Este trabalho foi apoiado pela DFG EN 1093/5-1 (projeto número 458247426). M.O. foi apoiado pela JSPS Overseas Research Fellowship. Todas as figuras foram criadas com BioRender.com. A citometria de fluxo foi realizada com o auxílio da citometria de fluxo do Core Facility no Biomedical Center Munich. Gostaríamos de agradecer a Makoto Shida e Tomoyo Muto da ASHBi, Universidade de Kyoto, pelo apoio à videografia.

Este procedimento experimental foi aprovado pelo comitê de ética responsável pela experimentação humana (20-122, Ethikkommission LMU München). Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes. NOTA: A aprovação deve ser obtida do comitê de ética apropriado antes de iniciar experimentos com amostras humanas e de NHP. Todos os procedimentos experimentais devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Cada uma das etapas a seguir de...

As iPSCs são tipos celulares valiosos, pois permitem a geração de tipos celulares inacessíveis in vitro. Como os materiais de partida para a reprogramação, por exemplo, fibroblastos não estão facilmente disponíveis em todas as espécies de primatas, este trabalho apresenta um protocolo para a geração de iPSCs a partir de células derivadas da urina. Essas células podem ser obtidas de forma não invasiva, mesmo a partir de amostras não estéreis de urina de primatas, suplementando-se o meio de cultur...

Comparações genômicas de primatas humanos e não humanos (NHPs) são cruciais para entender nossa história evolutiva e a evolução de características específicas do ser humano1. Além disso, essas comparações permitem inferir a função identificando sequências conservadas de DNA2, por exemplo, para priorizar variantes associadas à doença3. Comparações de fenótipos moleculares, como níveis de expressão gênica, são cruciais para melhor interpretar comparações genômicas e descobrir, por exemplo, diferenças fenotípicas celulares. Além disso, eles têm - semelhante a comparações no nível do DNA - o potencial de inferir relevância funcional e, portanto, interpretar melhor a variação clinicamente relevante em humanos4. A incorporação de dados fenotípicos moleculares abrangentes nesses estudos comparativos requer recursos biológicos apropriados (isto é, células ortológicas entre espécies). No entanto, razões éticas e práticas dificultam ou impossibilitam o acesso a essas células comparáveis, especialmente durante o desenvolvimento. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) permitem a geração desses tipos celulares inacessíveis in vitro5,6, são experimentalmente acessíveis e têm sido utilizadas para comparações de primatas 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Para gerar iPSCs, é preciso adquirir as células primárias a serem reprogramadas. As células isoladas da urina têm a vantagem de poderem ser amostradas de primatas de forma não invasiva e de poderem ser prontamente reprogramadas, provavelmente devido ao seu perfil molecular semelhante ao das células-tronco15. As condições de cultura para manter as iPSCs de primatas são tão importantes quanto a reprogramação; classicamente, a cultura de células-tronco pluripotentes humanas requer um meio não definido, baseado em soro, e co-cultura de fibroblastos embrionários de camundongos - as chamadas células alimentadoras - que fornecem nutrientes essenciais e um arcabouço para células-tronco embrionárias (CTEs)16. Desde o desenvolvimento de sistemas de cultura quimicamente definidos e livres de alimentadores17,18, existem atualmente várias opções de meios e matrizes de cultura iPSC comercialmente disponíveis. No entanto, a maioria dessas condições de cultura foi otimizada para CTEs e iPSCs humanas e, portanto, pode funcionar menos bem na cultura iPSC NHP. Neste protocolo de vídeo, fornecemos instruções para gerar e manter iPSCs humanas e NHP derivadas de cultura de células urinárias.
Desde o primeiro relato de geração de iPSC pela expressão forçada de fatores definidos em fibroblastos, em 2006, esse método tem sido aplicado a diversos tipos celulares de diversas origens19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32º. Entre elas, apenas células derivadas da urina podem ser obtidas de forma completamente não invasiva. Com base no protocolo previamente descrito por Zhou et al.33, pode-se isolar e expandir células da urina de primatas mesmo de amostras não estéreis, suplementando antibióticos de amplo espectro15. Notavelmente, as células derivadas da urina amostradas por este protocolo exibem um alto potencial para produzir iPSCs, dentro de um período de tempo mais curto (colônias tornam-se visíveis em 5-15 dias) do que a reprogramação convencional de fibroblastos (20-30 dias, em nossa experiência), e com uma taxa de sucesso suficientemente alta. Essas células derivadas da urina foram classificadas como a população mista de células-tronco mesenquimais e células epiteliais da bexiga, causando a alta eficiência da reprogramação15.
Além da variação nas células primárias, os métodos de reprogramação para gerar iPSCs também variam de acordo com a finalidade de uso. Os procedimentos convencionais de reprogramação de células somáticas humanas foram realizados pela superexpressão de fatores de reprogramação com vetores de retrovírus ou lentivírus, o que permitiu a integração do DNA exógeno no genoma 5,34,35. Para manter as iPSCs geradas genomicamente intactas, os pesquisadores desenvolveram uma ampla variedade de sistemas de não-integração - vetor PiggyBac excisável36,37, vetor epissomal38,39, vetores virais não integradores como o vírus Sendai 40 e adenovírus 41, transfecção de RNAm42, transfecção de proteínas 43,44 e tratamento de compostos químicos 45. Devido à eficiência e facilidade no manuseio, os vetores de reprogramação baseados no vírus de Sendai são utilizados neste protocolo. A infecção de células primárias é realizada em uma cultura de suspensão de 1 h de células e vírus em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5 antes do plaqueamento. Essa etapa modificada poderia aumentar a probabilidade de contato entre superfícies celulares e vírus, em comparação com o método convencional, no qual os vírus são adicionados diretamente à cultura de células aderentes e, assim, produzir mais colônias de iPSC15.
A passagem de células-tronco pluripotentes humanas e NHP pode ser feita por passagem de aglomeração e passagem de célula única. O ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) é um agente quelante de baixo custo que se liga aos íons cálcio e magnésio e, assim, impede a atividade aderente da caderina e da integrina. O EDTA também é usado como um reagente de dissociação leve e seletivo, pois as células indiferenciadas se desprendem antes das células diferenciadas devido às suas diferentes moléculas de adesão. A dissociação completa induz a morte celular maciça de iPSCs de primatas através da hiperativação da miosina mediada pela proteína quinase (Rho/Rock) associada à bobina Rho/Rho. Portanto, a suplementação do meio de cultura com um inibidor de Rho/Rock é essencial para experimentos que necessitem de células isoladas em suspensão46,47. Neste protocolo, recomendamos a passagem de aglomeração como o método de passagem de rotina e recomendamos a passagem de célula única apenas quando for necessário, por exemplo, quando a semeadura de números de células definidos for necessária, ou durante a subclonagem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumax&#8482; cell detachment solution (Detachment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCR006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B-Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2941-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60064</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-122-965</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#8482; (Cell freezing medium)</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>BB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; II automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoKing&#174; 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)</td>
			<td>Sued-Laborbedarf</td>
			<td>52 95-0213</td>
			<td>Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 4&#39;,6-Diamidine-2&#39;-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 w L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15373541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>710524</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>188271-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 50 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10.8.2</td>
			<td>FlowJo&#160;</td>
			<td>663441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex&#8482; LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 240i CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16416639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus HeraSafe safety cabinet</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>51017905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>Version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL</td>
			<td>Nerbe Plus</td>
			<td>04-212-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1420</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-III Tubulin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR&#8482; 1</td>
			<td>STEMCELL Technolgies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4903S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocure&#8482; (Antimicrobial Reagent)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-noc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-4 Rabbit Antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2750S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 &#181;g/mL Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human PDGF-AB</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-00AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>4-16KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Growth Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4900S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 (MC813) Mouse mAb</td>
			<td>NEB</td>
			<td>4755S</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit&#174; Basic02</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>3821.00</td>
			<td>The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Precision GP 05</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>BYT-ORB153635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMC medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary urine medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC generation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and maintenance of primate induced pluripotent stem cells derived from urine

Abordagens entre espécies que estudam células-tronco pluripotentes de primatas e seus derivados são cruciais para entender melhor os mecanismos moleculares e celulares de doenças, desenvolvimento e evolução. Para tornar as células-tronco pluripotentes induzidas por primatas (iPSCs) mais acessíveis, este artigo apresenta um método não invasivo para gerar iPSCs de primatas humanos e não humanos a partir de células derivadas da urina, e sua manutenção usando um método de cultura livre de alimentadores.
A urina pode ser coletada de um ambiente não estéril (por exemplo, a gaiola do animal) e tratada com um coquetel antibiótico de amplo espectro durante a cultura de células primárias para reduzir a contaminação de forma eficiente. Após a propagação das células derivadas da urina, as iPSCs são geradas por um método de transdução modificado de um sistema vetorial do vírus Sendai comercialmente disponível. As primeiras colônias de iPSC podem já estar visíveis após 5 dias, e podem ser colhidas após 10 dias, no mínimo. A passagem de rotina de aglomerados com tampão de dissociação livre de enzimas suporta a pluripotência das iPSCs geradas por mais de 50 passagens.

Ao isolar células da urina humana e do NHP, diferentes tipos de células podem ser identificados diretamente após o isolamento. As células escamosas, bem como várias células redondas menores, são excretadas com a urina; a urina feminina contém muito mais células escamosas do que a masculina (Figura 1B - Dia 0; Figura Suplementar S1). Após 5 dias de cultura em meio de urina primária, observam-se as primeiras células aderentes em proliferação (<strong class="xfig"...

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Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

O presente protocolo descreve um método para isolar, expandir e reprogramar células derivadas da urina de primatas humanos e não humanos para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), bem como instruções para a manutenção livre de alimentadores das iPSCs recém-geradas.

Geração e Manutenção de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Primatas Derivadas da Urina

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

Os IPSCs de primatas são úteis, mas muitas vezes difíceis de obter devido a questões éticas e técnicas. Este protocolo fornece um caminho mais acessível para a geração e manutenção de IPSCs de primatas. O uso de células urinárias como fonte primária de IPSCs tem uma grande vantagem, pois podem ser obtidas de forma completamente não invasiva, sem técnicas especiais.Quem demonstrará o procedimento será Jessica Radmer, estudante de doutorado do Wolfgang M.S.Laboratory. Para começar, centrifugar o tubo contendo urina a 400G por 10 minutos. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente um mililitro no tubo e ressuspender o pellet nele.Lave as células adicionando 10 mililitros de tampão de lavagem de urina contendo anfotericina e misture cuidadosamente a suspensão usando uma pipeta sorológica. Após a centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente menos de 0,2 mililitros no tubo. Ressuspender o pellet celular em um mililitro de meio urinário primário contendo anfotericina por 50 mililitros de urina inicialmente processada.Retire a gelatina e adicione um mililitro da suspensão em um poço de placa de 12 poços revestida com gelatina. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Para preparar uma matriz de membrana basal revestida com placa de 12 poços, adicione 500 microlitros de matriz de membrana basal por poço.Mova a placa para distribuir o líquido e incube-o a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, substituir a matriz da membrana basal por 900 microlitros de meio REMC e armazená-la a 37 graus Celsius até o uso. Calcule o volume de vírus de Sendai necessário para uma multiplicidade de infecção de cinco usando a equação.Descongele rapidamente os componentes do kit de reprogramação de Sendai no banho-maria temperado a 37 graus Celsius. Adicione o meio REMC para um total de 100 microlitros a um tubo antes de adicionar o volume calculado de vírus de Sendai e misturar. Após a dissociação das células urinárias, conforme descrito no manuscrito, conte as células usando o contador de células e transfira o número desejado de células para um tubo de 1,5 mililitro.Obter o pellet por centrifugação e ressuspendê-lo em 100 microlitros da mistura preparada do vírus Sendai. Incubar o tubo por uma hora a 37 graus Celsius para infecção da suspensão. Após a incubação, adicionar REMC a um total de um mililitro antes de semear a suspensão celular na matriz de membrana basal revestida com placa de 12 poços.Após a transdução, trocar o meio a cada dois dias até o desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas, ou IPSC, colônias com mudança para meio de geração de PSC no quinto dia. Quando as colônias IPSC crescerem o suficiente para a passagem de aglomerados, aspirar o meio das células cultivadas e lavar cuidadosamente as células com 500 microlitros de DPBS. Após a remoção do DPBS, adicione 500 microlitros de EDTA 0,5 milimolar ao poço e incube por dois a cinco minutos.Observe cuidadosamente as células ao microscópio até que as colônias comecem a se desprender. Quando as bordas das colônias começarem a descascar e as lacunas entre as células se tornarem visíveis, remova o EDTA e adicione cuidadosamente 500 microlitros de DPBS. Aspirar o DPBS e lavar o poço com 500 microlitros de meio de cultura PSC usando uma pipeta P-1000.Pipetar para cima e para baixo para dispersar as colônias em aglomerados de tamanho apropriado. Dependendo da confluência, da densidade desejada das células semeadas e da preferência clonal do IPSC, transferem de 1/10 a 1/50 da suspensão do aglomerado celular para os novos poços. Mova suavemente a placa para frente e para trás várias vezes para distribuir as touceiras uniformemente no poço.Incube a placa por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius para deixar as touceiras se fixarem. Troque o meio a cada dois ou três dias até que as colônias cresçam o suficiente para a passagem. Após o isolamento, células escamosas e várias células redondas menores podem ser vistas que foram excretadas com a urina.As primeiras células aderentes em proliferação podem ser vistas, e essas células crescem em grandes colônias que podem ser passadas. Dois tipos celulares distintos podem ser observados, um com fenótipo semelhante ao epitélio e outro apresentando fenótipo mais mesenquimal com forma alongada. Após a primeira passagem, as células urinárias crescem como uma monocamada.Durante a geração do IPSC, algumas células aderentes podem ser vistas e essas células começam a apresentar alterações morfológicas, indicando reprogramação das células. Além disso, as células que formam colônias exibem a morfologia típica de células-tronco embrionárias. Todos os IPSCs gerados compartilham a morfologia típica de colônia semelhante a células-tronco embrionárias, caracterizada por células bem compactadas com bordas claramente definidas.A imunocitoquímica foi utilizada para testar a expressão de marcadores associados à pluripotência em IPSCs de gorilas. Além disso, a análise por citometria de fluxo mostrou que os IPSCs de orangotango analisados são positivos para TRA-1-60. Além disso, os IPSCs de gorilas são capazes de se diferenciar em linhagens endoderme, mesoderma e ectoderma.O aumento do número de células diferenciadas e a perda da integridade e uniformidade das bordas indicam baixa qualidade do IPSC. Em contraste, fronteiras definidas, embalagem celular apertada e nucléolos proeminentes significam IPSCs de alta qualidade. Devido à variabilidade coronal, é necessário otimizar as condições específicas do clone, como razão de divisão, tempo de passagem e tamanho do aglomerado para manter os IPSCs de primatas crescendo saudáveis.Como controles de qualidade das IPSCs estabelecidas, pode-se verificar a pré-potência por indução de diferenciação direta ou indireta, como a diferenciação in vitro de EV, além de verificar a expressão gênica de marcadores.