تم دعم هذا العمل من قبل DFG EN 1093 / 5-1 (رقم المشروع 458247426). تم دعم M.O. من قبل زمالة JSPS للأبحاث الخارجية. تم إنشاء جميع الأرقام مع BioRender.com. تم إجراء قياس التدفق الخلوي بمساعدة قياس التدفق الخلوي للمرفق الأساسي في المركز الطبي الحيوي في ميونيخ. نود أن نشكر ماكوتو شيدا وتومويو موتو من ASHBi ، جامعة كيوتو ، لدعم تصوير الفيديو.

تمت الموافقة على هذا الإجراء التجريبي من قبل لجنة الأخلاقيات المسؤولة عن التجارب البشرية (20-122 ، Ethikkommission LMU München). تم إجراء جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. ملاحظة: يجب الحصول على الموافقة من اللجنة الأخلاقية المناسبة قبل البدء في التجارب التي تتعامل مع العينات الب...

تعد iPSCs أنواعا قيمة من الخلايا لأنها تسمح بتوليد أنواع الخلايا التي يتعذر الوصول إليها في المختبر. كمواد أولية لإعادة البرمجة ، على سبيل المثال ، لا تتوفر الخلايا الليفية بسهولة من جميع أنواع الرئيسيات ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتوليد iPSCs من الخلايا المشتقة من البول. يمكن الحصول على...

تعد المقارنات الجينومية للرئيسيات البشرية وغير البشرية (NHPs) ضرورية لفهم تاريخنا التطوري وتطور السمات الخاصة بالإنسان1. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه المقارنات بالاستدلال على الوظيفة من خلال تحديد تسلسلات الحمض النووي المحفوظة2 ، على سبيل المثال ، لتحديد أولويات المتغيرات المرتبطة بالمرض3. تعد مقارنات الأنماط الظاهرية الجزيئية مثل مستويات التعبير الجيني ضرورية لتفسير المقارنات الجينومية بشكل أفضل واكتشاف ، على سبيل المثال ، اختلافات النمط الظاهري الخلوي. علاوة على ذلك ، لديهم - على غرار المقارنات على مستوى الحمض النووي - القدرة على استنتاج الأهمية الوظيفية ، وبالتالي تفسير التباين ذي الصلة طبيا بشكل أفضل داخل البشر4. يتطلب دمج بيانات النمط الظاهري الجزيئي الشاملة في هذه الدراسات المقارنة موارد بيولوجية مناسبة (أي خلايا متعامدة عبر الأنواع). ومع ذلك ، فإن الأسباب الأخلاقية والعملية تجعل من الصعب أو المستحيل الوصول إلى مثل هذه الخلايا المماثلة ، خاصة أثناء التطوير. تسمح الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) بتوليد أنواع الخلايا التي يتعذر الوصول إليها في المختبر 5,6 ، ويمكن الوصول إليها تجريبيا ، وقد تم استخدامها لمقارنات الرئيسيات 6،7،8،9،10،11،12،13،14.
لتوليد iPSCs ، يحتاج المرء إلى الحصول على الخلايا الأولية لإعادة برمجتها. تتمتع الخلايا المعزولة من البول بميزة أنه يمكن أخذ عينات منها بشكل غير جراحي من الرئيسيات ، وأنه يمكن إعادة برمجتها بسهولة ، ربما بسبب الملامح الجزيئية الشبيهة بالخلايا الجذعية15. ظروف الاستزراع للحفاظ على iPSCs الرئيسيات لا تقل أهمية عن إعادة البرمجة. من الناحية الكلاسيكية، تتطلب زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وسيطا غير محدد قائم على المصل وزراعة مشتركة للخلايا الليفية الجنينية للفأر - ما يسمى بالخلايا المغذية - التي توفر العناصر الغذائية الأساسية وسقالة للخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)16. منذ تطوير أنظمة الاستزراع المحددة كيميائيا والخالية من التغذية17,18 ، هناك الآن خيارات مختلفة لوسائط ومصفوفات الاستزراع iPSC المتاحة تجاريا. ومع ذلك ، فقد تم تحسين معظم ظروف الثقافة هذه ل ESCs البشرية و iPSCs ، وبالتالي قد تعمل بشكل أقل جودة في ثقافة NHP iPSC. في بروتوكول الفيديو هذا ، نقدم تعليمات لإنشاء وصيانة iPSCs البشرية و NHP المشتقة من زراعة الخلايا البولية.
منذ التقرير الأول لتوليد iPSC عن طريق التعبير القسري لعوامل محددة في الخلايا الليفية في عام 2006 ، تم تطبيق هذه الطريقة على العديد من أنواع الخلايا المختلفة من أصول مختلفة19،20،21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31، 32. من بينها ، يمكن الحصول على الخلايا المشتقة من البول فقط بطريقة غير جراحية تماما. استنادا إلى البروتوكول الموصوف سابقا من قبل Zhou et al.33 ، يمكن للمرء عزل وتوسيع الخلايا من بول الرئيسيات حتى من العينات غير المعقمة ، عن طريق استكمال المضادات الحيوية واسعة الطيف15. والجدير بالذكر أن الخلايا المشتقة من البول التي تم أخذ عينات منها بواسطة هذا البروتوكول تظهر إمكانات عالية لإنتاج iPSCs ، في غضون فترة زمنية أقصر (تصبح المستعمرات مرئية في 5-15 يوما) من إعادة البرمجة التقليدية للخلايا الليفية (20-30 يوما ، في تجربتنا) ، وبمعدل نجاح مرتفع بما فيه الكفاية. تم تصنيف هذه الخلايا المشتقة من البول على أنها مجموعة مختلطة من الخلايا الشبيهة بالخلايا الجذعية الوسيطة والخلايا الظهارية للمثانة ، مما تسبب في كفاءة إعادة برمجة عالية15.
بالإضافة إلى الاختلاف في الخلايا الأولية ، تختلف طرق إعادة البرمجة لإنشاء iPSCs أيضا وفقا للغرض من الاستخدام. تم تنفيذ إجراءات إعادة البرمجة التقليدية للخلايا الجسدية البشرية من خلال الإفراط في التعبير عن عوامل إعادة البرمجة مع ناقلات الفيروسات القهقرية أو الفيروسات العدسية ، مما سمح بدمج الحمض النووي الخارجي في الجينوم5،34،35. للحفاظ على iPSCs المتولدة سليمة جينيا ، طور الباحثون مجموعة متنوعة من الأنظمة غير التكاملية - ناقل PiggyBac القابل للاستئصال 36,37 ، الناقل العرضي38,39 ، نواقل الفيروسات غير المدمجة مثل فيروس سينداي 40 والفيروس الغدي 41 ، نقل mRNA 42 ، نقل البروتين 43,44 ، ومعالجة المركبات الكيميائية 45. نظرا للكفاءة وسهولة التعامل ، يتم استخدام ناقلات إعادة البرمجة المستندة إلى فيروس Sendai في هذا البروتوكول. يتم إجراء إصابة الخلايا الأولية في ثقافة تعليق 1 ساعة من الخلايا والفيروسات في تعدد العدوى (MOI) من 5 قبل الطلاء. يمكن أن تزيد هذه الخطوة المعدلة من احتمالية الاتصال بين أسطح الخلايا والفيروسات ، مقارنة بالطريقة التقليدية التي تضاف فيها الفيروسات مباشرة إلى ثقافة الخلايا الملتصقة ، وبالتالي تنتج المزيد من مستعمرات iPSC15.
يمكن إجراء تمرير الخلايا الجذعية البشرية و NHP متعددة القدرات عن طريق تمرير التكتل وتمرير الخلية الواحدة. حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) هو عامل مخلب فعال من حيث التكلفة يربط أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم ، وبالتالي يمنع النشاط الملتصق للكاديرين والانتغرين. يستخدم EDTA أيضا ككاشف تفكك انتقائي خفيف ، حيث تنفصل الخلايا غير المتمايزة قبل الخلايا المتمايزة بسبب جزيئات الالتصاق المختلفة. يؤدي التفكك الكامل إلى موت الخلايا الهائل ل iPSCs الرئيسيات عبر الملف الملفوف المرتبط ب Rho / Rho الذي يحتوي على بروتين كيناز (Rho / Rock) بوساطة فرط تنشيط الميوسين. لذلك ، فإن استكمال وسط الاستزراع بمثبط Rho / Rock ضروري للتجارب التي تتطلب خلايا مفردة في تعليق46,47. في هذا البروتوكول ، نوصي بتمرير التكتل كطريقة مرور روتينية ونوصي بتمرير خلية واحدة فقط عندما يكون ذلك ضروريا ، على سبيل المثال ، عندما يكون البذر لأرقام الخلايا المحددة مطلوبا ، أو أثناء الاستنساخ الفرعي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumax&#8482; cell detachment solution (Detachment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCR006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B-Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2941-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60064</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-122-965</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#8482; (Cell freezing medium)</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>BB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; II automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoKing&#174; 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)</td>
			<td>Sued-Laborbedarf</td>
			<td>52 95-0213</td>
			<td>Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 4&#39;,6-Diamidine-2&#39;-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 w L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15373541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>710524</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>188271-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 50 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10.8.2</td>
			<td>FlowJo&#160;</td>
			<td>663441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex&#8482; LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 240i CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16416639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus HeraSafe safety cabinet</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>51017905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>Version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL</td>
			<td>Nerbe Plus</td>
			<td>04-212-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1420</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-III Tubulin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR&#8482; 1</td>
			<td>STEMCELL Technolgies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4903S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocure&#8482; (Antimicrobial Reagent)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-noc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-4 Rabbit Antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2750S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 &#181;g/mL Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human PDGF-AB</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-00AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>4-16KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Growth Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4900S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 (MC813) Mouse mAb</td>
			<td>NEB</td>
			<td>4755S</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit&#174; Basic02</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>3821.00</td>
			<td>The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Precision GP 05</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>BYT-ORB153635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMC medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary urine medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC generation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and maintenance of primate induced pluripotent stem cells derived from urine

تعد الأساليب عبر الأنواع التي تدرس الخلايا الجذعية متعددة القدرات للرئيسيات ومشتقاتها ضرورية لفهم الآليات الجزيئية والخلوية للمرض والتطور والتطور بشكل أفضل. لجعل الوصول إلى الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الرئيسيات (iPSCs) أكثر سهولة ، تقدم هذه الورقة طريقة غير جراحية لتوليد iPSCs من الرئيسيات البشرية وغير البشرية من الخلايا المشتقة من البول ، وصيانتها باستخدام طريقة زراعة خالية من التغذية.
يمكن أخذ عينات من البول من بيئة غير معقمة (على سبيل المثال ، قفص الحيوان) ومعالجتها بكوكتيل مضاد حيوي واسع الطيف أثناء زراعة الخلايا الأولية لتقليل التلوث بكفاءة. بعد انتشار الخلايا المشتقة من البول ، يتم إنشاء iPSCs بواسطة طريقة نقل معدلة لنظام ناقل فيروس سينداي المتاح تجاريا. قد تكون مستعمرات iPSC الأولى مرئية بالفعل بعد 5 أيام ، ويمكن قطفها بعد 10 أيام على أقرب تقدير. يدعم تمرير التكتل الروتيني مع مخزن مؤقت للتفكك الخالي من الإنزيم تعدد قدرات iPSCs المتولدة لأكثر من 50 مقطعا.

عند عزل الخلايا عن بول الإنسان و NHP ، يمكن تحديد أنواع مختلفة من الخلايا مباشرة بعد العزل. تفرز الخلايا الحرشفية ، وكذلك الخلايا المستديرة الأصغر ، مع البول. يحتوي بول الإناث على خلايا حرشفية أكثر بكثير من بول الذكور (الشكل 1B - اليوم 0 ؛ الشكل التكميلي S1). بعد 5 أيام من...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine at JoVE.com

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

يصف البروتوكول الحالي طريقة لعزل وتوسيع وإعادة برمجة الخلايا المشتقة من بول الرئيسيات البشرية وغير البشرية إلى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، بالإضافة إلى تعليمات للصيانة الخالية من المغذيات للخلايا الجذعية المستحثة حديثا.

توليد وصيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالرئيسيات المشتقة من البول

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

تعتبر الرئيسيات IPSCs مفيدة ولكن غالبا ما يصعب الحصول عليها بسبب القضايا الأخلاقية والتقنية. يوفر هذا البروتوكول مسارا يسهل الوصول إليه لتوليد وصيانة IPSCs الرئيسيات. استخدام الخلايا البولية كمصدر أساسي ل IPSCs له ميزة كبيرة حيث يمكن الحصول عليها بطريقة غير جراحية تماما دون أي تقنيات خاصة.وستقوم جيسيكا رادمر ، طالبة دكتوراه من مختبر فولفغانغ إم إس ، بتوضيح الإجراء. للبدء ، الطرد المركزي أنبوب يحتوي على البول في 400G لمدة 10 دقائق. ثم استنشق بعناية طاف ، وترك ما يقرب من ملليلتر واحد في الأنبوب وإعادة تعليق بيليه فيه.اغسل الخلايا بإضافة 10 ملليلتر من محلول غسيل البول الذي يحتوي على الأمفوتريسين واخلط المعلق بعناية باستخدام ماصة مصلية. بعد الطرد المركزي ، استنشق بعناية طاف ، وترك ما يقرب من أقل من 0.2 ملليلتر في الأنبوب. أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من وسط البول الأساسي الذي يحتوي على الأمفوتريسين لكل 50 ملليلتر من البول المعالج في البداية.قم بإزالة الجيلاتين وأضف ملليلتر واحد من المعلق إلى بئر من الجيلاتين المطلي ب 12 صفيحة بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتحضير مصفوفة غشاء قاعدي مطلية ب 12 صفيحة بئر ، أضف 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي لكل بئر.حرك اللوحة لتوزيع السائل واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، استبدل مصفوفة الغشاء القاعدي ب 900 ميكرولتر من وسط REMC وقم بتخزينها عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. احسب حجم فيروسات سنداي اللازمة لتعدد العدوى بخمسة باستخدام المعادلة.قم بإذابة مكونات مجموعة إعادة برمجة Sendai بسرعة في حمام مائي مقسى عند 37 درجة مئوية. أضف وسط REMC لما مجموعه 100 ميكرولتر إلى أنبوب قبل إضافة الحجم المحسوب لفيروسات سينداي والخلط. بعد تفكك الخلايا البولية كما هو موضح في المخطوطة ، عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا وانقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنبوب 1.5 ملليلتر.الحصول على بيليه عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في 100 ميكرولتر من خليط فيروس سينداي المعدة. احتضان الأنبوب لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لعدوى التعليق. بعد الحضانة ، أضف REMC إلى ما مجموعه ملليلتر واحد قبل بذر تعليق الخلية في مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة ب 12 صفيحة بئر.بعد التحويل ، قم بتغيير الوسط كل يومين حتى يتم تطوير مستعمرات الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، أو IPSC ، مع التحول إلى وسيط توليد PSC في اليوم الخامس. عندما تنمو مستعمرات IPSC كبيرة بما يكفي لتمرير التكتل ، قم باستنشاق الوسط من الخلايا المستزرعة واغسل الخلايا بعناية باستخدام 500 ميكرولتر من DPBS. بعد إزالة DPBS ، أضف 500 ميكرولتر من 0.5 مليمول EDTA إلى البئر واحتضانها لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.راقب بعناية الخلايا الموجودة تحت المجهر حتى تبدأ المستعمرات في الانفصال. عندما تبدأ حواف المستعمرات في التقشر وتصبح الفجوات بين الخلايا مرئية ، قم بإزالة EDTA وأضف بعناية 500 ميكرولتر من DPBS. قم بنضح DPBS واغسل البئر ب 500 ميكرولتر من وسيط زراعة PSC باستخدام ماصة P-1000.ماصة صعودا وهبوطا لتفريق المستعمرات إلى كتل من الحجم المناسب. اعتمادا على الالتقاء ، والكثافة المطلوبة للخلايا المصنفة والتفضيل النسيلي IPSC ، قم بنقل 1/10 إلى 1/50 من تعليق كتلة الخلية إلى الآبار الجديدة. حرك اللوحة برفق ذهابا وإيابا عدة مرات لتوزيع الكتل بالتساوي في البئر.احتضن اللوحة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية للسماح للكتل بالالتصاق. قم بتغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تنمو المستعمرات بشكل كبير بما يكفي للمرور. بعد العزلة ، يمكن رؤية الخلايا الحرشفية والعديد من الخلايا المستديرة الأصغر التي تفرز مع البول.يمكن رؤية الخلايا المتكاثرة الأولى الملتصقة ، وتنمو هذه الخلايا لتصبح مستعمرات كبيرة يمكن مرورها. يمكن ملاحظة نوعين مختلفين من الخلايا، أحدهما له نمط ظاهري شبيه بالطلائية، والآخر يظهر نمطا ظاهريا أكثر شبها باللحمة المتوسطة وله شكل ممدود. بعد المقطع الأول ، تنمو الخلايا البولية كطبقة أحادية.خلال جيل IPSC ، يمكن رؤية بعض الخلايا الملتصقة وتبدأ هذه الخلايا في إظهار التغيرات المورفولوجية ، مما يشير إلى إعادة برمجة الخلايا. علاوة على ذلك ، تعرض الخلايا التي تشكل مستعمرات مورفولوجيا الخلايا الجذعية الجنينية النموذجية. تشترك جميع IPSCs التي تم إنشاؤها في مورفولوجيا مستعمرة شبيهة بالخلايا الجذعية الجنينية النموذجية ، والتي تتميز بخلايا معبأة بإحكام ذات حواف محددة بوضوح.تم استخدام الكيمياء المناعية لاختبار التعبير عن العلامات المرتبطة بتعدد القدرات في IPSCs الغوريلا. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن IPSCs إنسان الغاب التي تم تحليلها إيجابية ل TRA-1-60. علاوة على ذلك ، فإن IPSCs الغوريلا قادرة على التمايز إلى سلالات الأديم الباطن والأديم المتوسط والأديم الظاهر.تشير زيادة عدد الخلايا المتمايزة وفقدان سلامة الحدود وتوحيدها إلى ضعف جودة IPSC. في المقابل ، تشير الحدود المحددة والتعبئة الخلوية الضيقة والنواة البارزة إلى IPSCs عالية الجودة. نظرا للتغير الإكليلي ، يحتاج المرء إلى تحسين الظروف المحددة للاستنساخ مثل نسبة الانقسام وتوقيت المرور وحجم التكتل للحفاظ على نمو IPSCs الرئيسيات بصحة جيدة.كضوابط جودة ل IPSCs المعمول بها ، يمكن للمرء التحقق من الفاعلية المسبقة عن طريق تحريض التمايز المباشر أو غير المباشر مثل تمايز EV في المختبر ، إلى جانب التحقق من التعبير الجيني للعلامة.