המחברים מודים לתמיכה שקיבלו מ- Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, עבור הדור של עכברי AdipoSPH, המעבדה לאינמונומטבוליזם ואיתות התא, והמכון הלאומי למדע וטכנולוגיה בנושא פוטוניקה יישומית לביולוגיה של התא (INFABIC) עבור כל התמיכה הניסויית. אנו מודים לתמיכה הכספית מקרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

מחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך אוניברסיטת קמפינאס לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרוטוקול CEUA #5810-1/2021).
1. שיבוט מולקולרי
<ol><li>תכנון רנ"א מנחה יחיד (sgRNAs)<ol><li>תכנן sgRNA להפעלת CRISPR באמצעות CHOPCHOP, הזמין ב- https://chopchop.cbu.uib.no/, או כל כלי מתאים אחר. השתמש בפרמטרים הבאים כדי לתכנן...

<ol>
	<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+brown+and+beige+fat+development.">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human.">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150 (2), 366-376 (2012).</li><li>Cohen, P., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+and+functional+complexity+of+thermogenic+fat.">The cellular and functional complexity of thermogenic fat.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+editing:+Repurposing+CRISPR-Cas9+for+precision+genome+regulation+and+interrogation.">Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+transcriptional+activation+by+an+engineered+CRISPR-Cas9+complex.">Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex.</a> Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+CRISPR-mediated+control+of+gene+repression+and+activation.">Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation.</a> Cell. 159 (3), 647-661 (2014).</li><li>Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein-tagging+system+for+signal+amplification+in+gene+expression+and+fluorescence+imaging.">A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging.</a> Cell. 159 (3), 635-646 (2014).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+transcriptional+programming.">Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming.</a> Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).</li><li>Chavez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Cas9+activators+in+multiple+species.">Comparison of Cas9 activators in multiple species.</a> Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+transcriptional+activation+of+multiple+genes+in+the+brain+using+CRISPR-dCas9-activator+transgenic+mice.">In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).</li><li>Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+purification,+and+quality+control+for+adeno-associated+virus-based+vectors.">Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).</li><li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bj&#246;rklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+production+everywhere:+a+simple,+fast,+and+reliable+protocol+for+in-house+aav+vector+production+based+on+chloroform+extraction.">AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction.</a> Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).</li><li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige/brite+cells.">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization.">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li><li>Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture,+and+functional+analysis+of+murine+thermogenic+adipocytes.">Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).</li><li>Cohen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+PRDM16+and+beige+adipose+causes+metabolic+dysfunction+and+a+subcutaneous+to+visceral+fat+switch.">Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch.</a> Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).</li><li>Harms, M., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+and+beige+fat:+development,+function+and+therapeutic+potential.">Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).</li><li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+for+the+analysis,+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements.">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm16+determines+the+thermogenic+program+of+subcutaneous+white+adipose+tissue+in+mice.">Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).</li><li>Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+adipose+tissue+development+from+transgenic+animal+models.">Understanding adipose tissue development from transgenic animal models.</a> Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).</li><li>Bates, R., Huang, W., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue:+an+emerging+target+for+adeno-associated+viral+vectors.">Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 19, 236-249 (2020).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+issues+in+AAV-mediated+in+vivo+gene+therapy.">Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 8, 87-104 (2018).</li><li>Deshmukh, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics-based+comparative+mapping+of+the+secretomes+of+human+brown+and+white+adipocytes+reveals+EPDR1+as+a+novel+batokine.">Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine.</a> Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).</li><li>Sponton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+glucose+and+lipid+homeostasis+via+PLTP+as+a+mediator+of+BAT-liver+communication.">The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication.</a> EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).</li></ol>

אחד היישומים השימושיים ביותר של טכנולוגיית CRISPR הוא חקירת תפקוד גנים באמצעות הפעלת גנים אנדוגניים באמצעות מערכות CRISPRa6. SPH הוא CRISPRa רב עוצמה שתואר במקור כגורם להמרה של אסטרוציטים לנוירונים פעילים על ידי התמקדות במספר גנים נוירוגניים14. במחקר זה, AdipoSPH הוכח ככלי מתאי?...

אדיפוציטים בצבע בז' (או בריט) הם אדיפוציטים המבטאים חלבון 1 (UCP1) ועשירים במיטוכונדריה השוכנים במחסני רקמת השומן הלבנה (WAT). שומן בז' יוצא מתת-קבוצה של אבות אדיפוציטים או אדיפוציטים לבנים בוגרים בתגובה לחשיפה לקור ולגירויים אחרים 1,2. אדיפוציטים בצבע בז' יכולים להמיר אנרגיה לחום באופן תלוי UCP1 או עצמאי3. ללא קשר לתפקוד התרמוגני, שומן בז 'יכול גם לשפר את הבריאות המטבולית באמצעים אחרים, כגון הפרשת אדיפוקינים ופעילויות אנטי דלקתיות ואנטי פיברוטיות. מחקרים בעכברים ובבני אדם הראו כי השראת שומן בז' משפרת את רמת הגלוקוז בכל הגוף ואת הומאוסטזיס השומנים3. עם זאת, למרות שהידע שלנו על ביולוגיה של שומן בז' התפתח במהירות בשנים האחרונות, רוב היתרונות המטבוליים שלו והמנגנונים הקשורים אליו עדיין אינם מובנים במלואם.
חזרות פלינדרומיות קצרות מקובצות במרווחים קבועים (CRISPR) תוארו לראשונה בתאים איקריוטים ככלי המסוגל ליצור שבר דו-גדילי (DSB) באתר מסוים בגנום באמצעות פעילות הנוקלאז של חלבון Cas9 4,5. Cas9 מונחה על ידי RNA סינתטי חד-מנחה (sgRNA) כדי להתמקד באזור גנומי מסוים, מה שמוביל ל-DNA DSB. בנוסף לשימוש בנוקלאז Cas9 למטרות עריכה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 התפתחה לשימוש ככלי לוויסות גנים ספציפילרצף 6. הפיתוח של חלבון Cas9 לא פעיל קטליטית (dCas9) והקשר של מודולי שעתוק המסוגלים לשפר ביטוי גנים הולידו כלי הפעלת CRISPR (CRISPRa). מספר מערכות CRISPRa התפתחו, כגון VP647,8, מתווך הפעלה סינרגטית (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 ו-SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, המשלב את הרכיבים של מפעילי SAM ו-SunTag. לאחרונה הוכח כי הביטוי המושרה של גנים נוירוגניים בנוירובלסטים N2a ובאסטרוציטים ראשוניים גבוה יותר באמצעות SPH בהשוואה למערכות CRISPRaאחרות 14, מה שמדגים SPH ככלי CRISPRa מבטיח.
כאן, ניצלנו עכבר SPH14 שפותח בעבר כדי ליצור מודל עכבר מותנה המבטא SPH במיוחד באדיפוציטים באמצעות שושלת אדיפונקטין Cre (AdipoSPH). באמצעות וירוס הקשור לאדנו (AAV) הנושא את ה-gRNA המכוון לגן האנדוגני Prdm16, השחמה (המרה מלבן לבז') של WAT מפשעתי (iWAT) הושרה כדי להגביר את הביטוי של תוכנית הגנים התרמוגניים. יתר על כן, ביטוי יתר של Prdm16 במבחנה שיפר את צריכת החמצן. לכן, פרוטוקול זה מספק מודל עכבר SPH רב-תכליתי לחקר מנגנוני התפתחות שומן בז' ברקמת השומן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5-Triiodo-L-thyronine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVpro 293T Cell Line</td>
			<td>Takarabio</td>
			<td>632273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra Centrifugal Filter</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>UFC510008</td>
			<td>100 KDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagles Medium (DMEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX&#8482; supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td>high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta Self-Opening Micro Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-467-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LigaFast Rapid DNA Ligation System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M8225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep purification kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80308</td>
			<td>Model 701</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 10-beta/Stable&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td>E. coli competent cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/8&#160;</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>112864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>91947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdDeltaF6&#160;</td>
			<td>Addgene&#160;</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>89510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine</td>
			<td>Rioqu&#237;mica</td>
			<td>510101303</td>
			<td>Antiseptic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Premier Adson Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>475-40417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M180B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 PNK enzyme kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tramadol Hydrochloride</td>
			<td>SEM</td>
			<td>43930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vidisic Gel&#160;</td>
			<td>Bausch + Lomb&#160;</td>
			<td>99620</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of beige fat biology and metabolism using the crispr suntag-p65-hsf1 activation system

טכנולוגיית CRISPR (ראשי תיבות של Clustered regular interspaced short palindromic repeats) חוללה מהפכה בביולוגיה, וכלים עדכניים יושמו הרבה מעבר לעריכה הגנטית שתוארה במקור. מערכת הפעלת CRISPR (CRISPRa) משלבת את חלבון Cas9 (dCas9) הבלתי פעיל קטליטית עם מודולי שעתוק נפרדים כדי לגרום לביטוי גנים אנדוגניים. SunTag-p65-HSF1 (SPH) היא טכנולוגיית CRISPRa שפותחה לאחרונה המשלבת רכיבים של מתווכי הפעלה סינרגטיים (SAMs) עם מפעילי SunTag. מערכת זו מאפשרת ביטוי יתר של גנים בודדים או מרובים על ידי תכנון RNA חד-מנחה מותאם אישית (sgRNA). במחקר זה, עכבר SPH שפותח בעבר שימש ליצירת עכבר מותנה המבטא SPH באדיפוציטים (שושלת adiponectin Cre), בשם AdipoSPH. כדי לגרום לפנוטיפ שומן לבן עד בז' (השחמה), הוזרק וירוס הקשור לאדנו (AAV) הנושא sgRNA המכוון לגן האנדוגני Prdm16 (גורם שעתוק מבוסס היטב הקשור להתפתחות שומן חום ובז') לרקמת השומן הלבן המפשעה (iWAT). מודל עכבר זה גרם לביטוי של Prdm16 אנדוגני והפעיל את תוכנית הגן התרמוגני. יתר על כן, ביטוי יתר של Prdm16 המושרה על ידי SPH במבחנה שיפר את צריכת החמצן של אדיפוציטים בצבע בז', פנוסקופיה של התוצאות של מודל עכבר מהונדס קודם של Prdm16. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר רב-תכליתי, חסכוני וחסכוני בזמן לחקר ביולוגיה של רקמת שומן.

עכברי AdipoSPH פותחו על ידי גידול זני עכברי SPH ו- Adipoq-Cre. שני זני העכבר היו על רקע היברידי C57BL6J-DBA/2J (על פי הספק המסחרי; ראה טבלת חומרים). שושלת עכברי SPH תוארה במקור על ידי Zhou et al.14.
התפתחות אדיפוציט In vivo בצבע בז' באמצעות ביטוי יתר של Prdm16 בתיווך Adip...

Watch this Scientific Journal Video about Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System at JoVE.com

Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System

פרוטוקול זה מציג את השימוש ב-CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) באדיפוציטים (AdipoSPH) כאסטרטגיה חלופית לווירוס הקשור לאדנו (AAV) לחקר ביולוגיה של שומן בז'. הזרקת In vivo של sgRNA נושא AAV המכוונת לגן האנדוגני Prdm16 מספיקה כדי לגרום להתפתחות שומן בז' ולשפר את תוכנית הגן התרמוגני.

חקירת ביולוגיה ומטבוליזם של שומן בז' באמצעות מערכת ההפעלה CRISPR SunTag-p65-HSF1

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technology has prompted a revolution in biology, and recent tools have been applied far ...

פרוטוקול זה מציג את SPH CRISPR Activation System כאסטרטגיה חלופית לווקטורים נגיפיים קונבנציונליים לביצוע בדיקות פונקציית רווח באדיפוציטים. הוא מאפשר ביטוי יתר של גנים אנדוגניים של אדיפוציט יחיד או מרובים בסביבה התאית המורכבת של רקמת השומן על ידי אספקת RNA מנחה יחיד מותאם אישית באמצעות וירוס הקשור באדנו. השלבים המאתגרים של פרוטוקול זה קשורים לשיבוט הרנ"א המנחה היחיד ולייצור והזרקה של נגיף הקשור באדנו לרקמת השומן.כדי להתחיל, תכנן RNA מדריך יחיד או sgRNA להפעלת CRISPR באמצעות chopchop או כל כלי מתאים אחר. עצבו את ה-sgRNA המכוון לגן PRDM16 באמצעות הפרמטרים הבאים:Target as PRDM16 ב-Mus musculus באמצעות CRISPR/Cas9 ועבור כהפעלה. הוסף שלוחות ל- sgRNA כדי להתאים לאתר הגבלת Sac1 בדובדבן עמוד השדרה הווקטורי PAAVU6GRNACBHM.כלול 5'AGCT 3'כאשר n מתאים לנוקלאוטידים. קבל רצף משלים הפוך של 3'sgRNA באמצעות הכלי שצוין. לאחר מכן, לחישול של אוליגונוקלאוטידים משלימים חד-גדיליים, הוסף מיקרוליטר אחד מכל אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי 5'ו-3', מיקרוליטר אחד של חיץ ליגאז T4, 0.5 מיקרוליטר של פולינוקלאוטיד קינאז T4, ו-6.5 מיקרוליטר מים לקבלת נפח תגובה סופי של 10 מיקרוליטר.אנל את האוליגונוקלאוטידים החד-גדיליים המשלימים באמצעות תרמוסייקלר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ו-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן קצב עלייה של חמש מעלות צלזיוס לדקה. לאחר מכן עבור קשירה של אוליגונוקלאוטידים sgRNA מחושלים להוסיף 25 ננוגרם של דובדבן פלסמיד PAAVU6GRNACBHM לשני מיקרוליטרים של אוליגונוקלאוטידים sgRNA מחושלים, מיקרוליטר אחד של אנזים Sac1, שני מיקרוליטרים של 10X T4 DNA ligase buffer, מיקרוליטר אחד של T4 DNA ligase ומים לנפח תגובה סופי של 10 מיקרוליטר. באמצעות thermocycler, לבצע קשירה על ידי דגירה של תערובת התגובה במשך 15 מחזורים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ו 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחר מכן להחזיק בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, להפוך את התאים Escherichia coli DH10B מוכשר עם ארבעה מיקרוליטר של מוצר קשירה על ידי הלם חום ב 42 מעלות צלזיוס במשך 45 שניות ומרחים על צלחת אגר המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. אשר מושבות שעברו טרנספורמציה על ידי תגובת שרשרת קולוני פולימראז או PCR באמצעות PCR Master Mix, בחר את המושבה וערבב אותה עם חמישה מיקרוליטרים של Master Mix, 0.1 מיקרוליטר של פריימר אוניברסלי, 0.1 מיקרוליטר של פריימר הפוך sgRNA וחמישה מיקרוליטר מים. הפעל את ה-PCR באמצעות דנטורציה ראשונית ב-94 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן 35 מחזורים של דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, חישול במשך 30 שניות ב-60 מעלות צלזיוס, הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ושלב התארכות סופי ב-72 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לאחר PCR, לפתור את ה- DNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל agarose ב 0.5X TAE Buffer ב 90 וולט במשך 30 דקות. שלח דגימות חיוביות עבור ריצוף Sanger באמצעות פריימר אוניברסלי. לאחר מכן, לטהר את הפלסמיד משיבוט חיובי באמצעות ערכת טיהור פלסמיד בהתאם להוראות היצרן.הניחו את העכבר המרדים במצב שכיבה וגלחו אזור קטן באגפים הקרוב למפרקי הירך עבור רקמת שומן לבנה מפשעתית או הזרקות IWAT עם מכונת גילוח. מוסיפים קרם depilatory במשך חמש דקות. יש להסיר שאריות קרם עם מים כדי למנוע כוויות בעור.לחטא את העור באמצעות שלושה סבבים לסירוגין של החלת תמיסת יוד פובידון על העור עם גזה נקייה ו 70% אלכוהול. לאחר מכן, בצע חתך של סנטימטר עד שניים עם מספריים מעוקרים באזור הפרוקסימלי של המפרקים והחזק את העור פתוח באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את מחסן השומן. ניתן לחבר את ה-WAT לעור משני הצדדים, ולהאריך אותו מההתחלה, מהגב לכיוון האשכים.בעזרת מלקחיים, משכו בעדינות את מחסן השומן כלפי מעלה דרך החתך כדי לוודא שההזרקה נמצאת במיקום ובעומק הנכונים. מלאו את מזרק המיקרוליטר ב-2.5 מיקרוליטר של הנגיף הקשור באדנו, או AAV המכיל את ה-sgRNA המכוון לגן PRDM16 האנדוגני. הכנס בזהירות את המחט בזווית של 30-45 מעלות לתוך IWAT.חזור על הזריקה חמש פעמים למיקומים שונים של הרקמה כדי להדביק הומוגנית את כל כרית השומן IWAT. הניחו את העכבר על כרית החימום עד להכרה חוזרת. עקוב אחר בעל החיים כל 10 עד 15 דקות עד שהוא מתאושש לחלוטין.לאחר שהחיה חוזרת להכרה התבוננו בפרופיל הקטר, שאמור להיות ליניארי וללא סימני מצוקה או כאב. ראה את תאי כלי הדם סטרומה או SVF נגזר אדיפו SPH עכבר IWAT לתוך צלחת 6-Well המכילה מדיום DMEM שלם במשך שעה עד שעתיים, לשאוף את המדיום, לשטוף את הבאר פעמיים באמצעות PBS, ולהחליף אותו עם מדיום טרי ושלם. דוגרים על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות עד שהתאים מגיעים למפגש של 70-80%.ביום 0, יש לגרום להתמיינות על ידי טיפול בתאים עם מדיום האינדוקציה ולאחר יומיים להחליף את מדיום האינדוקציה במדיום התחזוקה. שוב לאחר יומיים, ביום הרביעי, החליפו את אמצעי התחזוקה באמצעי תחזוקה טרי למשך 2-3 ימים. שנה את אמצעי התחזוקה כל 48 שעות עד שהפרדיפוציטים מתמיינים באופן מלא לאדיפוציטים.התבונן באדיפוציטים הבוגרים באמצעות מיקרוסקופ אור כאשר התאים המתמיינים נראים עמוסים בטיפות שומנים. לאחר גידול התאים על צלחת תרבית 6-Well עם התווך המלא עד שהתאים מגיעים למפגש של 70-80%, מערבבים 5.6*10^10 גנום נגיפי למיקרוליטר של sgRNA PRDM16 נושא AAV עם שני מיליליטר של ברומיד בינוני מלא והקסדימתרין. התמירו את התאים על ידי החלפת המדיום השלם והוספת המדיום השלם המכיל AAV.לדגור על התאים המומרים במשך 12 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו-5% פחמן דו חמצני. לפצל ולראות את התאים כפי שמתואר עבור התפשטות תאים והתמיינות לאדיפוציטים בצבע בז '. תמונות האימונופלואורסנציה מ-IWAT של עכברי adipo SPH הדגימו את הביטוי של dCas9 הן בקבוצת הביקורת והן בקבוצת PRDM16.ביטוי PRDM16 המושרה על ידי SPH גרם בבירור להצטברות נרחבת של אדיפוציטים רב-עיניים בצבע בז' לתוך IWAT. יתר על כן, PCR כמותי גילה ביטוי מוגבר של PRDM16 ותוכנית הגן התרמוגנית בקבוצת PRDM16 בהשוואה לקבוצת הביקורת. באופן דומה, ניתוח ביטוי גנים במבחנה אישר את הביטוי המוגבר של הגן האנדוגני PRDM16 והגנים התרמוגניים בקבוצת ביטוי היתר PRDM16 בהשוואה לקבוצת הביקורת.ביטוי PRDM16 המושרה על ידי SPH הביא לצריכת חמצן בסיסית ומקסימלית גבוהה יותר מזו שבתאי הביקורת. חשוב לציין כי הנתונים הצביעו על נשימה בלתי מצומדת מוגברת בקבוצת PRDM16 בהשוואה לזו שבקבוצת הביקורת. מודל Adipo SPH מתאים לחקר גנים מרובים ואלמנטים רגולטוריים בתוך אדיפוציטים.שיטה זו פותחת את האפשרות להבנה עמוקה יותר של ביולוגיה של שומן בז'.

חקירת ביולוגיה ומטבוליזם של שומן בז' באמצעות מערכת ההפעלה CRISPR SunTag-p65-HSF1

Abstract