图 1 是使用 BioRender.com 创建的。这项工作得到了希腊研究与创新基金会（#3222 至 A.C.）的支持。Anna Hadjihambi由肝脏研究基金会罗杰威廉姆斯肝病学研究所资助。

所有程序均由BIOEMTECH的人员根据欧洲和国家福利法规执行，并得到国家当局的批准（许可证号EL 25 BIOexp 45 / PN 49553 21/01/20）。所有实验的设计和报告均符合ARRIVE指南26。这些小鼠是从希腊雅典的希腊巴斯德研究所购买的。
注意：将动物分组饲养在20-22°C的房间中富含轨道和纸板管的单独通风笼子中，相对湿度为50%-60%，光照/黑暗循环为12小时（光照07：00 am-07：...

目前推荐的人类NAFLD诊断和分期方法是肝活检，它存在出血复杂性的风险，以及采样不准确40。相反，在动物模型中，这种诊断是通过尸检的组织学进行的，尽管现在可以使用可存活肝活检的方案，并且在研究设计允许时推荐41。使用验尸组织学意味着需要大量的动物来研究这种疾病的进展。因此，在疾病进展时，不能在同一只动物身上进行研究;当比较在不同时...

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种代谢性疾病，影响约25%的人口和>80%的病态肥胖人群1。据估计，这些人中有三分之一进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），其特征是肝脂肪变性，炎症和纤维化2。NASH是一个疾病阶段，发生肝硬化和肝细胞癌（HCC）的风险明显更高3,4。因此，NASH是目前肝移植的第二大常见原因，也有望很快成为肝移植最重要的预测因子5,6,7。尽管其患病率和严重程度，但没有针对NAFLD的疾病特异性疗法，现有的治疗方法仅旨在解决与疾病相关的病理，例如胰岛素抵抗和高脂血症5,6。
近年来，内皮细胞以及一般代谢组织（如脂肪组织和肝脏）的血管网络的病理生理作用和适应在研究中变得越来越重要，特别是在肥胖和代谢失调期间7,8。内皮是细胞单层，在内部排列血管网络，充当功能和结构屏障。它还有助于各种生理和病理过程，例如血栓形成，代谢物运输，炎症和血管生成9,10。在肝脏的情况下，血管网络的特征之一是存在高度特化的细胞，定义为肝窦内皮细胞（LSEC）。这些细胞缺乏基底膜并且具有多个腱骨，允许底物更容易在血液和肝实质之间转移。由于其独特的解剖位置和特征，LSEC可能在肝脏的病理生理过程中起着至关重要的作用，包括在NAFLD / NASH期间肝脏炎症和纤维化的发展。事实上，LSEC在NAFLD过程中经历的病理，分子和细胞适应有助于疾病进展11。具体来说，在NAFLD期间发生的LSC依赖性肝血管生成与炎症的发展和疾病进展为NASH甚至HCC12显着相关。此外，肥胖相关的早期NAFLD的特征是LSC中胰岛素抵抗的发展，这发生在肝脏炎症或其他晚期NAFLD体征的发展之前13。
此外，LSEC最近已成为几种病因的肝病期间肝血流和血管网络适应的中枢调节剂14,15。事实上，慢性肝病的特征是明显的肝内血管收缩和对血流的阻力增加，这有助于门静脉高压的发展16。就NAFLD而言，一些与LSEC有关的机制助长了这一现象。例如，如上所述，LSEC 特异性胰岛素抵抗与肝血管系统的胰岛素依赖性血管舒张减少有关13。此外，在疾病过程中，肝脏脉管系统对血管收缩剂变得更加敏感，进一步导致肝血流受损并导致剪切应激的出现，这两者都会导致正弦微循环的破坏17。这些事实表明，脉管系统是肝病的关键靶标。然而，阻碍NAFLD / NASH的及时诊断和监测以及潜在疗法开发的限制因素是肝脏微环境和（微）血管结构的一致表征以及以时空和非侵入性方式对疾病分期进行评分的不足。
显微计算机断层扫描（CT）成像是目前用于准确描述生物体内解剖信息的金标准非侵入性成像方法。显微CT和MRI代表了两种互补的成像方法，可以覆盖广泛的病理，并在成像的结构和组织中提供出色的分辨率和细节。特别是显微CT是一种非常快速和准确的工具，通常用于研究骨骼疾病和相关骨表面变化等病理学18，评估肺纤维化随时间的进展19，诊断肺癌及其分期20，甚至检查牙齿病理21，而无需对成像样本进行任何特殊准备（或破坏）。
显微CT的成像技术是基于各种器官在X射线与物质相互作用方面的不同衰减特性。在CT图像中，呈现高X射线衰减差异的器官以高对比度描绘（即，肺部看起来很暗，骨骼看起来很亮）。具有非常相似的衰减特性的器官（不同的软组织）在CT图像上难以区分22。为了解决这一限制，基于碘、金和铋的专用造影剂已被广泛用于 体内 使用。这些药剂改变它们积聚的组织的衰减特性，从循环中缓慢清除，并使整个血管系统或所选组织均匀而稳定地混浊23。
在人类诊断中，CT成像和类似技术，例如MRI衍生的质子密度脂肪分数，已经用于测定肝脂肪含量24,25。在NAFLD的背景下，高软组织对比度对于准确区分病理病变或小血管至关重要。为此，使用造影剂来增强肝组织特征的对比度。这些工具和材料允许研究多种肝脏特征和可能的病理表达，例如血管网络的结构和密度，脂质沉积/脂肪变性以及肝脏中的功能性组织摄取/脂质（乳糜微粒）转移。此外，还可以评估肝脏相对血容量和门静脉直径。在非常短的扫描时间内，所有这些参数都提供了关于NAFLD评估和进展的不同和互补信息，可用于制定非侵入性和详细的诊断。
在本文中，我们提供了一种分步协议，用于使用新型 体内 显微CT成像技术作为评估NAFLD进展阶段的非侵入性方法。使用该协议，可以进行肝脂肪变性和功能性组织摄取的纵向分析，以及相对血容量，门静脉直径和血管网络密度的评估，并将其应用于肝病小鼠模型。

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		<tr>
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		<tr>
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		<tr>
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			<td></td>
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		<tr>
			<td>Normal diet with 10% of kilocalories from fat&#160;</td>
			<td>Research Diets, New Brunswick, NJ, USA</td>
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		</tr>
		<tr>
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		</tr>
	</tbody>
</table>

novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques for assessing the progression of non-alcoholic fatty liver disease

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一个日益严重的全球健康问题，目前缺乏有效治疗方法加剧了NAFLD的影响。阻碍NAFLD的及时和准确诊断（包括分级）和监测以及潜在疗法开发的相当大的限制因素是目前在肝微环境结构表征和疾病分期评分方面的不足时空和非侵入性方式。使用饮食诱导的NAFLD小鼠模型，我们研究了 体内 显微计算机断层扫描（CT）成像技术作为评估NAFLD进展阶段的非侵入性方法的使用，主要集中在肝血管网络上，因为它显着参与NAFLD相关的肝脏失调。这种成像方法可以对肝脏脂肪变性和功能性组织摄取进行纵向分析，以及评估相对血容量、门静脉直径和血管网络密度。了解NAFLD进展过程中肝血管网络的适应性，并将其与使用所提出的方法表征疾病进展（脂肪变性，炎症，纤维化）的其他方法相关联，可以为建立新的，更有效的，可重复的方法铺平道路用于小鼠的NAFLD研究。该协议还有望提升临床前动物模型的价值，以研究针对疾病进展的新疗法的开发。

在这项代表性研究中，不含任何造影剂的显微CT成像表明，与对照组相比，NAFLD小鼠的肝脂肪百分比更高（表2），证实了病理学。使用ExiTron造影剂和上述肝血管网络结构和密度分析，发现与健康对照相比，NAFLD小鼠肝血管网络的总体积密度更高（图6，表2）。与对照组小鼠相比，患有NAFLD的小鼠也具有更大的门静脉直径（表2），这是与肝...

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Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

使用饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠模型，我们 描述了使用新型 体内微型计算机断层扫描成像技术作为评估NAFLD进展阶段的非侵入性方法，主要关注肝血管网络，因为它显着参与NAFLD相关的肝失调。

用于评估非酒精性脂肪肝进展的新型 体内 微计算机断层扫描成像技术

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective ...

我们认为该协议具有重要意义，因为它展示了一种非侵入性简单易行的方法，可以随着时间的推移评估肝病诊断的关键指标。这种成像方法允许分析肝脏状态，评估相对血容量，门静脉直径，血管网络强度，肝脏病理学的所有重要参数。了解NAFLD进展期间肝血管网络的适应性并将其与特定标志物（如脂肪变性，炎症和纤维化）相关联，可以帮助建立新的有效治疗方案。该技术有助于识别此类标志物，并提升小鼠在临床前研究中的价值，重点是开发针对疾病进展的新疗法。首先，将麻醉动物置于CT扫描仪摇篮中。涂抹眼药膏，固定鼻锥，并在CT扫描仪上设置扫描参数。准备尾静脉导管并将鼠标放在床上，用温水加热尾部。将导管插入尾静脉并通过注射给药第一种造影剂，缓慢手动进行，持续时间为一到三分钟。然后，在不同的时间点进行全身和肝脏扫描。在用第一种造影剂进行最终读数后10天，遵循相同的程序施用第二种造影剂。加载造影前扫描的DICOM文件后，调整对比度以清晰地看到肝脏，脾脏和白色脂肪组织。在 3D ROI 工具下，选择添加 ROI 以生成多个 ROI，以在肝脏、脾脏和脂肪组织看起来清晰且没有明显血管和脂肪的区域执行采样。在绘画模式下，选择“球体”。勾选仅 2D 框，然后从下拉菜单中选择 8 个像素的直径以在数据上绘制 ROI。从侵蚀扩张特征中，选择减去一个侵蚀。通过在横向平面上使用球体工具分割感兴趣区域的 2D ROI 来执行采样。转到导航并选择显示表以显示量化表，其中包含每个 ROI 的计算猎犬字段单位值。然后，将值代入此等式中。计算肝脏脂肪的百分比。加载eXIA扫描DICOM文件，并调整对比度以清楚地看到肝脏，脾脏和左心室。在 3D ROI 工具下，选择添加 ROI 以细分肝脏的多个 ROI。在绘画模式下，选择“仅 2D”，然后选择“球体添加 8 个像素的直径以在数据上绘制 ROI”。从侵蚀扩张特征中，选择减去一个侵蚀。为每个ROI指定名称和颜色，然后选择显示表以显示包含每个ROI计算的HU值的量化表。重复这些步骤以获得PV器官t0后，将值插入屏幕上显示的方程式中，以提取对应于功能性组织摄取脂质转移的百分比对比度。加载ExiTron扫描DICOM文件，并调整对比度以清楚地看到肝脏血管网络。选择“添加 ROI”以生成肝脏的 3D ROI。通过标记所需区域来定义肝脏投资回报率。然后从 ROI 选择器中选择背景投资回报率。点击 执行切割 图标，在不改变肝脏投资回报率的情况下删除背景。激活最大强度投影查看器。然后，在魔杖图标表示的分割算法下，选择连接的阈值以重新分割肝脏投资回报率。通过输入最小值和最大值来设置阈值并获得血管网络。再次，去除背景肝组织以获得血管网络的清晰表示。加载ExiTron扫描DICOM文件后，调整对比度以清晰地看到肝脏，脾脏和左心室。选择添加肝脏和大血管的 ROI 和分段 ROI。定义分割层以为每个组织生成 2D ROI。对造影前DICOM文件重复这些步骤，以获得注射造影剂之前肝脏的平均亮度。对于门静脉直径，定位肠系膜上静脉和脾静脉交界处上方三到四层的横平面，然后进行导航，然后进行距离卫生，选择线以测量两点之间的确切距离。平均对比度值由此分组数据表示。功能性组织摄取测定表明，与健康对照组相比，非酒精性脂肪性肝病小鼠中eXIA造影剂的积累更高，清除速度更慢。这些代表性结果表明，非酒精性脂肪性肝病小鼠与健康对照组在肝脂肪百分比、肝血管网络容积、门静脉直径和肝相对血容量方面存在差异。与对照组相比，没有任何造影剂的显微CT成像表明，与对照组相比，患有非酒精性脂肪性肝病的小鼠的肝脏脂肪百分比更高。同样，与健康对照组相比，在患有非酒精性脂肪性肝病的小鼠中发现了更高的肝血管网络体积、肝脏相对血容量和更大的门静脉直径。尝试这种技术时要记住的最重要的事情是始终准确选择的解剖区域。选择错误的解剖部位会导致不准确的结果。通过遵循这种方法和协议，可以对肝病分期进行准确评估。因此，它可以作为评估新药效率的指定平台。该技术为评估肝脏病理和启动相关药物开发测定的新的、更简单、更准确的方法铺平了道路。

用于评估非酒精性脂肪肝进展的新型体内微计算机断层扫描成像技术

Abstract

用于评估非酒精性脂肪肝进展的新型 体内 微计算机断层扫描成像技术

Abstract

用于评估非酒精性脂肪肝进展的新型体内微计算机断层扫描成像技术