עבודה זו נתמכה על-ידי DFG EN 1093/5-1 (מספר פרויקט מספר 458247426). M.O. נתמך על ידי JSPS Overseas Research Fellowship. כל הדמויות נוצרו עם BioRender.com. ציטומטריית זרימה בוצעה בעזרת ציטומטריית זרימה של מתקן הליבה במרכז הביו-רפואי במינכן. ברצוננו להודות למאקוטו שידה ולטומויו מוטו מ-ASHBi, אוניברסיטת קיוטו, על התמיכה בווידיאוגרפיה.

הליך ניסויי זה אושר על ידי הוועדה האתית האחראית לניסויים בבני אדם (20-122, Ethikkommission LMU München). כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. הערה: יש לקבל אישור מהוועדה האתית המתאימה לפני תחילת ניסויים העוסקים בדגימות אנושיות ודגימות NHP. כל הליכי הניסוי חייבים להתבצע בהתאם להנחיות ולתקנ...

iPSCs הם סוגי תאים יקרי ערך מכיוון שהם מאפשרים יצירה של סוגי תאים שאינם נגישים אחרת במבחנה. מכיוון שחומרי המוצא לתכנות מחדש, למשל, פיברובלסטים אינם זמינים בקלות מכל מיני הפרימטים, מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת iPSCs מתאים שמקורם בשתן. תאים אלה יכולים להתקבל באופן לא פולשני, אפילו מדגימות שת?...

השוואות גנומיות של פרימטים אנושיים ולא אנושיים (NHPs) חיוניות להבנת ההיסטוריה האבולוציונית שלנו והאבולוציה של תכונות ספציפיות לבני אדם1. בנוסף, השוואות אלה מאפשרות להסיק את התפקוד על ידי זיהוי רצפי דנ"א שמורים2, למשל, כדי לתעדף וריאנטים הקשורים למחלה3. השוואות של פנוטיפים מולקולריים כגון רמות ביטוי גנים חיוניות כדי לפרש טוב יותר השוואות גנומיות ולגלות, למשל, הבדלים פנוטיפיים תאיים. יתר על כן, יש להם - בדומה להשוואות ברמת הדנ"א - פוטנציאל להסיק רלוונטיות תפקודית, ומכאן לפרש טוב יותר שונות רלוונטית מבחינה רפואית בתוך בני אדם4. שילוב נתונים פנוטיפיים מולקולריים מקיפים במחקרים השוואתיים אלה דורש משאבים ביולוגיים מתאימים (כלומר, תאים אורתולוגיים בין מינים). עם זאת, סיבות אתיות ומעשיות מקשות או בלתי אפשריות על גישה לתאים דומים כאלה, במיוחד במהלך ההתפתחות. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מאפשרים יצירה של סוגי תאים בלתי נגישים כאלה במבחנה 5,6, נגישים בניסוי, ושימשו להשוואות פרימטים6,7,8,9,10,11,12,13,14.
כדי ליצור iPSCs, יש לרכוש את התאים העיקריים כדי להיות מתוכנתים מחדש. לתאים שבודדו משתן יש יתרון בכך שניתן לדגום אותם באופן לא פולשני מפרימטים, וכי ניתן לתכנת אותם מחדש בקלות, כנראה בשל הפרופיל המולקולרי דמוי תאי הגזע שלהם15. תנאי התרבית לשמירה על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים של פרימטים חשובים לא פחות מתכנות מחדש; באופן קלאסי, תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים דרשה מדיום לא מוגדר, מבוסס סרום ותרבית משותפת של פיברובלסטים עובריים של עכברים - המכונים תאי הזנה - המספקים חומרי מזון חיוניים ופיגום לתאי גזע עובריים (ESC)16. מאז הפיתוח של מערכות תרבית מוגדרות כימית ונטולות הזנה17,18, קיימות כיום אפשרויות שונות של מדיה ומטריצות תרבית iPSC זמינות מסחרית. עם זאת, רוב תנאי התרבית הללו עברו אופטימיזציה עבור תאי גזע עובריים (ESC) ותאי גזע מושרים אנושיים, ולכן עשויים לעבוד פחות טוב בתרבות iPSC של NHP. בפרוטוקול וידאו זה, אנו מספקים הוראות ליצירה ולתחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ו-NHP שמקורם בתרבית תאי שתן.
מאז הדיווח הראשון על יצירת iPSC על ידי ביטוי כפוי של גורמים מוגדרים בפיברובלסטים בשנת 2006, שיטה זו יושמה על סוגי תאים רבים ושונים ממקורות שונים 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. ביניהם, רק תאים שמקורם בשתן ניתן להשיג באופן לא פולשני לחלוטין. בהתבסס על הפרוטוקול שתואר קודם לכן על ידי Zhou et al.33, ניתן לבודד ולהרחיב תאים משתן פרימטים אפילו מדגימות לא סטריליות, על ידי השלמת אנטיביוטיקה רחבת טווח15. יש לציין כי תאים שמקורם בשתן שנדגמו על ידי פרוטוקול זה מפגינים פוטנציאל גבוה לייצר iPSCs, בתוך פרק זמן קצר יותר (מושבות הופכות גלויות תוך 5-15 ימים) מאשר תכנות מחדש קונבנציונלי של פיברובלסטים (20-30 יום, מניסיוננו), ועם שיעור הצלחה גבוה מספיק. תאים אלה שמקורם בשתן סווגו כאוכלוסייה מעורבת של תאים דמויי תאי גזע מזנכימליים ותאי אפיתל של שלפוחית השתן, מה שגרם ליעילות גבוהה של תכנות מחדש15.
בנוסף לשונות בתאים ראשוניים, שיטות התכנות מחדש ליצירת iPSCs משתנות גם בהתאם למטרת השימוש. הליכי תכנות מחדש קונבנציונליים עבור תאים סומטיים אנושיים בוצעו על ידי ביטוי יתר של גורמי תכנות מחדש עם רטרו-וירוס או וקטורים lentivirus, אשר איפשר שילוב של DNA אקסוגני בגנום 5,34,35. כדי לשמור על שלמותם הגנומית של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), חוקרים פיתחו מגוון רחב של מערכות אי-אינטגרציה - וקטור PiggyBac36,37 הניתן לכריתה, וקטור אפיזומלי38,39, וקטורי וירוסים שאינם מתחברים כגון נגיף סנדאי40 ואדנו-וירוס 41, טרנספקציה של mRNA 42, טרנספקציה של חלבונים 43,44 וטיפול בתרכובת כימית 45. בשל היעילות והקלות בטיפול, וקטורי תכנות מחדש מבוססי וירוס Sendai משמשים בפרוטוקול זה. הדבקה של תאים ראשוניים מתבצעת בתרבית תרחיף של שעה אחת של תאים ונגיפים בריבוי זיהומים (MOI) של 5 לפני הציפוי. צעד שונה זה עשוי להגדיל את הסבירות למגע בין משטחי התא לנגיפים, בהשוואה לשיטה המקובלת שבה הנגיפים מתווספים ישירות לתרבית התא הדבקה, ובכך להניב יותר מושבות iPSC15.
העברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ו- NHP יכולה להיעשות על ידי מעבר גושי ומעבר של תא יחיד. חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) היא חומר כלאט חסכוני הקושר יוני סידן ומגנזיום, ובכך מונע את הפעילות הדבקה של קדרין ואינטגרין. EDTA משמש גם כמגיב דיסוציאציה מתון וסלקטיבי, כאשר תאים לא ממוינים מתנתקים לפני תאים ממוינים עקב מולקולות ההיצמדות השונות שלהם. דיסוציאציה מוחלטת גורמת למוות תאי מסיבי של פרימטים מושרים באמצעות היפראקטיבציה של מיוזין בתיווך Rho/Rho המכילה חלבון קינאז (Rho/Rock). לכן, תוספת למדיום התרבית עם מעכב Rho/Rock חיונית לניסויים הדורשים תאים בודדים בתרחיף46,47. בפרוטוקול זה, אנו ממליצים על Passaging גושי כשיטת ההעברה השגרתית וממליצים על Passaging של תא בודד רק כאשר יש צורך בכך, למשל, כאשר נדרשת זריעה של מספרי תאים מוגדרים, או במהלך שיבוט משנה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumax&#8482; cell detachment solution (Detachment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCR006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B-Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2941-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60064</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-122-965</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#8482; (Cell freezing medium)</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>BB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; II automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoKing&#174; 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)</td>
			<td>Sued-Laborbedarf</td>
			<td>52 95-0213</td>
			<td>Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 4&#39;,6-Diamidine-2&#39;-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 w L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15373541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>710524</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>188271-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 50 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10.8.2</td>
			<td>FlowJo&#160;</td>
			<td>663441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex&#8482; LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 240i CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16416639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus HeraSafe safety cabinet</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>51017905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>Version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL</td>
			<td>Nerbe Plus</td>
			<td>04-212-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1420</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-III Tubulin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR&#8482; 1</td>
			<td>STEMCELL Technolgies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4903S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocure&#8482; (Antimicrobial Reagent)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-noc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-4 Rabbit Antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2750S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 &#181;g/mL Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human PDGF-AB</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-00AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>4-16KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Growth Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4900S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 (MC813) Mouse mAb</td>
			<td>NEB</td>
			<td>4755S</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit&#174; Basic02</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>3821.00</td>
			<td>The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Precision GP 05</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>BYT-ORB153635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMC medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary urine medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC generation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and maintenance of primate induced pluripotent stem cells derived from urine

גישות חוצות מינים החוקרות תאי גזע פלוריפוטנטיים של פרימטים ונגזרותיהם חיוניות להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים והתאיים של מחלות, התפתחות ואבולוציה. כדי להפוך תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים (iPSCs) לנגישים יותר, מאמר זה מציג שיטה לא פולשנית ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים ולא אנושיים מתאים שמקורם בשתן, ותחזוקתם באמצעות שיטת תרבית ללא מזין.
ניתן לדגום את השתן מסביבה לא סטרילית (למשל, הכלוב של החיה) ולטפל בקוקטייל אנטיביוטי רחב טווח במהלך תרבית תאים ראשונית כדי להפחית את הזיהום ביעילות. לאחר התפשטות התאים שמקורם בשתן, iPSCs נוצרים על ידי שיטת התמרה שונה של מערכת וקטור וירוס סנדאי זמינה מסחרית. מושבות iPSC ראשונות עשויות להיות גלויות כבר לאחר 5 ימים, וניתן לקטוף אותן לאחר 10 ימים לכל המוקדם. מעבר גושים שגרתי עם חיץ דיסוציאציה ללא אנזימים תומך בפלוריפוטנציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שנוצרו במשך יותר מ-50 מעברים.

בעת בידוד תאים משתן אנושי ושתן NHP, ניתן לזהות סוגים שונים של תאים ישירות לאחר הבידוד. תאי קשקש, כמו גם תאים עגולים קטנים יותר, מופרשים עם השתן; שתן נשי מכיל הרבה יותר תאי קשקש מאשר שתן זכרי (איור 1B - יום 0; איור משלים S1). לאחר 5 ימים של תרבית בתווך שתן ראשוני, ניתן לראות את...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine at JoVE.com

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד, הרחבה ותכנות מחדש של תאים אנושיים ולא אנושיים שמקורם בשתן של פרימטים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), כמו גם הוראות לתחזוקה ללא הזנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שנוצרו.

ייצור ותחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי פרימטים שמקורם בשתן

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

IPSCs פרימטים הם שימושיים אך לעתים קרובות קשה להשיג אותם בשל בעיות אתיות וטכניות. פרוטוקול זה נותן נתיב נגיש ביותר ליצירה ותחזוקה של IPSCs פרימטים. לשימוש בתאי שתן כמקור עיקרי של IPSCs יש יתרון גדול מכיוון שניתן להשיג אותם באופן לא פולשני לחלוטין ללא כל טכניקות מיוחדות.מי שתדגים את ההליך תהיה ג'סיקה רדמר, דוקטורנטית מוולפגנג M.S.Laboratory. כדי להתחיל, צנטריפוגה את הצינור המכיל שתן ב 400G במשך 10 דקות. לאחר מכן בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר כמיליליטר אחד בצינור להשעות מחדש את הגלולה בו.לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של חיץ שטיפת שתן המכיל אמפוטריצין בזהירות לערבב את התרחיף באמצעות פיפטה סרולוגית. לאחר צנטריפוגה, בזהירות לשאוף את supernatant, משאיר בערך 0.2 מיליליטר בצינור. השהה מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום שתן ראשוני המכיל אמפוטריצין לכל 50 מיליליטר של שתן מעובד בתחילה.מוציאים את הג'לטין ומוסיפים מיליליטר אחד של המתלה לבאר של ג'לטין מצופה 12 צלחת באר. לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. כדי להכין מטריצת קרום מרתף מצופה 12 צלחת באר, להוסיף 500 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף לכל באר.הזיזו את הצלחת כדי לפזר את הנוזל ולדגור עליו ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, להחליף את מטריצת קרום המרתף עם 900 מיקרוליטר של מדיום REMC ולאחסן אותו ב 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. חישוב נפח נגיפי סנדאי הדרוש לריבוי הדבקה של חמישה באמצעות המשוואה.הפשירו במהירות את רכיבי ערכת התכנות מחדש של סנדאי באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסף מדיום REMC עבור סך של 100 מיקרוליטר לצינור לפני הוספת נפח מחושב של וירוסי סנדאי וערבוב. לאחר דיסוציאציה של תאי השתן כמתואר בכתב היד, סופרים את התאים באמצעות מונה התאים ומעבירים את מספר התאים הרצוי לצינור של 1.5 מיליליטר.להשיג את הגלולה על ידי צנטריפוגה ולהשעות אותו מחדש ב 100 מיקרוליטר של תערובת וירוס סנדאי מוכן. לדגור על הצינור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס עבור זיהום תרחיף. לאחר הדגירה, מוסיפים את REMC לסך של מיליליטר אחד לפני זריעת תרחיף התא במטריצת קרום המרתף המצופה 12 צלחת באר.לאחר הטרנסדוקציה, יש להחליף את המדיום כל יומיים עד להתפתחות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, או IPSC, מושבות עם מעבר למדיום דור PSC ביום החמישי. כאשר מושבות IPSC גדלות מספיק כדי לעבור גושים, לשאוף את המדיום מן התאים בתרבית בזהירות לשטוף את התאים עם 500 מיקרוליטר של DPBS. לאחר הסרת DPBS, להוסיף 500 מיקרוליטר של 0.5 מילימולרי EDTA לבאר לדגור במשך שתיים עד חמש דקות.התבוננו היטב בתאים מתחת למיקרוסקופ עד שהמושבות מתחילות להתנתק. כאשר הקצוות של המושבות מתחילים להתקלף ורווחים בין התאים הופכים גלויים, להסיר את EDTA בזהירות להוסיף 500 מיקרוליטר של DPBS. שאפו את ה-DPBS ושטפו את הבאר ב-500 מיקרוליטר של מדיום תרבית PSC באמצעות פיפטה P-1000.פיפטה למעלה ולמטה כדי לפזר את המושבות לגושים בגודל מתאים. בהתאם למפגש, הצפיפות הרצויה של תאי הזרעים והעדפת השבט IPSC, מעבירים 1/10 עד 1/50 מתרחיף גוש התא לבארות החדשות. הזיזו בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה מספר פעמים כדי לפזר את הגושים באופן שווה בבאר.דוגרים על הצלחת לפחות 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס כדי לתת לגושים להיחבר. החליפו את המדיום כל יומיים-שלושה עד שהמושבות יגדלו מספיק למעבר. לאחר הבידוד, ניתן לראות תאי קשקש ותאים עגולים קטנים יותר שהופראו עם השתן.ניתן לראות את התאים המתרבים הדבקים הראשונים, ותאים אלה גדלים למושבות גדולות שניתן לעבור. ניתן לראות שני סוגי תאים נפרדים, האחד בעל פנוטיפ דמוי אפיתל והשני מראה פנוטיפ דמוי מזנכימלי יותר עם צורה מוארכת. לאחר המעבר הראשון, תאי השתן לגדול כמו monolayer.במהלך יצירת IPSC ניתן לראות כמה תאים דבקים ותאים אלה מתחילים להראות שינויים מורפולוגיים, המעידים על תכנות מחדש של התאים. יתר על כן, התאים היוצרים מושבות מציגים את המורפולוגיה האופיינית של תאי גזע עובריים. כל ה- IPSCs הנוצרים חולקים את המורפולוגיה הטיפוסית של מושבת תאי גזע עובריים, המאופיינת בתאים צפופים עם קצוות מוגדרים בבירור.אימונוציטוכימיה שימשה לבדיקת הביטוי של סמנים הקשורים לפלוריפוטנציה בגורילה IPSCs. יתר על כן, ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי האורנגאוטן IPSCs שניתחו חיוביים עבור TRA-1-60. יתר על כן, הגורילות IPSCs מסוגלים להתמיין לשושלות אנדודרם (endoderm), מזודרם (mesoderm) ואקטודרם (ectoderm).מספר גדל של תאים ממוינים ואובדן שלמות ואחידות הגבול מצביעים על איכות IPSC ירודה. לעומת זאת, גבולות מוגדרים, אריזה סלולרית הדוקה וגרעינים בולטים מסמלים IPSCs באיכות גבוהה. בשל השתנות העטרה, יש לייעל את התנאים הספציפיים לשיבוט כגון יחס פיצול, תזמון מעבר וגודל גושים כדי לשמור על פרימטים IPSCs גדלים בריאים.כבקרות איכות של IPSCs מבוססים, ניתן לאמת קדם-עוצמה על ידי השראת התמיינות ישירה או עקיפה כגון התמיינות EV במבחנה, מלבד בדיקת ביטוי גנים בסמן.