Detta arbete stöddes av DFG EN 1093/5-1 (projektnummer 458247426). M.O. stöddes av JSPS Overseas Research Fellowship. Alla siffror skapades med BioRender.com. Flödescytometri utfördes med hjälp av Core Facility Flow Cytometry vid Biomedical Center München. Vi vill tacka Makoto Shida och Tomoyo Muto från ASHBi, Kyoto University, för stöd till videografi.

Detta experimentella förfarande godkändes av den ansvariga etiska kommittén för mänskliga experiment (20-122, Ethikkommission LMU München). Alla experiment utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter. OBS: Godkännande måste erhållas från lämplig etisk kommitté innan försök som behandlar human- och NHP-prover påbörjas. Alla försöksförsök ska utföras i enlighet med gällande riktlinjer och föreskrifter. Var och en av följande steg bör utföras med steril teknik i ett biologisk...

iPSC är värdefulla celltyper eftersom de möjliggör generering av annars otillgängliga celltyper in vitro. Eftersom utgångsmaterialen för omprogrammering, till exempel, fibroblaster inte är lätt tillgängliga från alla primatarter, presenterar detta dokument ett protokoll för generering av iPSC från urin-härledda celler. Dessa celler kan erhållas på ett icke-invasivt sätt, även från icke-sterila primaturinprover, genom att komplettera odlingsmediet med bredspektrum antibiotika.
<p class="jov...

Genomiska jämförelser av mänskliga och icke-mänskliga primater (NHP) är avgörande för att förstå vår evolutionära historia och utvecklingen av människospecifika egenskaper1. Dessutom möjliggör dessa jämförelser inferens av funktion genom att identifiera bevarade DNA-sekvenser2, t.ex. för att prioritera sjukdomsassocierade varianter3. Jämförelser av molekylära fenotyper såsom genuttrycksnivåer är avgörande för att bättre tolka genomiska jämförelser och för att upptäcka till exempel cellulära fenotypiska skillnader. Dessutom har de - i likhet med jämförelser på DNA-nivå - potential att härleda funktionell relevans och därmed bättre tolka medicinskt relevant variation inom människor4. Införlivandet av omfattande molekylära fenotypiska data i dessa jämförande studier kräver lämpliga biologiska resurser (dvs. ortologa celler över arter). Etiska och praktiska skäl gör det dock svårt eller omöjligt att få tillgång till sådana jämförbara celler, särskilt under utvecklingen. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) möjliggör generering av sådana otillgängliga celltyper in vitro5,6, är experimentellt tillgängliga och har använts för primatjämförelser 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
För att generera iPSC måste man förvärva de primära cellerna som ska omprogrammeras. Celler isolerade från urin har fördelen att de kan provtas icke-invasivt från primater och att de lätt kan omprogrammeras, troligen på grund av deras stamcellsliknande molekylära profiler15. Odlingsförhållandena för att upprätthålla primat-iPSC är lika viktiga som omprogrammering; Klassiskt krävde odling av humana pluripotenta stamceller ett odefinierat, serumbaserat medium och samodling av musembryonala fibroblaster – så kallade matarceller – som tillhandahåller viktiga näringsämnen och en byggnadsställning för embryonala stamceller (ESC)16. Sedan utvecklingen av kemiskt definierade och matarfria odlingssystem17,18 finns det nu olika alternativ för kommersiellt tillgängliga iPSC-odlingsmedier och matriser. De flesta av dessa odlingsförhållanden har dock optimerats för humana ESC och iPSC, och kan därför fungera mindre bra i NHP iPSC-kulturen. I detta videoprotokoll tillhandahåller vi instruktioner för att generera och underhålla humana och NHP iPSC härledda från urincellsodling.
Sedan den första rapporten om iPSC-generering genom tvångsuttryck av definierade faktorer i fibroblaster 2006 har denna metod tillämpats på många olika celltyper av olika ursprung 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Bland dem kan endast urin-härledda celler erhållas på ett helt icke-invasivt sätt. Baserat på det tidigare beskrivna protokollet av Zhou et al.33 kan man isolera och expandera celler från primaturin även från icke-sterila prover, genom att komplettera bredspektrumantibiotika15. I synnerhet uppvisar urin-härledda celler som provtas av detta protokoll en hög potential att producera iPSCs, inom en kortare tidsperiod (kolonier blir synliga inom 5-15 dagar) än den konventionella omprogrammeringen av fibroblaster (20-30 dagar, enligt vår erfarenhet), och med en tillräckligt hög framgångsgrad. Dessa urin-härledda celler klassificerades som den blandade populationen av mesenkymala stamcellsliknande celler och blåsepitelceller, vilket orsakade den höga omprogrammeringseffektiviteten15.
Förutom variationen i primära celler varierar omprogrammeringsmetoderna för att generera iPSC också beroende på användningsändamålet. Konventionella omprogrammeringsprocedurer för humana somatiska celler utfördes genom överuttryck av omprogrammeringsfaktorer med retrovirus- eller lentivirusvektorer, vilket möjliggjorde integrationen av exogent DNA i genomet 5,34,35. För att hålla de genererade iPSC: erna genomiskt intakta har forskare utvecklat ett brett utbud av icke-integrationssystem - punktskattepliktig PiggyBac-vektor 36,37, episomal vektor38,39, icke-integrerande virusvektorer såsom Sendai-virus 40 och adenovirus 41, mRNA-transfektion 42, proteintransfektion 43,44 och kemisk föreningsbehandling 45. På grund av effektiviteten och enkel hantering används Sendai-virusbaserade omprogrammeringsvektorer i detta protokoll. Infektion av primära celler utförs i en 1 h suspensionskultur av celler och virus vid en multiplicitet av infektion (MOI) av 5 före plätering. Detta modifierade steg kan öka sannolikheten för kontakt mellan cellytor och virus, jämfört med den konventionella metoden där virusen tillsätts direkt till den vidhäftande cellkulturen, och därmed ge fler iPSC-kolonier15.
Passaging av humana och NHP pluripotenta stamceller kan göras genom klumppassaging och single-cell passaging. Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) är ett kostnadseffektivt kelatbildare som binder kalcium- och magnesiumjoner och därmed förhindrar vidhäftande aktivitet av kadherin och integrin. EDTA används också som ett mildt, selektivt dissociationsreagens, eftersom odifferentierade celler lossnar före differentierade celler på grund av deras olika vidhäftningsmolekyler. Fullständig dissociation inducerar massiv celldöd hos primat-iPSC via Rho/Rho-associerad spole innehållande proteinkinas (Rho/Rock)-medierad myosinhyperaktivering. Därför är det viktigt att komplettera odlingsmediet med en Rho / Rock-hämmare för experiment som kräver enstaka celler i suspension46,47. I detta protokoll rekommenderar vi klumppassaging som rutinpasseringsmetod och rekommenderar encellspassaging endast när det är nödvändigt, t.ex. när seeding av definierade cellnummer krävs, eller under subkloning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumax&#8482; cell detachment solution (Detachment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCR006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B-Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2941-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60064</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-122-965</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#8482; (Cell freezing medium)</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>BB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; II automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoKing&#174; 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)</td>
			<td>Sued-Laborbedarf</td>
			<td>52 95-0213</td>
			<td>Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 4&#39;,6-Diamidine-2&#39;-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 w L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15373541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>710524</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>188271-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 50 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10.8.2</td>
			<td>FlowJo&#160;</td>
			<td>663441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex&#8482; LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 240i CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16416639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus HeraSafe safety cabinet</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>51017905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>Version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL</td>
			<td>Nerbe Plus</td>
			<td>04-212-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1420</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-III Tubulin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR&#8482; 1</td>
			<td>STEMCELL Technolgies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4903S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocure&#8482; (Antimicrobial Reagent)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-noc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-4 Rabbit Antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2750S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 &#181;g/mL Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human PDGF-AB</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-00AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>4-16KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Growth Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4900S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 (MC813) Mouse mAb</td>
			<td>NEB</td>
			<td>4755S</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit&#174; Basic02</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>3821.00</td>
			<td>The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Precision GP 05</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>BYT-ORB153635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMC medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary urine medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC generation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and maintenance of primate induced pluripotent stem cells derived from urine

Artöverskridande tillvägagångssätt som studerar primatpluripotenta stamceller och deras derivat är avgörande för att bättre förstå de molekylära och cellulära mekanismerna för sjukdom, utveckling och evolution. För att göra primatinducerade pluripotenta stamceller (iPSC) mer tillgängliga presenterar denna artikel en icke-invasiv metod för att generera humana och icke-mänskliga primat-iPSC från urinhärledda celler och deras underhåll med hjälp av en matarfri odlingsmetod.
Urinen kan provtas från en icke-steril miljö (t.ex. djurets bur) och behandlas med en bredspektrum antibiotikacocktail under primär cellodling för att effektivt minska kontaminering. Efter förökning av de urinhärledda cellerna genereras iPSC genom en modifierad transduktionsmetod av ett kommersiellt tillgängligt Sendai-virusvektorsystem. De första iPSC-kolonierna kan vara synliga efter 5 dagar och kan plockas tidigast efter 10 dagar. Rutinmässig klumppassaging med enzymfri dissociationsbuffert stöder pluripotens hos de genererade iPSC: erna i mer än 50 passager.

Vid isolering av celler från human och NHP-urin kan olika typer av celler identifieras direkt efter isolering. Skivepitelceller, liksom olika mindre runda celler, utsöndras med urinen; kvinnlig urin innehåller mycket mer skivepitelceller än manlig urin (Figur 1B - Dag 0; Kompletterande figur S1). Efter 5 dagars odling i primärt urinmedium kan de första vidhäftande prolifererande cellerna ses (Figur 1A, B - Dag 5). Vid den...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine at JoVE.com

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Detta protokoll beskriver en metod för att isolera, expandera och omprogrammera humana och icke-mänskliga urinceller från primater till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), samt instruktioner för matarfritt underhåll av de nyligen genererade iPSC.

Generering och underhåll av primatinducerade pluripotenta stamceller härrörande från urin

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

Primate IPSC är användbara men ofta svåra att få på grund av etiska och tekniska problem. Detta protokoll ger en mycket tillgänglig väg till generering och underhåll av primat-IPSC. Användningen av urinceller som en primär källa till IPSC har en stor fördel eftersom de kan erhållas på ett helt icke-invasivt sätt utan några speciella tekniker.Jessica Radmer, doktorand från Wolfgang M.S.Laboratory, demonstrerar proceduren. För att börja, centrifugera urinen innehållande röret vid 400G i 10 minuter. Aspirera sedan försiktigt supernatanten, lämna ungefär en milliliter i röret och återsuspendera pelleten i den.Tvätta cellerna genom att tillsätta 10 ml urintvättbuffert innehållande amfotericin och blanda försiktigt suspensionen med en serologisk pipett. Efter centrifugering, aspirera försiktigt supernatanten och lämna ungefär mindre än 0,2 ml i röret. Resuspendera cellpelleten i en milliliter primärt urinmedium innehållande amfotericin per 50 ml initialt bearbetad urin.Ta bort gelatin och tillsätt en milliliter av suspensionen i en brunn med gelatinbelagd 12 brunnsplatta. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. För att förbereda en basalmembranmatrisbelagd 12 brunnsplatta, tillsätt 500 mikroliter basalmembranmatris per brunn.Flytta plattan för att fördela vätskan och inkubera den vid 37 grader Celsius i en timme. Efter inkubation, byt ut basalmembranmatrisen med 900 mikroliter REMC-medium och förvara den vid 37 grader Celsius tills den används. Beräkna volymen av Sendai-virus som behövs för en mängd infektion på fem med hjälp av ekvationen.Tina snabbt komponenterna i Sendai-omprogrammeringssatsen i vattenbadet tempererat vid 37 grader Celsius. Tillsätt REMC-medium för totalt 100 mikroliter till ett rör innan du tillsätter den beräknade volymen Sendai-virus och blandar. Efter dissociation av urincellerna som beskrivs i manuskriptet, räkna cellerna med cellräknaren och överför önskat antal celler till ett 1,5 ml rör.Erhåll pelleten genom centrifugering och resuspendera den i 100 mikroliter av den beredda Sendai-virusblandningen. Inkubera röret i en timme vid 37 grader Celsius för suspensionsinfektion. Efter inkubation, tillsätt REMC till totalt en milliliter innan cellsuspensionen såddes i basalmembranmatrisbelagd 12 brunnsplatta.Efter transduktion, byt medium varannan dag tills utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller, eller IPSC, kolonier med byte till PSC-generationsmedium på dag fem. När IPSC-kolonierna växer sig tillräckligt stora för klumppassning, aspirera mediet från de odlade cellerna och tvätta cellerna noggrant med 500 mikroliter DPBS. Efter avlägsnande av DPBS, tillsätt 500 mikroliter 0,5 millimolar EDTA till brunnen och inkubera i två till fem minuter.Observera noggrant cellerna under mikroskopet tills kolonierna börjar lossna. När koloniernas kanter börjar avskalas och luckor mellan cellerna blir synliga, ta bort EDTA och tillsätt försiktigt 500 mikroliter DPBS. Aspirera DPBS och spola brunnen med 500 mikroliter PSC-odlingsmedium med en P-1000-pipett.Pipettera upp och ner för att sprida kolonierna i klumpar av lämplig storlek. Beroende på sammanflödet, den önskade densiteten hos de sådda cellerna och IPSC-klonpreferensen, överför 1/10 till 1/50 av cellklumpsuspensionen till de nya brunnarna. Flytta försiktigt plattan fram och tillbaka flera gånger för att fördela klumparna jämnt i brunnen.Inkubera plattan i minst 30 minuter vid 37 grader Celsius så att klumparna fäster. Byt medium varannan till var tredje dag tills kolonierna blir tillräckligt stora för passaging. Efter isolering kan skivepitelceller och olika mindre runda celler ses som utsöndrades med urinen.De första vidhäftande prolifererande cellerna kan ses, och dessa celler växer till stora kolonier som kan passeras. Två distinkta celltyper kan ses, en med en epitelliknande fenotyp och den andra visar en mer mesenkymalliknande fenotyp med långsträckt form. Efter den första passagen växer urinceller som ett monolager.Under IPSC: s generation kan vissa vidhäftande celler ses och dessa celler börjar visa morfologiska förändringar, vilket indikerar omprogrammering av cellerna. Vidare visar cellerna som bildar kolonier den typiska embryonala stamcellsmorfologin. Alla genererade IPSC delar den typiska embryonala stamcellsliknande kolonimorfologin, kännetecknad av tätt packade celler med tydligt definierade kanter.Immunocytokemi användes för att testa uttrycket av pluripotensassocierade markörer i gorilla IPSC. Dessutom visade flödescytometrianalys att de analyserade orangutang-IPSC är positiva för TRA-1-60. Dessutom kan gorilla IPSC differentiera till endoderm-, mesoderm- och ektodermlinjer.Ett ökat antal differentierade celler och en förlust av gränsintegritet och enhetlighet indikerar dålig IPSC-kvalitet. Däremot betyder definierade gränser, tät cellulär förpackning och framträdande nukleoler IPSC: er av hög kvalitet. På grund av koronavariationen måste man optimera klonspecifika förhållanden som delningsförhållande, passagetid och klumpstorlek för att hålla primaternas IPSC friska.Som kvalitetskontroller av etablerade IPSC:er kan man verifiera prepotens genom direkt eller indirekt differentieringsinduktion såsom in vitro EV-differentiering, förutom att kontrollera markörgenuttryck.