Diese Arbeit wurde von der DFG EN 1093/5-1 (Projektnummer 458247426) gefördert. M.O. wurde durch das JSPS Overseas Research Fellowship unterstützt. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt. Die Durchflusszytometrie wurde mit Hilfe der Core Facility Durchflusszytometrie am Biomedizinischen Zentrum München durchgeführt. Wir bedanken uns bei Makoto Shida und Tomoyo Muto von der ASHBi, Kyoto University, für die Unterstützung der Videografie.

Dieses experimentelle Verfahren wurde von der zuständigen Ethikkommission für Menschenversuche (20-122, Ethikkommission LMU München) genehmigt. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. HINWEIS: Vor Beginn von Experimenten, die sich mit menschlichen und NHP-Proben befassen, muss die Genehmigung der zuständigen Ethikkommission eingeholt werden. Alle experimentellen Verfahren müssen in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorsch...

iPS-Zellen sind wertvolle Zelltypen, da sie die Erzeugung von sonst unzugänglichen Zelltypen in vitro ermöglichen. Da die Ausgangsmaterialien für die Reprogrammierung, z.B. Fibroblasten, nicht von allen Primatenarten leicht verfügbar sind, wird in dieser Arbeit ein Protokoll für die Generierung von iPS-Zellen aus Urinzellen vorgestellt. Diese Zellen können nicht-invasiv gewonnen werden, auch aus unsterilen Urinproben von Primaten, indem das Nährmedium mit Breitbandantibiotika ergänzt wird.
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Genomische Vergleiche von menschlichen und nicht-menschlichen Primaten (NHPs) sind entscheidend, um unsere Evolutionsgeschichte und die Evolution menschenspezifischer Merkmale zu verstehen1. Darüber hinaus ermöglichen diese Vergleiche den Rückschluss auf die Funktion durch die Identifizierung konservierter DNA-Sequenzen2, z. B. um krankheitsassoziierte Varianten3 zu priorisieren. Vergleiche von molekularen Phänotypen, wie z.B. Genexpressionsniveaus, sind entscheidend, um genomische Vergleiche besser interpretieren zu können und z.B. zelluläre phänotypische Unterschiede zu entdecken. Darüber hinaus haben sie - ähnlich wie Vergleiche auf DNA-Ebene - das Potenzial, auf funktionelle Relevanz zu schließen und damit medizinisch relevante Variationen innerhalb des Menschen besser zu interpretieren4. Die Einbeziehung umfassender molekularphänotypischer Daten in diese Vergleichsstudien erfordert geeignete biologische Ressourcen (d.h. orthologe Zellen über Spezies hinweg). Ethische und praktische Gründe erschweren oder verunmöglichen jedoch den Zugang zu solchen vergleichbaren Zellen, insbesondere während der Entwicklung. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) ermöglichen die Generierung solcher unzugänglichen Zelltypen in vitro5,6, sind experimentell zugänglich und wurden für Primatenvergleicheverwendet 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Um iPS-Zellen zu erzeugen, muss man die Primärzellen erfassen, die neu programmiert werden sollen. Aus Urin isolierte Zellen haben den Vorteil, dass sie nicht-invasiv von Primaten entnommen werden können und dass sie leicht umprogrammiert werden können, wahrscheinlich aufgrund ihrer stammzellähnlichen molekularen Profile15. Die Kulturbedingungen für die Erhaltung von Primaten-iPS-Zellen sind ebenso wichtig wie die Reprogrammierung. Klassischerweise erforderte die Kultivierung menschlicher pluripotenter Stammzellen ein nicht definiertes, serumbasiertes Medium und eine Kokultur von embryonalen Fibroblasten der Maus - sogenannten Feederzellen -, die essentielle Nährstoffe und ein Gerüst für embryonale Stammzellen (ESCs) liefern16. Seit der Entwicklung chemisch definierter und feederfreier Kultursysteme17,18 gibt es heute verschiedene Optionen für kommerziell erhältliche iPSC-Nährmedien und -Matrices. Die meisten dieser Kulturbedingungen wurden jedoch für humane ES-Zellen und iPS-Zellen optimiert und funktionieren daher möglicherweise weniger gut in der NHP-iPSC-Kultur. In diesem Videoprotokoll geben wir Anweisungen zur Erzeugung und Pflege von humanen und NHP-iPS-Zellen, die aus Zellkulturen im Urin gewonnen werden.
Seit dem ersten Bericht über die Erzeugung von iPS-Zellen durch die erzwungene Expression definierter Faktoren in Fibroblasten im Jahr 2006 wurde diese Methode auf viele verschiedene Zelltypen unterschiedlicher Herkunft angewendet 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Von ihnen können nur aus Urin gewonnene Zellen auf völlig nicht-invasive Weise gewonnen werden. Basierend auf dem zuvor beschriebenen Protokoll von Zhou et al.33 kann man Zellen aus Primatenurin auch aus unsterilen Proben isolieren und expandieren, indem man Breitbandantibiotika ergänzt15. Bemerkenswert ist, dass Urinzellen, die mit diesem Protokoll beprobt wurden, ein hohes Potenzial zur Produktion von iPS-Zellen aufweisen, und zwar innerhalb eines kürzeren Zeitraums (Kolonien werden in 5-15 Tagen sichtbar) als die herkömmliche Reprogrammierung von Fibroblasten (20-30 Tage, unserer Erfahrung nach) und mit einer ausreichend hohen Erfolgsrate. Diese aus dem Urin gewonnenen Zellen wurden als gemischte Population von mesenchymalen Stammzell-ähnlichen Zellen und Blasenepithelzellen klassifiziert, was die hohe Reprogrammierungseffizienz verursacht15.
Neben der Variation in den Primärzellen variieren auch die Reprogrammierungsmethoden zur Erzeugung von iPS-Zellen je nach Verwendungszweck. Konventionelle Reprogrammierungsverfahren für menschliche somatische Zellen wurden durch die Überexpression von Reprogrammierungsfaktoren mit Retrovirus- oder Lentivirus-Vektoren durchgeführt, was die Integration exogener DNA in das Genom ermöglichte 5,34,35. Um die erzeugten iPS-Zellen genomisch intakt zu halten, haben die Forscher eine Vielzahl von Nicht-Integrationssystemen entwickelt - den exzisierbaren PiggyBac-Vektor 36,37, den episomalen Vektor38,39, nicht-integrierende Virusvektoren wie das Sendai-Virus 40 und das Adenovirus 41, die mRNA-Transfektion 42, die Proteintransfektion 43,44 und die Behandlung mit chemischen Verbindungen 45. Aufgrund der Effizienz und einfachen Handhabung werden in diesem Protokoll die auf dem Sendai-Virus basierenden Reprogrammierungsvektoren verwendet. Die Infektion der Primärzellen erfolgt in einer 1-stündigen Suspensionskultur von Zellen und Viren bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 vor der Plattierung. Dieser modifizierte Schritt könnte die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts zwischen Zelloberflächen und Viren im Vergleich zu der herkömmlichen Methode, bei der die Viren direkt in die adhärente Zellkultur gegeben werden, erhöhen und so mehr iPSC-Kolonien ergeben15.
Die Passage von humanen und NHP-pluripotenten Stammzellen kann durch Klumpen- und Einzelzellpassage erfolgen. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist ein kostengünstiger Chelatbildner, der Calcium- und Magnesiumionen bindet und so die Adhärentaktivität von Cadherin und Integrin verhindert. EDTA wird auch als mildes, selektives Dissoziationsreagenz verwendet, da sich undifferenzierte Zellen aufgrund ihrer unterschiedlichen Adhäsionsmoleküle vor differenzierten Zellen ablösen. Die vollständige Dissoziation induziert einen massiven Zelltod von Primaten-iPS-Zellen über die Rho/Rho-assoziierte Coiled-Coil-haltige Proteinkinase (Rho/Rock)-vermittelte Myosin-Hyperaktivierung. Daher ist die Ergänzung des Nährmediums mit einem Rho/Rock-Inhibitor für Experimente, die Einzelzellen in Suspension erfordern, unerlässlich46,47. In diesem Protokoll empfehlen wir die Klumpenpassage als routinemäßige Passaging-Methode und empfehlen die Einzelzell-Passage nur, wenn dies erforderlich ist, z. B. wenn das Seeding definierter Zellzahlen erforderlich ist, oder während der Subklonen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumax&#8482; cell detachment solution (Detachment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCR006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B-Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2941-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60064</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-122-965</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#8482; (Cell freezing medium)</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>BB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; II automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoKing&#174; 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)</td>
			<td>Sued-Laborbedarf</td>
			<td>52 95-0213</td>
			<td>Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 4&#39;,6-Diamidine-2&#39;-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 w L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15373541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>710524</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>188271-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 50 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10.8.2</td>
			<td>FlowJo&#160;</td>
			<td>663441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex&#8482; LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 240i CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16416639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus HeraSafe safety cabinet</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>51017905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>Version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL</td>
			<td>Nerbe Plus</td>
			<td>04-212-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1420</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-III Tubulin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR&#8482; 1</td>
			<td>STEMCELL Technolgies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4903S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocure&#8482; (Antimicrobial Reagent)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-noc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-4 Rabbit Antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2750S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 &#181;g/mL Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human PDGF-AB</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-00AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>4-16KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Growth Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4900S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 (MC813) Mouse mAb</td>
			<td>NEB</td>
			<td>4755S</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit&#174; Basic02</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>3821.00</td>
			<td>The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Precision GP 05</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>BYT-ORB153635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMC medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary urine medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC generation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and maintenance of primate induced pluripotent stem cells derived from urine

Speziesübergreifende Ansätze zur Untersuchung pluripotenter Stammzellen von Primaten und ihrer Derivate sind von entscheidender Bedeutung, um die molekularen und zellulären Mechanismen von Krankheit, Entwicklung und Evolution besser zu verstehen. Um den Zugang zu Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu erleichtern, wird in dieser Arbeit eine nicht-invasive Methode zur Erzeugung von humanen und nicht-humanen Primaten-iPS-Zellen aus aus aus dem Urin gewonnenen Zellen und deren Erhaltung mit einer feederfreien Kultivierungsmethode vorgestellt.
Der Urin kann aus einer unsterilen Umgebung (z. B. dem Käfig des Tieres) entnommen und während der primären Zellkultur mit einem Breitband-Antibiotika-Cocktail behandelt werden, um die Kontamination effizient zu reduzieren. Nach der Vermehrung der aus dem Urin gewonnenen Zellen werden iPS-Zellen durch eine modifizierte Transduktionsmethode eines kommerziell erhältlichen Sendai-Virus-Vektorsystems erzeugt. Erste iPSC-Kolonien können bereits nach 5 Tagen sichtbar sein und frühestens nach 10 Tagen gepflückt werden. Die routinemäßige Klumpenpassage mit enzymfreiem Dissoziationspuffer unterstützt die Pluripotenz der erzeugten iPSCs für mehr als 50 Passagen.

Bei der Isolierung von Zellen aus menschlichem und NHP-Urin können verschiedene Zelltypen direkt nach der Isolierung identifiziert werden. Plattenepithelzellen sowie verschiedene kleinere runde Zellen werden mit dem Urin ausgeschieden; Der weibliche Urin enthält weitaus mehr Plattenepithelzellen als der männliche Urin (Abbildung 1B - Tag 0; Ergänzende Abbildung S1). Nach 5-tägiger Kultivierung im primären Urinmedium sind die ersten adhärenten proliferierenden Zellen z...

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Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Expansion und Reprogrammierung von humanen und nicht-humanen Zellen aus dem Urin von Primaten zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sowie Anweisungen zur feederfreien Aufrechterhaltung der neu erzeugten iPS-Zellen.

Erzeugung und Erhaltung von Primaten-induzierten pluripotenten Stammzellen aus Urin

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

IPSCs für Primaten sind nützlich, aber aufgrund ethischer und technischer Probleme oft schwer zu beschaffen. Dieses Protokoll bietet einen möglichst zugänglichen Weg zur Generierung und Wartung von Primaten-IPSCs. Die Verwendung von Harnzellen als primäre Quelle für IPSCs hat einen großen Vorteil, da sie auf völlig nicht-invasive Weise ohne spezielle Techniken gewonnen werden können.Das Verfahren wird von Jessica Radmer, Doktorandin am Wolfgang-M.S.Labor, demonstriert. Zentrifugieren Sie zunächst das Urinröhrchen bei 400 G für 10 Minuten. Saugen Sie dann den Überstand vorsichtig ab, lassen Sie etwa einen Milliliter im Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet darin.Waschen Sie die Zellen, indem Sie 10 Milliliter Urinwaschpuffer hinzufügen, der Amphotericin enthält, und mischen Sie die Suspension vorsichtig mit einer serologischen Pipette. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand vorsichtig abgesaugt, wobei etwa weniger als 0,2 Milliliter im Röhrchen verbleiben. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter primärem Urinmedium, das Amphotericin enthält, pro 50 Milliliter anfänglich verarbeiteten Urins.Entfernen Sie die Gelatine und geben Sie einen Milliliter der Suspension in eine mit Gelatine beschichtete 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Um eine mit einer Basalmembranmatrix beschichtete 12-Well-Platte herzustellen, fügen Sie 500 Mikroliter Basalmembranmatrix pro Well hinzu.Bewegen Sie die Platte, um die Flüssigkeit zu verteilen, und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach der Inkubation die Basalmembranmatrix durch 900 Mikroliter REMC-Medium und lagern Sie sie bis zur Verwendung bei 37 Grad Celsius. Berechnen Sie das Volumen der Sendai-Viren, die für eine Vielzahl von Infektionen benötigt werden, indem Sie die Gleichung verwenden.Tauen Sie die Komponenten des Sendai-Umprogrammierungskits schnell im 37 Grad Celsius temperierten Wasserbad auf. Geben Sie REMC-Medium für insgesamt 100 Mikroliter in ein Röhrchen, bevor Sie das berechnete Volumen an Sendai-Viren hinzufügen und mischen. Nach der Dissoziation der Harnzellen, wie im Manuskript beschrieben, werden die Zellen mit dem Zellzähler gezählt und die gewünschte Anzahl von Zellen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen übertragen.Das Pellet wird durch Zentrifugation gewonnen und in 100 Mikrolitern der vorbereiteten Sendai-Virusmischung resuspendiert. Inkubieren Sie das Röhrchen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius für eine Suspensionsinfektion. Nach der Inkubation wird REMC zu insgesamt einem Milliliter hinzugefügt, bevor die Zellsuspension in die mit der Basalmembranmatrix beschichtete 12-Well-Platte eingesät wird.Nach der Transduktion wird das Medium jeden zweiten Tag gewechselt, bis sich induzierte pluripotente Stammzellen (IPSC) entwickelt haben, wobei am fünften Tag auf PSC-Erzeugungsmedium umgestellt wird. Wenn die IPSC-Kolonien groß genug sind, um Klumpen zu verklumpen, saugen Sie das Medium aus den kultivierten Zellen ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 500 Mikrolitern DPBS. Nach dem Entfernen des DPBS werden 500 Mikroliter 0,5 Millimolar EDTA in die Vertiefung gegeben und zwei bis fünf Minuten inkubiert.Beobachten Sie die Zellen sorgfältig unter dem Mikroskop, bis sich die Kolonien zu lösen beginnen. Wenn sich die Ränder der Kolonien abzulösen beginnen und Lücken zwischen den Zellen sichtbar werden, entfernen Sie das EDTA und fügen Sie vorsichtig 500 Mikroliter DPBS hinzu. Saugen Sie das DPBS ab und spülen Sie die Vertiefung mit 500 Mikrolitern PSC-Nährmedium mit einer P-1000-Pipette.Pipettieren Sie auf und ab, um die Kolonien in Klumpen geeigneter Größe zu zerstreuen. Abhängig von der Konfluenz, der gewünschten Dichte der ausgesäten Zellen und der IPSC-Klonpräferenz werden 1/10 bis 1/50 der Zellklumpensuspension in die neuen Vertiefungen übertragen. Bewegen Sie die Platte mehrmals vorsichtig hin und her, um die Klumpen gleichmäßig in der Vertiefung zu verteilen.Inkubieren Sie die Platte mindestens 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit sich die Klumpen festsetzen können. Wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis die Kolonien groß genug sind, um durchzugehen. Nach der Isolierung sind Plattenepithelzellen und verschiedene kleinere runde Zellen zu sehen, die mit dem Urin ausgeschieden wurden.Die ersten adhärenten proliferierenden Zellen sind zu sehen, und diese Zellen wachsen zu großen Kolonien heran, die durchquert werden können. Es sind zwei unterschiedliche Zelltypen zu sehen, einer mit einem epithelialen Phänotyp und der andere mit einem eher mesenchymalen Phänotyp mit länglicher Form. Nach der ersten Passage wachsen die Harnzellen als Monoschicht.Während der IPSC-Generierung sind einige adhärente Zellen zu sehen, die beginnen, morphologische Veränderungen zu zeigen, was auf eine Reprogrammierung der Zellen hinweist. Darüber hinaus weisen die Zellen, die Kolonien bilden, die typische embryonale Stammzellmorphologie auf. Allen generierten IPSCs gemeinsam ist die typische embryonale stammzellähnliche Koloniemorphologie, die durch dicht gepackte Zellen mit klar definierten Rändern gekennzeichnet ist.Immunzytochemie wurde verwendet, um die Expression von Pluripotenz-assoziierten Markern in Gorilla-IPSCs zu testen. Darüber hinaus zeigte die durchflusszytometrische Analyse, dass die analysierten Orang-Utan-IPSCs positiv für TRA-1-60 sind. Darüber hinaus sind die IPSCs der Gorillas in der Lage, sich in Endoderm-, Mesoderm- und Ektodermlinien zu differenzieren.Eine erhöhte Anzahl differenzierter Zellen und ein Verlust der Grenzintegrität und Homogenität deuten auf eine schlechte IPSC-Qualität hin. Im Gegensatz dazu deuten definierte Grenzen, dichte zelluläre Verpackungen und prominente Nukleolen auf qualitativ hochwertige IPSCs hin. Aufgrund der koronalen Variabilität müssen die klonspezifischen Bedingungen wie das Spaltungsverhältnis, das Passagetiming und die Klumpengröße optimiert werden, um das Wachstum der Primaten-IPSCs gesund zu halten.Als Qualitätskontrollen etablierter IPSCs kann neben der Überprüfung der Markergenexpression auch die Präpotenz durch direkte oder indirekte Differenzierungsinduktion wie z.B. in vitro EV-Differenzierung verifiziert werden.