פרוטוקול זה מתאר טכניקה לבידוד תפוקה גבוהה של טובולין מהמוח החזירי המותאם למכשור בקנה מידה קטן. את הליכי הבידוד משלימים נהלים לקביעת פעילות פילמור טובולין במבחנה באמצעות מבחני שיקוע משותף ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת.
רקמה עצבית מכל מקור היא חומר מצוין לבידוד טובולין, שכן הדנדריטים והאקסונים של הנוירונים עשירים במיקרוטובולים. כאן, אנו מציגים הליך לחילוץ טובולין שניתן להשתמש בו, עם שינויים קלים, עבור רקמה עצבית ממקורות מרובים. בפרוטוקול המוצג הוצג שלב הבהרה חדש של הליזט הגולמי, שהוביל להפחתה משמעותית בכמות הראשונית של פסולת בלתי מסיסה לפני שלב הפילמור הראשון. צעד נוסף זה איפשר עיבוד של רקמה נוספת תוך שימוש באותו מכשור, ובכך להגדיל את הנפח היחסי של הומוגנט מעובד. לשלב החדש שהוצג אין השפעה משמעותית על איכות הטובולין המטוהר, כפי שאושר על ידי בדיקות פעילות חוץ גופית ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. ההליך המתואר מכיל את כל השלבים המכריעים, כולל איסוף רקמות, הובלה, הומוגניזציה של רקמות, מחזורי בידוד טובולין וליטוש סופי על ידי כרומטוגרפיה של חילופי יונים באמצעות FPLC ומבחני מדידת פעילות עוקבים. ההומוגניות של טובולין מטוהר הייתה יותר מ -97%, כפי שאושר על ידי ניתוח MS / MS באמצעות יינון אלקטרוספריי ו- MALDI-TOF.
מיקרוטובולים, חוטי חלבון חלולים (בקוטר 24 ננומטר) הנוצרים על ידי הטרודימרים אלפא ובטא-טובולין, מעורבים בתהליכים תאיים חיוניים שונים. הם משתתפים ביצירת מבנים תוך-תאיים, תנועתיות, חלוקת תאים, התמיינות תאים, הובלה תאית, תחזוקת צורה והפרשת1. התפקודים התאיים של מיקרוטובולים יכולים להיות מושפעים מאינטראקציות ישירות או עקיפות עם חלבונים הקשורים למיקרוטובולים (MAPs) וחלבונים אחרים או באמצעות שינויים מורכבים לאחר התרגום המוגדרים בקוד טובולין2.
סיבי טובולין נובעים מאינטראקציות דינמיות לא קוולנטיות, בין תת-יחידות אלפא ובטא במנגנון התארכות הנוקלציה. מיקרוטובולים קצרים נוצרים, והצמיחה הבאה של סיבי טובולין מושגת על ידי התארכות הפיכה בשני הקצוות, ויוצרים גלילים המורכבים מהטרודימרים טובולין המסודרים בפרוטופילמנטים מקבילים2. אי-יציבות דינמית מתייחסת לעובדה שמיקרוטובולים מורכבים לרוב אינם נמצאים בשיווי משקל עם תת-היחידות שלהם, אך יכולים לעבור מעבר פאזה בין תקופה ממושכת של צמיחה והתכווצות תוך שמירה על מצב יציב 1,2.
חוסר היציבות הדינמי של סיבי טובולין מנוצל בעיקר בהליכי הפרדה וטיהור רבים של טובולין באמצעות מחזורים של פילמור בטמפרטורה גבוהה ודה-פולימריזציה בטמפרטורה נמוכה בסביבה של גליצרול בעל טוהר גבוה, DMSO, GTP/ATP,MG 2+ או חומרים כימיים אחרים (כגון טקסול או פוליקטיונים)3. רוב הליכי ההפרדה4 מלווים בכרומטוגרפיה של חלבונים 5,6,7,8,9, המבטיחה הפרדה של חלבונים הקשורים לטובולין עם דיפוספוקינאז נוקלאוזידי ופעילותATPase 5. תוצאות דומות ניתן להשיג על ידי שימוש במאגרי מלח גבוהים10. מקורות מרובים, כולל רקמות עצביות 11,12,13,14 ורקמות לא עצביות 15, דגים16 (מים מתוקים וימיים), שמרים או גרסאות רקומביננטיות17 שבוטאו יתר על המידה בזני ייצור שונים 11,12,13,14, ומקורות אחרים 9,18 שימשו לשבירה ו טיהור.
הפרוטוקול המוצג משתמש במשקעים ובכרומטוגרפיה של חלבונים כדי לבודד טובולין מהמוח החזירי להומוגניות גבוהה (איור 1). היתרון העיקרי הוא תפוקה גבוהה יחסית המושגת באמצעות מכשור זמין במעבדות המצוידות לניסויים שגרתיים בביולוגיה מולקולרית.
הרכב כל הפתרונות והמכשור מתואר בטבלת החומרים. כל התמיסות הוכנו באמצעות כימיקלים בדרגת FPLC וסוננו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. ציוד מגן אישי, כגון מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי בטיחות, שימשו במהלך כל הפעולות. כל המכשירים היו נקיים וללא עקבות של חומרי ניקוי. במהלך ההליכים ננקטו הנחיות מתאימות לטיפול בבעלי חיים (כפי שאושרו על ידי המוסד). כל החומר הביולוגי, כולל רקמת המוח, נקנה מבית מטבחיים כחומר גלם. בשום שלב של הפרוטוקול לא נעשה שימוש בבעלי חיים חיים.
1. הפעלת עמודת פוספו-צלולוז לכרומטוגרפיה נוזלית חלבונית מהירה
2. אריזת עמודת פוספו-צלולוז
3. הפרדת טובולין וטיהור
הערה: טובולין נוטה מאוד להתכלות, וחיוני להמשיך במהירות. את כל הפתרונות, המכשירים והציוד יש להכין, לקרר או לחמם, במידת הצורך, מראש. ההליכים רגישים לשינויים בטמפרטורות המומלצות. רקמת המוח צריכה להיות מעובדת בהקדם האפשרי לאחר נתיחה, בהתחשב בכמות הפסולת הביולוגית המיוצרת במהלך הטיהור. ההליך היה מותאם עבור הרוטור עם שש קוביות אולטרה-צנטריפוגה 75 מ"ל. כמות הרקמה המעובדת ניתן להגדיל או להקטין על פי אולטרה צנטריפוגה זמין.
במהלך שלבי ההפרדה והטיהור נלקחו דגימות עבור אלקטרופורזה SDS-PAGE ולאחר מכן נותחו באמצעות צביעה כחולה קומאסית (איור 2). 20 μL מכל דגימה עורבבו עם 10 μL של חיץ דגימת Laemmli (188 mM Tris-HCl pH 6.8, 3% SDS (w/w), 30% גליצרול (v/v), 0.01 ברומופנול כחול (w/w), 15% β-מרקפטואתנול) והודגרו ב-95°C למשך 15 דקות. 4 μL מכל דגימה הועמסו על 12.5% ג'ל SDS אקרילאמיד והופרדו תחת זרם קבוע של 30 mA לג'ל בתנאי הפחתה ודנטורציה.
התוצאות אישרו עלייה הדרגתית בריכוז הטובולין היחסי המלווה בירידה בחלבונים מזהמים. יתר על כן, לא היה אובדן משמעותי של טובולין בליזט מזוקק בצנטריפוגה הראשונה (שלב 3.2.7) בהשוואה להשמטת שלב זה (איור 2A,B).
ריכוז החלבון נקבע באמצעות שלוש שיטות עצמאיות: בדיקת BCA, בדיקת חלבון ברדפורד וניתוח דנסיטומטריה בג'ל SDS-PAGE19 (איור 3). התשואה הכוללת של טובולין באמצעות ההליך המתואר הייתה 123 מ"ג של טובולין מטוהר מ 250 גרם של רקמה עצבית. במהלך המדידות יש לקחת בחשבון שלריכוז ה-DTT הגבוה במאגר האחסון יש השפעה משמעותית על בדיקת BCA. הן מאגר PEM והן מאגר PBS, בתוספת DTT, מגדילים את ספיגת הרקע בכ- 0.900 A595, מה שמקטין באופן משמעותי את קיבולת בדיקת BCA (איור 3A). ההשפעה השלילית של DTT ניתנת לזיהוי גם לאחר דילול פי עשרה עם מים טהורים (הנתונים אינם מוצגים). נראה כי בדיקת ברדפורד לא הושפעה ממאגר האחסון (איור 3B), כפי שאושר על-ידי ניתוח צפיפות.
טוהר הכנת טובולין אומת על ידי ניתוח ספקטרומטריית מסות בשני מתקנים עצמאיים (VRI Brno, צ'כיה; CEITEC MU Brno, צ'כיה) באמצעות יינון אלקטרוספריי ו- MALDI-TOF. שני הניתוחים אישרו את נוכחותם של טובולינים חזיריים אלפא ובטא במספר איזופורמים. הטוהר הכללי היה יותר מ-97.07% (PSMs 1065), כאשר הזיהומים הנפוצים ביותר מקורם בהומו ספיינס קרטין סוג II (PSMs 246, 2.24% מהזיהומים) אשר הוכנסו ככל הנראה במהלך בידוד טובולין והכנת הדגימה לניתוח MS/MS. זיהומים אחרים המורכבים מ-322 PSMs ורק אלבומין בסרום, גמא אקטין וטריפסינוגן שמקורם ב-Sus scrofa זוהו ברזולוציה פפטידית אחת (0.0069%).
בניסויים הבאים אומת שימור יכולת הפילמור לאחר הקפאת בזק ואחסון בחנקן נוזלי. האליקוט 10 מ"ג/מ"ל הוסר מחנקן נוזלי והופשר לאט על קרח. דגימות בריכוזים שונים (10 מ"ג/מ"ל, 8 מ"ג/מ"ל, 6 מ"ג/מ"ל, 4 מ"ג/מ"ל ו-2 מ"ג/מ"ל) הוכנו על ידי דילול האליציטוטים במאגר PEM המכיל DTT, ATP ו-GTP לצורך ניסוי ההרכבה העצמית. סדרת דילול אחת הודגרה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, והשנייה הודגרה על קרח במשך 60 דקות. שתי הסדרות היו צנטריפוגות במשך 60 דקות בטמפרטורה של 21,000 x גרם ובטמפרטורה המתאימה (4°C או 37°C). 30 μL של supernatant הוסר ושימש עבור SDS-PAGE. הסופרנאטנט שנותר הוסר בזהירות באמצעות פיפטה והושלך לפח. הכדוריות נשטפו לזמן קצר על ידי הוספת 100 מיקרומטר של חיץ PEM, ולאחר מכן הסרה מיידית באמצעות פיפטה. לאחר מכן, הכדורים הושעו מחדש ב-50 מיקרוליטר של חיץ העמסת SDS מרוכז פי 1, כך שהריכוז היחסי של הגלולה והסופרנאטנט נשמר. 10 μL של חיץ העמסת SDS נוסף לכל סופרנטנט. כל הדגימות נותחו באמצעות SDS-PAGE וצביעת קומאסי (איור 4). נפח כל דגימה שנטענה ל- SDS-PAGE הותאם בהתאם לריכוז ההתחלתי, ולכן ההבדל במשקעים עקב הריכוז בולט יותר. בדיקת ההרכבה העצמית של טובולין במאגר PEM אישרה את היכולת ליצור סיבי טובולין באופן תלוי טמפרטורה.
בדיקת ההרכבה של טובולין20,21 המונעת על ידי MAP2c המאמתת את יכולתו של טובולין לתקשר עם חלבונים אחרים בוצעה22. הדילולים הסדרתיים של MAP2c הוכנו כאשר 100 μL של 1 מ"ג / מ"ל טובולין aliquots עורבבו עם MAP2c לריכוז הסופי שנע בין 0 μM ל 8 μM. כל הדגימות הוכנו על קרח על ידי דילול במאגר PEM טרי שהוכן עם 1 mM DTT ו- 1 mM GTP. הטובולין הודגר במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C עם ריכוזים שונים של MAP2c, וצנטריפוגה במשך 60 דקות בטמפרטורה של 21,000 x גרם ו-37°C. השטיפה הסופית של הגלולה בוצעה פעמיים עם 100 μL של חיץ PEM. הניסוי אישר את יכולתו של הטובולין המוכן לעבור פילמור מונחה MAP2c, מאחר שרק הדגימה ללא MAP2c לא יצרה גלולה (איור 5).
מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת שימש גם כדי לאשר את נוכחותם של חוטי טובולין מניסויי פילמור משותף. תרחיפים של טובולין מטוהר עם MAP2c הוכנו למיקרוסקופ אלקטרונים שידור באמצעות צביעה שלילית. הדגימות נספגו על רשתות נחושת מצופות פורמבר ומיוצבות פחמן. לאחר מכן הוכתמו הרשתות באופן שלילי עם 2% NH4MoO4 ונבדקו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים בהגדלה של פי 18,000 ובמתח מואץ של 80 קילו וולט. נוכחותם של מיקרוטובולים הומוגניים בעלי מבנה נימה ברור וגודל מתאים הראתה את היכולת ליצור מיקרוטובולים בקונפורמציה טבעית (איור 6).
איור 1: תרשים סכמטי של הפרדה וטיהור טובולין. המספר בסוגריים מתייחס לשלב הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הפרדה וטיהור טובולין. (A) ניתוח SDS-PAGE של דגימות שנלקחו במהלך הפרדת טובולין תוך שימוש בפילמור מונחה טמפרטורה (3 מיקרוליטר לשורה). ניתן לראות את הירידה בזיהומים עם עלייה יציבה בשפע טובולין יחסי (כ -50 kDa). המספרים מעל כל שורה תואמים למספר השלב בפרוטוקול. (B) ניתוח SDS-PAGE של שברים המתקבלים לאחר כרומטוגרפיה של חלבון על שרף פוספו-צלולוז (4 מיקרוליטר לשורה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ריכוז חלבונים. סדרת הדילול של אלבומין בסרום בקר של עד 1 מ"ג/מ"ל במאגר PEM או PBS הושוותה לסדרת דילול BSA המכילה 0.1 ATP, 1 mM GTP, 1 mM DTT בנפרד או בשילוב (0.1 mM ATP, 1 mM GTP ו-1 mM DTT) במאגר PEM או PBS. (A) כאשר נעשה שימוש בבדיקת BCA, חל שינוי משמעותי ברקע של דגימות המכילות DTT (סמלים מוצקים). (B) השפעה זו לא זוהתה כאשר נמדדו ריכוזים בבדיקת ברדפורד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בדיקת הרכבה עצמית של טובולין. ניתוח SDS-PAGE של בדיקת ההרכבה העצמית אישר את היכולת של טובולין מאוחסן מודגר ב (A) 4 ° C או (B) 37 ° C כדי להתפלמר באופן תלוי טמפרטורה בספקטרום רחב של ריכוזים. (P - כדור, S - סופרנטנט; ריכוז הטובולין בהתאמה מסומן מעל כל זוג שורות; כמות כל דגימה שהוטענה הייתה 10 מיקרוגרם). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: בדיקת שיקוע משותף של טובולין. ניתוח SDS-PAGE של הרכבת טובולין בסיוע MAP2c אישר את היכולת של טובולין מאוחסן לעבור פילמור המונע על ידי אינטראקציה עם חלבון הקשור למיקרוטובולים באופן תלוי ריכוז. הריכוז המולרי של MAP2c מצוין מעל כל שורה. (P - גלולה, S - supernatant). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. המיקרו-תצלומים של TEM הראו כי טובולין מתכנס (A) למיקרוטובולים בקוטר מתאים (B) המורכבים מחוטי טובולין הומוגניים המעוטרים בחלבוני MAP2c. הסרגל מתאים ל- 1000 ננומטר (A) ו- 200 ננומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
הרקמה העצבית מכל מקור שהיא היא חומר מצוין לבידוד טובולין, שכן הדנדריטים והאקסונים של תאי העצב עשירים במיקרוטובולים (עד 40%)23. רקמת מוח ניתן להשיג בקלות יחסית בכמויות מספיקות. החיסרון העיקרי עשוי להיות רמה לא מוגדרת של שינויים לאחר תרגום, אשר יכול להשפיע על ניסויים הבאים24,25. אחרת, הדאגה היחידה היא השפלה מהירה של חומר מוצא, במיוחד בתנאים חמים. השתמשנו במספר בורסות חיץ העברה כדי לשפר את פיזור החום לפני ההובלה והובלה מהירה לעיבוד, שמתחיל בהקדם האפשרי. הרקמה הטרייה מנותחת בתנאים המונעים חימום והומוגנית בחיץ המכיל GTP וגליצרול, המייצב עוד יותר את טובולין26.
בפרוטוקול המוצג, שלב ההבהרה (שלב 3.2.7) של הליזט הגולמי הוצג. צנטריפוגה ממושכת לפני הפילמור הראשון אינה מומלצת בדרך כלל בשל רגישות טובולין לשינויים בלתי הפיכים ופרוטאזות. מצד שני, הניסויים הנוכחיים הראו כי סיבוב קצר בכוח G גבוה מפחית את הפסולת ובכך מגדיל את הנפח היחסי של ההומוגנט המעובד מבלי להשפיע באופן משמעותי על איכות הטובולין.
קביעת ריכוז החלבונים המדויקת חיונית לניסויים נוספים, בעיקר כאשר נחקרות אינטראקציות עם חלבונים או מעכבי טובולין. במהלך החקירות נתקלנו בהבדלים משמעותיים בתוצאות בדיקות ריכוז החלבון. הסיבה העיקרית הייתה נוכחותם של DTT, GTP ו-ATP בריכוזים גבוהים שהפריעו למבחנים. בדיקת BCA הועברה לגבולות העליונים עקב הכמות הגבוהה של DTT במאגר האחסון, מה שהפחית את קיבולת הבדיקה. יתר על כן, מקסימום הספיגה הדומה של חלבונים ו- ATP או GTP גרם לחוסר עקביות בקביעת ריכוז החלבונים באמצעות ספיגה של 280 ננומטר. אותה בעיה הורגשה בקריאות מגלאי ה- UV FPLC. הבדיקה האמינה ביותר, עם תוצאות יציבות, הייתה בדיקת חלבון ברדפורד, שם לא נצפתה השפעה של תרכובות חיץ. עם זאת, חיוני להכין את סדרת הדילול הסטנדרטית של החלבון במאגר האחסון.
היכולת של טובולין מטוהר ליצור סידורים מתאימים היא תנאי מוקדם לניסויים הבאים. טובולין, מטבעו, נוטה מאוד להתכלות אפילו בסביבה עשירה בגליצרול-GTP, וכתוצאה מכך יכולת מופחתת ליצור חוטים הומוגניים. זה קריטי לעקוב אחר תהליך הטיהור ולאמת באופן ניסיוני את היכולת של טובולין מאוחסן להתפלמר לתוך חוטים קבועים יציבים. מספר שיטות עצמאיות המאמתות את מצב טובולין הוכנסו in vivo ו- in vitro. בין הבולטים שבהם, ספקטרוסקופיית הדיכרואיזם המעגלי27, בדיקת תהודה פלסמונית פני השטח28, בדיקת שינוי תרמי29, בדיקת עיכוב פילמור30, צביעת אימונופלואורסנציה31,32, משקעים22,33 וניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת32 ניתן להזכיר. בדיקת פילמור ומשקעים משותפים של טובולין המשמשים בפרוטוקול זה קלים לביצוע. ניתן להעריך אותם במהירות על ידי הכדוריות המתרחשות בתחתית הצינור או באמצעות SDS-PAGE. מצד שני, טובולין מושקע יכול להיות בצורה של אגרגטים. יש לכלול שיטות מתוחכמות יותר, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, כדי לאשר את נוכחותם של סיבי מיקרוטובול לבקרת איכות.
למחברים אין מה לחשוף.
המחקר נתמך על ידי הסוכנות הטכנולוגית של הרפובליקה הצ'כית (פרויקט nr. TN02000017 - המרכז הלאומי לביוטכנולוגיה ברפואה וטרינרית - NaCeBiVet).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL tubes | --- | --- | Common material |
10 mL tubes | --- | --- | Common material |
50 mL tubes | --- | --- | Common material |
ATP | ROTH | HN35.2 | Analytical grade |
DMSO | ROTH | A994.2 | Analytical grade |
Dounce glass homogenizer | P-LAB | H244043 | Homogenizer |
DTT | ROTH | 6908.1 | Analytical grade |
EGTA | ROTH | 3054.3 | Analytical grade |
Ethanol | PENTA | 70390-11001 | Analytical grade |
Glycerol | ROTH | 6967.2 | Analytical grade |
Graduated beakers | --- | --- | Common equipment |
Graduated cilinders | --- | --- | Common equipment |
GTP | MERCK | 36051-31-7 | Very high quality |
HCl | PENTA | 19360-11000 | Analytical grade |
Izolated box for tissue transport | --- | --- | Common equipment |
Kitchen blender | Waring | 7011HB | Glass or plastic vessel |
Liquid nitrogen | --- | --- | Common material |
MES | ROTH | 6066.4 | Analytical grade |
MgCl2 | MERCK | 814733 | Analytical grade |
MgSO4 | PENTA | 43180-31000 | Analytical grade |
NaOH | PENTA | 15650-11000 | Analytical grade |
Optima XPN100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifuge |
Phosphocellulose column | VWR | GENO786-1291 | Empty column |
Phosphocellulose resin | Creative - Biomart, inc | Phosphate-001C | Ion exchange resin |
PIPES | ROTH | 9156.2 | Analytical grade |
Saccharose | PENTA | 24970-31000 | Analytical grade |
Scales | --- | --- | Common equipment |
Scissors | --- | --- | Common equipment |
Spoons | --- | --- | Plastic or glass |
Ti45 rotor | Beckman Coulter | 339160 | Rotor for Ultracentrifuge |
Tweezers | --- | --- | Common equipment |
Ultra turrax IKA T18 basic | IKA | 356 1000 | Laboratory dispenser |
Water bath 37 °C | --- | --- | Stirred |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved