak tanımladık.

Alkole Bağlı Olmayan Yağlı Karaciğer Hastalığının Progresyonunu Değerlendirmek İçin Yeni In Vivo Mikrobilgisayarlı Tomografi Görüntüleme Teknikleri

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective ...

Bu protokolün önemli olduğunu düşünüyoruz çünkü karaciğer hastalığının teşhisi için zaman içinde anahtar göstergeleri değerlendirmek için invaziv olmayan, basit ve kolay bir yöntem gösteriyor. Bu görüntüleme metodolojisi, karaciğer durumlarının zaman içinde analizine, bağıl kan hacminin, portal ven çapının, vasküler ağın yoğunluğunun, karaciğer patolojisinin tüm önemli parametrelerinin değerlendirilmesine izin verir. NAFLD progresyonu sırasında hepatik vasküler ağın adaptasyonlarını anlamak ve bunu steatoz, inflamasyon ve fibroz gibi spesifik belirteçlerle ilişkilendirmek, yeni etkili tedavi şemalarının oluşturulmasına yardımcı olabilir.Bu teknik, bu tür belirteçlerin tanımlanmasına yardımcı olur ve ayrıca hastalığın ilerlemesine karşı yeni tedavilerin geliştirilmesine odaklanan klinik öncesi çalışmalarda farelerin değerini yükseltir. Başlamak için, anestezi uygulanmış hayvanı CT tarayıcı yuvasına yerleştirin. Oftalmik merhem uygulayın, burun konisini sabitleyin ve CT tarayıcıda tarama parametrelerini ayarlayın.Kuyruk damar kateterini hazırlayın ve kuyruğu ılık suda ısıtmak için fareyi bir yatağa yerleştirin. Kateteri kuyruk damarına yerleştirin ve ilk kontrast maddeyi bir ila üç dakika süreyle yavaş ve manuel olarak gerçekleştirilen bir enjeksiyon yoluyla uygulayın. Ardından, farklı zaman noktalarında tüm vücut ve karaciğer taramalarını yaptırın.İkinci kontrast maddesinin uygulanması için, ilk kontrast madde ile son okumadan 10 gün sonra aynı prosedürü izleyin. Ön kontrast taramasının DICOM dosyasını yükledikten sonra, karaciğer, dalak ve beyaz yağ dokusunu net bir şekilde görmek için kontrastı ayarlayın. 3D ROI aracının altında, karaciğer, dalak ve yağ dokusunun görünür kan damarları ve yağ olmadan berrak göründüğü alanlarda örnekleme yapmak üzere birden fazla ROI oluşturmak için ROI ekle'yi seçin.Boyama modu altında, Küre'yi seçin. Yalnızca 2D kutusunu işaretleyin ve verilerin üzerine yatırım getirisini boyamak için açılır menüden sekiz piksellik bir çap seçin. Aşındırma dilate özelliğinden eksi bir erode seçin.Enine düzlemde Küre aracını kullanarak 2B ROI'leri ilgilenilen alanlara bölerek örnekleme gerçekleştirin. Gezintiye gidin ve her ROI için hesaplanan tazı alan birimi değerlerini içeren niceleme tablosunu görüntülemek için tabloyu göster'i seçin. Ardından, değerleri bu denkleme ekleyin.Karaciğer yağ yüzdesini hesaplayın. eXIA tarama DICOM dosyasını yükleyin ve karaciğeri, dalağı ve sol ventrikülü net bir şekilde görmek için kontrastı ayarlayın. 3D ROI aracının altında, karaciğer için birden fazla ROI'yi segmentlere ayırmak için ROI ekle'yi seçin.Boyama modunda, yalnızca 2B'yi seçin ve verilerin üzerinde yatırım getirisini boyamak için sekiz piksellik bir çap ekle Küre'yi seçin. Aşındırma dilate özelliğinden eksi bir erode seçin. Her ROI için bir ad ve renk belirtin ve her ROI için hesaplanan HU değerlerini içeren niceleme tablosunu görüntülemek için tabloyu göster'i seçin.PV organı t0'ı elde etmek için bu adımları tekrarladıktan sonra, fonksiyonel doku alım lipid transferine karşılık gelen kontrast yüzdesini çıkarmak için değerleri ekranda gösterilen denkleme ekleyin. ExiTron tarama DICOM dosyasını yükleyin ve karaciğer damar ağını net bir şekilde görmek için kontrastı ayarlayın. Karaciğer için bir 3D ROI oluşturmak için ROI ekle'yi seçin.İstenilen alanı işaretleyerek karaciğer ROI'sini tanımlayın. Ardından, ROI seçiciden arka plan ROI'sini seçin. Karaciğer ROI'sini değiştirmeden arka planı kaldırmak için Kesim Gerçekleştir simgesine tıklayın.Maksimum yoğunlukta projeksiyon görüntüleyiciyi etkinleştirin. Ardından, sihirli değnek simgesiyle gösterilen segmentasyon algoritmaları altında, karaciğer yatırım getirisini yeniden segmentlere ayırmak için bağlı eşiği seçin. Minimum ve maksimum değerleri girerek eşikleri ayarlayın ve damar ağını elde edin.Yine, vasküler ağın net bir temsilini elde etmek için arka plandaki karaciğer dokusunu çıkarın. ExiTron tarama DICOM dosyasını yükledikten sonra, karaciğeri, dalağı ve sol ventrikülü net bir şekilde görmek için kontrastı ayarlayın. YG ekle'yi seçin ve karaciğer ve büyük bir kan damarı için ROI'leri segmentlere ayırın.Her doku için 2D ROI'ler oluşturmak için segmentasyon katmanlarını tanımlayın. Kontrast madde enjeksiyonundan önce karaciğerin ortalama parlaklığını elde etmek için kontrast öncesi DICOM dosyasının adımlarını tekrarlayın. Portal ven çapı için, superior mezenterik ve splenik venlerin birleştiği yerin üzerindeki üç ila dört dilimin enine düzlemlerini bulun ve ardından navigasyona ve ardından mesafe temizliğine gidin, iki nokta arasındaki tam mesafeyi ölçmek için çizgiyi seçin.Ortalama kontrast değerleri bu gruplandırılmış verilerle sunulur. Fonksiyonel doku alım testi, sağlıklı kontrollere kıyasla alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı olan farelerde eXIA kontrast maddesinin daha yüksek birikimini ve daha yavaş klerensini gösterdi. Bu temsili sonuçlar, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı olan fareler ile sağlıklı kontroller arasında karaciğer yağı, hepatik vasküler ağ hacmi, portal ven çapı ve hepatik bağıl kan hacmi yüzdesindeki farklılıkları göstermektedir.Herhangi bir kontrast madde içermeyen mikro-BT görüntüleme, alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı olan farelerde kontrollere kıyasla daha yüksek karaciğer yağı yüzdesi olduğunu gösterdi. Benzer şekilde, sağlıklı kontrollere kıyasla alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı olan farelerde daha yüksek hepatik vasküler ağ hacmi, hepatik bağıl kan hacmi ve daha büyük bir portal ven çapı bulundu. Bu tekniği denerken hatırlanması gereken en önemli şey, seçilen anatomik bölge üzerinde sürekli olarak doğru davranmaktır.Yanlış anatomik noktanın seçilmesi doğru olmayan sonuçlara yol açabilir. Bu metodoloji ve protokol izlenerek, karaciğer hastalığı evrelemesinin doğru bir değerlendirmesi yapılabilir. Böylece, yeni ilaç etkinliğini değerlendirmek için belirli bir platform görevi görebilir.Bu teknik, karaciğer patolojilerini değerlendirmek ve ilgili ilaç geliştirme testlerini başlatmak için yeni, daha kolay ve daha doğru yolların önünü açar.