Dit werk werd ondersteund door DFG EN 1093/5-1 (projectnummer 458247426). M.O. werd ondersteund door JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figuren zijn gemaakt met BioRender.com. Flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van de Core Facility Flow Cytometry in het Biomedical Center München. We willen Makoto Shida en Tomoyo Muto van ASHBi, Kyoto University, bedanken voor hun steun aan videografie.

Deze experimentele procedure werd goedgekeurd door de verantwoordelijke ethische commissie voor menselijke experimenten (20-122, Ethikkommission LMU München). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. OPMERKING: Goedkeuring moet worden verkregen van de juiste ethische commissie voordat wordt begonnen met experimenten met menselijke en NHP-monsters. Alle experimentele procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voors...

iPSC's zijn waardevolle celtypen omdat ze het mogelijk maken om anders ontoegankelijke celtypen in vitro te genereren. Omdat de uitgangsmaterialen voor herprogrammering, bijvoorbeeld fibroblasten, niet gemakkelijk beschikbaar zijn van alle primatensoorten, presenteert dit artikel een protocol voor het genereren van iPSC's uit van urine afgeleide cellen. Deze cellen kunnen op een niet-invasieve manier worden verkregen, zelfs uit niet-steriele urinemonsters van primaten, door het kweekmedium aan te vullen met bree...

Genomische vergelijkingen van menselijke en niet-menselijke primaten (NHP's) zijn cruciaal om onze evolutionaire geschiedenis en de evolutie van mensspecifieke eigenschappente begrijpen 1. Bovendien maken deze vergelijkingen de gevolgtrekking van functie mogelijk door geconserveerde DNA-sequenties2 te identificeren, bijvoorbeeld om prioriteit te geven aan ziektegerelateerde varianten3. Vergelijkingen van moleculaire fenotypes zoals genexpressieniveaus zijn cruciaal om genomische vergelijkingen beter te interpreteren en om bijvoorbeeld cellulaire fenotypische verschillen te ontdekken. Bovendien hebben ze - vergelijkbaar met vergelijkingen op DNA-niveau - het potentieel om functionele relevantie af te leiden, en dus om medisch relevante variatie binnen mensen beter te interpreteren4. De opname van uitgebreide moleculaire fenotypische gegevens in deze vergelijkende studies vereist geschikte biologische middelen (d.w.z. orthologe cellen tussen soorten). Ethische en praktische redenen maken het echter moeilijk of onmogelijk om toegang te krijgen tot dergelijke vergelijkbare cellen, vooral tijdens de ontwikkeling. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) maken het mogelijk om dergelijke ontoegankelijke celtypen in vitro5,6 te genereren, zijn experimenteel toegankelijk en zijn gebruikt voor primatenvergelijkingen 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Om iPSC's te genereren, moet men de primaire cellen verwerven die opnieuw moeten worden geprogrammeerd. Cellen geïsoleerd uit urine hebben het voordeel dat ze niet-invasief kunnen worden bemonsterd van primaten en dat ze gemakkelijk kunnen worden geherprogrammeerd, waarschijnlijk vanwege hun stamcelachtige moleculaire profielen15. De kweekomstandigheden om iPSC's van primaten in stand te houden zijn net zo belangrijk als herprogrammering; klassiek vereiste de kweek van menselijke pluripotente stamcellen een niet-gedefinieerd, op serum gebaseerd medium en co-cultuur van embryonale fibroblasten van muizen - zogenaamde feedercellen - die essentiële voedingsstoffen en een steiger voor embryonale stamcellen (SER's) leveren16. Sinds de ontwikkeling van chemisch gedefinieerde en feedervrije kweeksystemen17,18, zijn er nu verschillende opties van commercieel verkrijgbare iPSC-kweekmedia en -matrices. De meeste van deze kweekomstandigheden zijn echter geoptimaliseerd voor menselijke SER's en iPSC's en werken daarom mogelijk minder goed in de NHP iPSC-cultuur. In dit videoprotocol geven we instructies voor het genereren en onderhouden van menselijke en NHP iPSC's afgeleid van urinecelkweek.
Sinds het eerste rapport van iPSC-generatie door de geforceerde expressie van gedefinieerde factoren in fibroblasten in 2006, is deze methode toegepast op veel verschillende celtypen van verschillende oorsprong 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Onder hen kunnen alleen van urine afgeleide cellen op een volledig niet-invasieve manier worden verkregen. Op basis van het eerder beschreven protocol van Zhou et al.33 kan men cellen isoleren en uitbreiden uit de urine van primaten, zelfs uit niet-steriele monsters, door breedspectrumantibiotica aan te vullen15. Met name urine-afgeleide cellen bemonsterd door dit protocol vertonen een hoog potentieel om iPSC's te produceren, binnen een kortere periode (kolonies worden zichtbaar in 5-15 dagen) dan de conventionele herprogrammering van fibroblasten (20-30 dagen, in onze ervaring), en met een voldoende hoog slagingspercentage. Deze van urine afgeleide cellen werden geclassificeerd als de gemengde populatie van mesenchymale stamcelachtige cellen en blaasepitheelcellen, waardoor de hoge herprogrammeringsefficiëntie werd veroorzaakt15.
Naast de variatie in primaire cellen, variëren de herprogrammeringsmethoden om iPSC's te genereren ook afhankelijk van het doel van het gebruik. Conventionele herprogrammeringsprocedures voor menselijke somatische cellen werden uitgevoerd door de overexpressie van herprogrammeringsfactoren met retrovirus- of lentivirusvectoren, waardoor de integratie van exogene DNA in het genoom 5,34,35 mogelijk werd. Om de gegenereerde iPSC's genomisch intact te houden, hebben onderzoekers een breed scala aan niet-integratiesystemen ontwikkeld - excisable PiggyBac-vector36,37, episomale vector38,39, niet-integrerende virusvectoren zoals Sendai-virus40 en adenovirus 41, mRNA-transfectie 42, eiwittransfectie 43,44 en behandeling met chemische verbindingen 45. Vanwege de efficiëntie en het gemak in de hantering, worden de Sendai-virusgebaseerde herprogrammeringsvectoren gebruikt in dit protocol. Infectie van primaire cellen wordt uitgevoerd in een 1 h suspensiecultuur van cellen en virussen met een multipliciteit van infectie (MOI) van 5 voorafgaand aan plating. Deze aangepaste stap zou de kans op contact tussen celoppervlakken en virussen kunnen vergroten, vergeleken met de conventionele methode waarbij de virussen rechtstreeks aan de aanhangende celcultuur worden toegevoegd en dus meer iPSC-kolonies opleveren15.
Passaging van menselijke en NHP pluripotente stamcellen kan worden gedaan door klonterpassing en eencellige passaging. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) is een kostenefficiënte chelaatvormer die calcium- en magnesiumionen bindt en zo de hechtende activiteit van cadherine en integrine voorkomt. EDTA wordt ook gebruikt als een mild, selectief dissociatiereagens, omdat ongedifferentieerde cellen zich losmaken voor gedifferentieerde cellen vanwege hun verschillende adhesiemoleculen. Volledige dissociatie induceert massale celdood van iPSC's van primaten via de Rho / Rho-geassocieerde coiled coil met eiwitkinase (Rho / Rock) -gemedieerde myosinehyperactivatie. Daarom is het aanvullen van het kweekmedium met een Rho/Rock-remmer essentieel voor experimenten waarbij enkele cellen in suspensie nodig zijn46,47. In dit protocol raden we clump passaging aan als de routinematige passaging-methode en bevelen we single-cell passaging alleen aan wanneer dit nodig is, bijvoorbeeld wanneer seeding van gedefinieerde celnummers vereist is, of tijdens sub-cloning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumax&#8482; cell detachment solution (Detachment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCR006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B-Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2941-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60064</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-122-965</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#8482; (Cell freezing medium)</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>BB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; II automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoKing&#174; 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)</td>
			<td>Sued-Laborbedarf</td>
			<td>52 95-0213</td>
			<td>Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 4&#39;,6-Diamidine-2&#39;-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 w L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15373541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>710524</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>188271-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 50 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10.8.2</td>
			<td>FlowJo&#160;</td>
			<td>663441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex&#8482; LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 240i CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16416639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus HeraSafe safety cabinet</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>51017905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>Version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL</td>
			<td>Nerbe Plus</td>
			<td>04-212-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1420</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-III Tubulin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR&#8482; 1</td>
			<td>STEMCELL Technolgies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4903S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocure&#8482; (Antimicrobial Reagent)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-noc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-4 Rabbit Antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2750S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 &#181;g/mL Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human PDGF-AB</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-00AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>4-16KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Growth Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4900S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 (MC813) Mouse mAb</td>
			<td>NEB</td>
			<td>4755S</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit&#174; Basic02</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>3821.00</td>
			<td>The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Precision GP 05</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>BYT-ORB153635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMC medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary urine medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC generation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and maintenance of primate induced pluripotent stem cells derived from urine

Cross-species benaderingen die primaat pluripotente stamcellen en hun derivaten bestuderen, zijn cruciaal om de moleculaire en cellulaire mechanismen van ziekte, ontwikkeling en evolutie beter te begrijpen. Om primaat geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) toegankelijker te maken, presenteert dit artikel een niet-invasieve methode om menselijke en niet-menselijke primaat iPSC's te genereren uit urine-afgeleide cellen, en hun onderhoud met behulp van een feeder-vrije kweekmethode.
De urine kan worden bemonsterd vanuit een niet-steriele omgeving (bijvoorbeeld de kooi van het dier) en worden behandeld met een breedspectrum antibioticacocktail tijdens de primaire celkweek om besmetting efficiënt te verminderen. Na voortplanting van de van urine afgeleide cellen worden iPSC's gegenereerd door een aangepaste transductiemethode van een in de handel verkrijgbaar Sendai-virusvectorsysteem. Eerste iPSC-kolonies kunnen al na 5 dagen zichtbaar zijn en kunnen op zijn vroegst na 10 dagen worden geplukt. Routinematige klomppassage met enzymvrije dissociatiebuffer ondersteunt de pluripotentie van de gegenereerde iPSC's gedurende meer dan 50 passages.

Bij het isoleren van cellen uit menselijke en NHP-urine kunnen verschillende soorten cellen direct na isolatie worden geïdentificeerd. Plaveiselcellen, evenals verschillende kleinere ronde cellen, worden uitgescheiden met de urine; vrouwelijke urine bevat veel meer plaveiselcellen dan mannelijke urine (figuur 1B - dag 0; Aanvullende figuur S1). Na 5 dagen kweek in primair urinemedium zijn de eerste aanhangende prolifererende cellen te zien (figuur 1A,B<...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine at JoVE.com

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Het huidige protocol beschrijft een methode om menselijke en niet-menselijke van primaten urine-afgeleide cellen te isoleren, uit te breiden en te herprogrammeren tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), evenals instructies voor feedervrij onderhoud van de nieuw gegenereerde iPSC's.

Generatie en onderhoud van door primaten geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

IPSC's van primaten zijn nuttig, maar vaak moeilijk te verkrijgen vanwege ethische en technische kwesties. Dit protocol biedt een zo toegankelijk mogelijk pad voor het genereren en onderhouden van IPSC's van primaten. Het gebruik van urinecellen als primaire bron van IPSC's heeft een groot voordeel omdat ze op een volledig niet-invasieve manier kunnen worden verkregen zonder speciale technieken.De procedure wordt gedemonstreerd door Jessica Radmer, een promovendus van Wolfgang M.S.Laboratory. Om te beginnen, centrifugeer de urine bevattende buis op 400G gedurende 10 minuten. Zuig vervolgens voorzichtig het supernatant op, laat ongeveer één milliliter in de buis achter en resuspensie de pellet erin.Was de cellen door 10 milliliter urinewasbuffer met amfotericine toe te voegen en meng de suspensie voorzichtig met behulp van een serologische pipet. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op, waardoor er ongeveer minder dan 0,2 milliliter in de buis achterblijft. Resuspendie van de celkorrel in één milliliter primair urinemedium met amfotericine per 50 milliliter initieel verwerkte urine.Verwijder gelatine en voeg een milliliter van de suspensie toe aan een put met gelatine gecoate 12-putplaat. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Om een keldermembraanmatrix gecoat 12 putplaat te bereiden, voegt u 500 microliter keldermembraanmatrix per put toe.Verplaats de plaat om de vloeistof te verdelen en incuber deze gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Vervang na incubatie de keldermembraanmatrix door 900 microliter REMC-medium en bewaar deze bij 37 graden Celsius tot gebruik. Bereken het volume van Sendai-virussen dat nodig is voor een veelvoud aan infecties van vijf met behulp van de vergelijking.Ontdooi snel de componenten van de Sendai-herprogrammeringskit in het waterbad getemperd op 37 graden Celsius. Voeg REMC-medium voor een totaal van 100 microliter toe aan een buis voordat u het berekende volume van Sendai-virussen toevoegt en mengt. Na dissociatie van de urinecellen zoals beschreven in het manuscript, telt u de cellen met behulp van de celteller en brengt u het gewenste aantal cellen over naar een buis van 1,5 milliliter.Verkrijg de pellet door centrifugeren en resuspensie in 100 microliter van het bereide Sendai-virusmengsel. Incubeer de buis gedurende een uur bij 37 graden Celsius voor suspensie-infectie. Voeg na incubatie REMC toe aan een totaal van één milliliter voordat u de celsuspensie zaait in de keldermembraanmatrix gecoate 12-putplaat.Verander na transductie het medium om de dag tot de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen, of IPSC, kolonies met overschakeling naar PSC-generatiemedium op dag vijf. Wanneer de IPSC-kolonies groot genoeg worden voor klonterpassage, zuigt u het medium uit de gekweekte cellen en wast u de cellen zorgvuldig met 500 microliter DPBS. Voeg na het verwijderen van de DPBS 500 microliter 0,5 millimolar EDTA toe aan de put en incubeer gedurende twee tot vijf minuten.Observeer de cellen zorgvuldig onder de microscoop totdat de kolonies beginnen los te komen. Wanneer de randen van de kolonies beginnen af te pellen en openingen tussen de cellen zichtbaar worden, verwijdert u de EDTA en voegt u voorzichtig 500 microliter DPBS toe. Zuig de DPBS aan en spoel de put met 500 microliter PSC-kweekmedium met behulp van een P-1000-pipet.Pipetteer op en neer om de kolonies te verspreiden in klonten van de juiste grootte. Afhankelijk van de samenvloeiing, de gewenste dichtheid van de gezaaide cellen en IPSC-klonale voorkeur, wordt 1/10 tot 1/50 van de celklompsuspensie overgebracht naar de nieuwe putten. Beweeg de plaat voorzichtig een paar keer heen en weer om de klonten gelijkmatig in de put te verdelen.Incubeer de plaat minstens 30 minuten bij 37 graden Celsius om de klonten te laten hechten. Verander het medium om de twee tot drie dagen totdat de kolonies groot genoeg worden om te passeren. Na isolatie zijn plaveiselcellen en verschillende kleinere ronde cellen te zien die met de urine zijn uitgescheiden.De eerste aanhangende prolifererende cellen zijn te zien en deze cellen groeien uit tot grote kolonies die kunnen worden doorgelaten. Er zijn twee verschillende celtypen te zien, één met een epitheliaalachtig fenotype en de andere met een meer mesenchymaal fenotype met langwerpige vorm. Na de eerste passage groeien urinecellen als een monolaag.Tijdens de generatie van IPSC zijn enkele aanhangende cellen te zien en deze cellen beginnen morfologische veranderingen te vertonen, wat wijst op herprogrammering van de cellen. Verder vertonen de cellen die kolonies vormen de typische embryonale stamcelmorfologie. Alle gegenereerde IPSC's delen de typische embryonale stamcelachtige koloniemorfologie, gekenmerkt door dicht opeengepakte cellen met duidelijk gedefinieerde randen.Immunocytochemie werd gebruikt om de expressie van pluripotentie geassocieerde markers in gorilla IPSC's te testen. Bovendien toonde flowcytometrie-analyse aan dat de geanalyseerde orang-oetan IPSC's positief zijn voor TRA-1-60. Bovendien zijn de gorilla IPSC's in staat om te differentiëren in endoderm, mesoderm en ectoderm afstamming.Een verhoogd aantal gedifferentieerde cellen en een verlies van grensintegriteit en uniformiteit wijzen op een slechte IPSC-kwaliteit. Gedefinieerde randen, strakke cellulaire verpakkingen en prominente nucleoli betekenen daarentegen IPSC's van hoge kwaliteit. Vanwege de coronale variabiliteit moet men de kloonspecifieke omstandigheden optimaliseren, zoals de splitsingsverhouding, passagetiming en klompgrootte om ipsc's van primaten gezond te houden.Als kwaliteitscontroles van gevestigde IPSC's kan men de pre-potentie verifiëren door directe of indirecte differentiatie-inductie zoals in vitro EV-differentiatie, naast het controleren van markergenexpressie.