Bu çalışma DFG EN 1093/5-1 (proje numarası 458247426) tarafından desteklenmiştir. M.O. JSPS Overseas Research Fellowship tarafından desteklenmiştir. Tüm figürler BioRender.com ile oluşturuldu. Akım sitometrisi, Münih Biyomedikal Merkezi'ndeki Core Facility Flow Cytometry yardımıyla gerçekleştirildi. Kyoto Üniversitesi ASHBi'den Makoto Shida ve Tomoyo Muto'ya videografiye verdikleri destek için teşekkür ederiz.

Bu deneysel prosedür, insan deneyleri sorumlu etik komitesi (20-122, Ethikkommission LMU München) tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler ilgili kılavuz ilkelere ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. NOT: İnsan ve NHP örnekleri ile ilgili deneylere başlamadan önce uygun etik kuruldan onay alınmalıdır. Tüm deneysel prosedürler ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Aşağıdaki adımların her biri, biyolojik bir güvenlik kabininde steril teknik kull...

iPSC'ler, in vitro olarak erişilemeyen hücre tiplerinin üretilmesine izin verdikleri için değerli hücre tipleridir. Yeniden programlamanın başlangıç materyalleri olarak, örneğin, fibroblastlar tüm primat türlerinden kolayca elde edilemediğinden, bu makale idrardan türetilmiş hücrelerden iPSC'lerin üretilmesi için bir protokol sunmaktadır. Bu hücreler, kültür ortamını geniş spektrumlu antibiyotiklerle destekleyerek, steril olmayan primat idrar örneklerinden bile invaziv olmayan bir şe...

İnsan ve insan olmayan primatların (NHP'ler) genomik karşılaştırmaları, evrimsel tarihimizi ve insana özgü özelliklerin evrimini anlamak için çok önemlidir1. Ek olarak, bu karşılaştırmalar, korunmuş DNA dizileri2'yi tanımlayarak, örneğin hastalıkla ilişkili varyantları önceliklendirmek için fonksiyonun çıkarılmasına izin verir3. Gen ekspresyon seviyeleri gibi moleküler fenotiplerin karşılaştırılması, genomik karşılaştırmaları daha iyi yorumlamak ve örneğin hücresel fenotipik farklılıkları keşfetmek için çok önemlidir. Dahası, DNA seviyesindeki karşılaştırmalara benzer şekilde, işlevsel alaka düzeyini çıkarma ve dolayısıyla insanlarda tıbbi olarak ilgili varyasyonları daha iyi yorumlama potansiyeline sahiptirler4. Kapsamlı moleküler fenotipik verilerin bu karşılaştırmalı çalışmalara dahil edilmesi, uygun biyolojik kaynakları (yani, türler arasında ortolog hücreler) gerektirir. Bununla birlikte, etik ve pratik nedenler, özellikle gelişim sırasında, bu tür karşılaştırılabilir hücrelere erişmeyi zorlaştırır veya imkansız kılar. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), in vitro 5,6'da erişilemeyen hücre tiplerinin üretilmesine izin verir, deneysel olarak erişilebilirdir ve primat karşılaştırmaları için kullanılmıştır6,7,8,9,10,11,12,13,14.
iPSC'ler oluşturmak için, yeniden programlanacak birincil hücrelerin edinilmesi gerekir. İdrardan izole edilen hücreler, primatlardan invaziv olmayan bir şekilde örneklenebilmeleri ve muhtemelen kök hücre benzeri moleküler profilleri nedeniyle kolayca yeniden programlanabilmeleri avantajına sahiptir15. Primat iPSC'lerini korumak için kültür koşulları, yeniden programlama kadar önemlidir; Klasik olarak, insan pluripotent kök hücrelerinin kültürü, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) için gerekli besinleri ve bir iskele sağlayan, tanımlanmamış, serum bazlı bir ortam ve fare embriyonik fibroblastlarının (besleyici hücreler olarak adlandırılır) ortak kültürünü gerektiriyordu16. Kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen kültür sistemlerinin geliştirilmesinden bu yana17,18, artık ticari olarak temin edilebilen iPSC kültür ortamları ve matrisleri için çeşitli seçenekler bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu kültür koşullarının çoğu insan ESC'leri ve iPSC'leri için optimize edilmiştir ve bu nedenle NHP iPSC kültüründe daha az iyi çalışabilir. Bu video protokolünde, idrar hücre kültüründen türetilen insan ve NHP iPSC'lerinin üretilmesi ve sürdürülmesi için talimatlar sunuyoruz.
2006 yılında fibroblastlarda tanımlanmış faktörlerin zorla ekspresyonu ile iPSC üretiminin ilk raporundan bu yana, bu yöntem çeşitli kökenlerden birçok farklı hücre tipine uygulanmıştır 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Bunlar arasında, sadece idrar kaynaklı hücreler tamamen invaziv olmayan bir şekilde elde edilebilir. Zhou ve ark.33 tarafından daha önce tarif edilen protokole dayanarak, geniş spektrumlu antibiyotikleri15 destekleyerek, steril olmayan örneklerden bile primat idrarından hücreleri izole edebilir ve genişletebilir. Özellikle, bu protokol tarafından örneklenen idrar türevi hücreler, fibroblastların geleneksel yeniden programlanmasından (deneyimlerimize göre 20-30 gün) daha kısa bir süre içinde (koloniler 5-15 gün içinde görünür hale gelir) ve yeterince yüksek bir başarı oranıyla iPSC'ler üretmek için yüksek bir potansiyel sergiler. Bu idrar kaynaklı hücreler, mezenkimal kök hücre benzeri hücrelerin ve mesane epitel hücrelerinin karışık popülasyonu olarak sınıflandırıldı ve yüksek yeniden programlama verimliliğine neden oldu15.
Birincil hücrelerdeki varyasyona ek olarak, iPSC'leri oluşturmak için yeniden programlama yöntemleri de kullanım amacına göre değişir. İnsan somatik hücreleri için geleneksel yeniden programlama prosedürleri, eksojen DNA'nıngenom 5,34,35'e entegrasyonuna izin veren retrovirüs veya lentivirüs vektörleri ile yeniden programlama faktörlerinin aşırı ekspresyonu ile gerçekleştirildi. Üretilen iPSC'leri genomik olarak sağlam tutmak için, araştırmacılar çok çeşitli entegrasyon dışı sistemler geliştirdiler - uyarılabilir PiggyBac vektörü36,37, epizomal vektör38,39, Sendai virüsü 40 ve adenovirüs41 gibi entegre olmayan virüs vektörleri, mRNA transfeksiyonu 42, protein transfeksiyonu 43,44 ve kimyasal bileşik tedavisi 45. Kullanımdaki verimlilik ve kolaylık nedeniyle, Sendai virüsü tabanlı yeniden programlama vektörleri bu protokolde kullanılır. Primer hücrelerin enfeksiyonu, kaplamadan önce 5'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) hücrelerin ve virüslerin 1 saatlik süspansiyon kültüründe gerçekleştirilir. Bu modifiye adım, virüslerin doğrudan yapışkan hücre kültürüne eklendiği geleneksel yönteme kıyasla hücre yüzeyleri ve virüsler arasındaki temas olasılığını artırabilir ve böylece daha fazla iPSC kolonisi15 verebilir.
İnsan ve NHP pluripotent kök hücrelerin geçişi, kümelenme geçişi ve tek hücreli geçiş ile yapılabilir. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), kalsiyum ve magnezyum iyonlarını bağlayan ve böylece kadherin ve integrinin yapışkan aktivitesini önleyen uygun maliyetli bir şelatlama ajanıdır. EDTA ayrıca hafif, seçici bir ayrışma reaktifi olarak da kullanılır, çünkü farklılaşmamış hücreler farklı yapışma molekülleri nedeniyle farklılaşmış hücrelerden önce ayrılırlar. Tam ayrışma, primat iPSC'lerinin Rho / Rho ile ilişkili sarmal bobin içeren protein kinaz (Rho / Rock) aracılı miyozin hiperaktivasyonu yoluyla masif hücre ölümüne neden olur. Bu nedenle, kültür ortamının bir Rho / Rock inhibitörü ile desteklenmesi,süspansiyon 46,47'de tek hücre gerektiren deneyler için gereklidir. Bu protokolde, rutin geçiş yöntemi olarak küme geçişini öneriyoruz ve tek hücreli geçişi yalnızca gerekli olduğunda, örneğin tanımlanmış hücre numaralarının tohumlanması gerektiğinde veya alt klonlama sırasında öneriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Accumax&#8482; cell detachment solution (Detachment solution)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SCR006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B-Solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>A2941-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60064</td>
			<td>Dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-122-965</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#8482; (Cell freezing medium)</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>BB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess&#8482; II automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoKing&#174; 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)</td>
			<td>Sued-Laborbedarf</td>
			<td>52 95-0213</td>
			<td>Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune&#8482;-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A16518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI 4&#39;,6-Diamidine-2&#39;-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10236276001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM High Glucose</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 w L-glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15373541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor&#8482; 594</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21207</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o Calcium w/o Magnesium</td>
			<td>TH.Geyer</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>710524</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN06.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 15 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>188271-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube 50 mL conical bottom</td>
			<td>Greiner BIO-ONE</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo V10.8.2</td>
			<td>FlowJo&#160;</td>
			<td>663441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex&#8482; LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX&#8482; Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell&#8482; 240i CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16416639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus HeraSafe safety cabinet</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>51017905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF, premium grade</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ&#160;</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>Version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL</td>
			<td>Nerbe Plus</td>
			<td>04-212-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse TE2000-S</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1368</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1420</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-beta-III Tubulin antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1195</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR&#8482; 1</td>
			<td>STEMCELL Technolgies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4903S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocure&#8482; (Antimicrobial Reagent)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-noc</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-4 Rabbit Antibody&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2750S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 &#181;g/mL Streptomycin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human PDGF-AB</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-00AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>4-16KS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Basal Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renal Epithelial Cell Growth Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-400-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4900S</td>
			<td>Dilution: 1/400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA4 (MC813) Mouse mAb</td>
			<td>NEB</td>
			<td>4755S</td>
			<td>Dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemFit&#174; Basic02</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>3821.00</td>
			<td>The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE&#8482; Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12563011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath Precision GP 05</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TSGP05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>BYT-ORB153635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody dilution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REMC medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary urine medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PSC generation medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For composition see the supplementary table S1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and maintenance of primate induced pluripotent stem cells derived from urine

Primat pluripotent kök hücreleri ve türevlerini inceleyen türler arası yaklaşımlar, hastalık, gelişim ve evrimin moleküler ve hücresel mekanizmalarını daha iyi anlamak için çok önemlidir. Primatların neden olduğu pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) daha erişilebilir hale getirmek için, bu makale idrardan türetilmiş hücrelerden insan ve insan olmayan primat iPSC'leri üretmek için invaziv olmayan bir yöntem ve bunların besleyicisiz bir kültürleme yöntemi kullanılarak sürdürülmesini sunmaktadır.
İdrar, steril olmayan bir ortamdan (örneğin, hayvanın kafesi) örneklenebilir ve kontaminasyonu etkili bir şekilde azaltmak için birincil hücre kültürü sırasında geniş spektrumlu bir antibiyotik kokteyli ile muamele edilebilir. İdrar kaynaklı hücrelerin çoğaltılmasından sonra, iPSC'ler ticari olarak temin edilebilen bir Sendai virüs vektör sisteminin modifiye edilmiş bir transdüksiyon yöntemi ile üretilir. İlk iPSC kolonileri 5 gün sonra zaten görülebilir ve en erken 10 gün sonra toplanabilir. Enzimsiz ayrışma tamponu ile rutin kümelenme geçişi, 50'den fazla pasaj için üretilen iPSC'lerin pluripotensini destekler.

Hücreleri insan ve NHP idrarından izole ederken, izolasyondan hemen sonra farklı hücre tipleri tanımlanabilir. Skuamöz hücrelerin yanı sıra çeşitli küçük yuvarlak hücreler idrarla atılır; Kadın idrarı, erkek idrarından çok daha fazla skuamöz hücre içerir (Şekil 1B - Gün 0; Ek Şekil S1). Primer idrar ortamında 5 günlük kültürden sonra ilk yapışık proliferasyon yapan hücreler görülebilir (Şekil 1A,B <...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine at JoVE.com

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Mevcut protokol, insan ve insan olmayan primat idrar türevi hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) izole etmek, genişletmek ve yeniden programlamak için bir yöntemin yanı sıra yeni üretilen iPSC'lerin besleyicisiz bakımı için talimatları açıklamaktadır.

İdrardan Elde Edilen Primat Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Üretimi ve Bakımı

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

Primat IPSC'ler yararlıdır, ancak etik ve teknik sorunlar nedeniyle elde edilmesi genellikle zordur. Bu protokol, primat IPSC'lerinin oluşturulması ve bakımı için en erişilebilir yolu sağlar. İdrar hücrelerinin IPSC'lerin birincil kaynağı olarak kullanılması, herhangi bir özel teknik olmadan tamamen invaziv olmayan bir şekilde elde edilebildikleri için büyük bir avantaja sahiptir.Prosedürü gösteren, Wolfgang MS Laboratuvarı'ndan doktora öğrencisi Jessica Radmer olacak. Başlamak için, idrar içeren tüpü 400G'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Daha sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin, tüpte yaklaşık bir mililitre bırakın ve peleti içine yeniden askıya alın.Amfoterisin içeren 10 mililitre idrar yıkama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve süspansiyonu serolojik bir pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve tüpte yaklaşık 0.2 mililitreden az bırakın. Hücre peletini, başlangıçta işlenmiş idrarın 50 mililitresi başına amfoterisin içeren bir mililitre birincil idrar ortamında yeniden askıya alın.Jelatini çıkarın ve süspansiyonun bir mililitresini jelatin kaplı 12 kuyucuklu bir kutucuk içine ekleyin. Plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir bazal membran matrisi kaplamalı 12 kuyu plakası hazırlamak için, kuyu başına 500 mikrolitre bazal membran matrisi ekleyin.Sıvıyı dağıtmak için plakayı hareket ettirin ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bazal membran matrisini 900 mikrolitre REMC ortamı ile değiştirin ve kullanıma kadar 37 santigrat derecede saklayın. Denklemi kullanarak beş enfeksiyon çokluğu için gereken Sendai virüslerinin hacmini hesaplayın.Sendai yeniden programlama kitinin bileşenlerini 37 santigrat derecede temperlenmiş su banyosunda hızla çözün. Sendai virüslerinin hesaplanan hacmini eklemeden ve karıştırmadan önce bir tüpe toplam 100 mikrolitre REMC ortamı ekleyin. Üriner hücrelerin makalede açıklandığı gibi ayrışmasından sonra, hücre sayacını kullanarak hücreleri sayın ve istenen sayıda hücreyi 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.Pelet santrifüjleme ile elde edin ve hazırlanan Sendai virüsü karışımının 100 mikrolitresinde tekrar askıya alın. Süspansiyon enfeksiyonu için tüpü 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu bazal membran matrisi kaplı 12 kuyucuk plakasına tohumlamadan önce toplam bir mililitreye REMC ekleyin.Transdüksiyondan sonra, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin veya IPSC'nin, beşinci günde PSC üretim ortamına geçerek kolonilerin gelişmesine kadar her iki günde bir ortamı değiştirin. IPSC kolonileri kümelenme geçişi için yeterince büyüdüğünde, ortamı kültürlenmiş hücrelerden aspire edin ve hücreleri 500 mikrolitre DPBS ile dikkatlice yıkayın. DPBS'yi çıkardıktan sonra, kuyuya 500 mikrolitre 0.5 milimolar EDTA ekleyin ve iki ila beş dakika boyunca inkübe edin.Koloniler ayrılmaya başlayana kadar mikroskop altındaki hücreleri dikkatlice gözlemleyin. Kolonilerin kenarları soyulmaya başladığında ve hücreler arasındaki boşluklar görünür hale geldiğinde, EDTA'yı çıkarın ve dikkatlice 500 mikrolitre DPBS ekleyin. DPBS'yi aspire edin ve bir P-1000 pipet kullanarak kuyuyu 500 mikrolitre PSC kültür ortamıyla yıkayın.Kolonileri uygun büyüklükte kümelere dağıtmak için pipet yukarı ve aşağı. Akıcılığa, tohumlanan hücrelerin istenen yoğunluğuna ve IPSC klonal tercihine bağlı olarak, hücre küme süspansiyonunun 1/10 ila 1/50'sini yeni kuyucuklara aktarın. Kümeleri kuyuya eşit şekilde dağıtmak için plakayı birkaç kez yavaşça ileri geri hareket ettirin.Kümelerin yapışmasına izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede en az 30 dakika boyunca inkübe edin. Koloniler geçiş için yeterince büyüyene kadar ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin. İzolasyondan sonra, idrarla atılan skuamöz hücreler ve çeşitli küçük yuvarlak hücreler görülebilir.İlk yapışkan çoğalan hücreler görülebilir ve bu hücreler geçilebilen büyük kolonilere dönüşür. Biri epitel benzeri bir fenotipe sahip, diğeri ise uzatılmış şekle sahip daha mezenkimal benzeri bir fenotipe sahip iki farklı hücre tipi görülebilir. İlk geçişten sonra, idrar hücreleri tek katmanlı olarak büyür.IPSC'nin oluşumu sırasında, bazı yapışkan hücreler görülebilir ve bu hücreler, hücrelerin yeniden programlandığını gösteren morfolojik değişiklikler göstermeye başlar. Ayrıca, kolonileri oluşturan hücreler tipik embriyonik kök hücre morfolojisini gösterir. Üretilen tüm IPSC'ler, açıkça tanımlanmış kenarlara sahip sıkıca paketlenmiş hücrelerle karakterize edilen tipik embriyonik kök hücre benzeri koloni morfolojisini paylaşır.İmmünositokimya, goril IPSC'lerinde pluripotens ile ilişkili belirteçlerin ekspresyonunu test etmek için kullanıldı. Ayrıca, akış sitometri analizi, analiz edilen orangutan IPSC'lerinin TRA-1-60 için pozitif olduğunu göstermiştir. Ayrıca, goril IPSC'leri endoderm, mezoderm ve ektoderm soylarına ayrılabilir.Farklılaşmış hücre sayısının artması ve sınır bütünlüğü ve homojenlik kaybı, düşük IPSC kalitesini gösterir. Buna karşılık, tanımlanmış sınırlar, sıkı hücresel ambalajlar ve belirgin nükleoller, yüksek kaliteli IPSC'leri ifade eder. Koronal değişkenlik nedeniyle, primat IPSC'lerinin sağlıklı büyümesini sağlamak için bölme oranı, geçiş zamanlaması ve küme boyutu gibi klona özgü koşulları optimize etmek gerekir.Yerleşik IPSC'lerin kalite kontrolleri olarak, marker gen ekspresyonunu kontrol etmenin yanı sıra, in vitro EV farklılaşması gibi doğrudan veya dolaylı farklılaşma indüksiyonu ile pre-potens doğrulanabilir.