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Summary

Questo protocollo descrive una tecnica per l'isolamento ad alto rendimento della tubulina dal cervello suino ottimizzata per la strumentazione su piccola scala. Le procedure di isolamento sono integrate da procedure per determinare l'attività di polimerizzazione della tubulina in vitro utilizzando saggi di co-sedimentazione e microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

Il tessuto neurale proveniente da qualsiasi fonte è un materiale eccellente per l'isolamento della tubulina, poiché i dendriti e gli assoni dei neuroni sono ricchi di microtubuli. Qui, presentiamo una procedura per l'estrazione della tubulina che può essere impiegata, con piccole modifiche, per il tessuto neurale da più fonti. Nel protocollo presentato, è stata introdotta una nuova fase di chiarificazione del lisato grezzo, che ha portato a una significativa riduzione della quantità iniziale di detriti insolubili prima che si verificasse la prima fase di polimerizzazione. Questo passaggio aggiuntivo ha permesso l'elaborazione di tessuto aggiuntivo utilizzando la stessa strumentazione e, quindi, aumentando il volume relativo dell'omogenato lavorato. La nuova fase non ha alcun effetto significativo sulla qualità della tubulina purificata, come confermato dai saggi di attività in vitro e dalla microscopia elettronica a trasmissione. La procedura descritta contiene tutte le fasi cruciali, tra cui la raccolta dei tessuti, il trasporto, l'omogeneizzazione dei tessuti, i cicli di isolamento delle tubuline e la lucidatura finale mediante cromatografia a scambio ionico mediante FPLC e successivi saggi di misurazione dell'attività. L'omogeneità della tubulina purificata è risultata superiore al 97%, come confermato dall'analisi MS/MS mediante ionizzazione elettrospray e MALDI-TOF.

Introduction

I microtubuli, filamenti proteici cavi (24 nm di diametro) formati da eterodimeri alfa e beta-tubulina, sono coinvolti in vari processi cellulari essenziali. Partecipano alla formazione delle strutture intracellulari, alla motilità, alla divisione cellulare, alla differenziazione cellulare, al trasporto cellulare, al mantenimento della forma e alla secrezione1. Le funzioni cellulari dei microtubuli possono essere influenzate da interazioni dirette o indirette con proteine associate ai microtubuli (MAP) e altre proteine o tramite complesse modificazioni post-traduzionali definite nel codice della tubulina2.

Le fibre di tubulina derivano da interazioni dinamiche non covalenti tra le subunità alfa e beta nel meccanismo di allungamento della nucleazione. Si formano microtubuli corti e la successiva crescita delle fibre di tubulina si ottiene mediante allungamento reversibile ad entrambe le estremità, formando cilindri costituiti da eterodimeri di tubulina disposti in protofilamenti paralleli2. L'instabilità dinamica si riferisce al fatto che i microtubuli assemblati spesso non sono in equilibrio con le loro subunità, ma possono subire una transizione di fase tra un periodo prolungato di crescita e restringimento mantenendo uno stato stazionario 1,2.

L'instabilità dinamica delle fibre di tubulina è utilizzata principalmente in molte procedure di separazione e purificazione della tubulina che utilizzano cicli di polimerizzazione ad alta temperatura e depolimerizzazione a bassa temperatura nell'ambiente di glicerolo ad alta purezza, DMSO, GTP/ATP, Mg2+ o altri agenti chimici (come il taxolo o i policationi)3. La maggior parte delle procedure di separazione4 sono seguite dalla cromatografia proteica 5,6,7,8,9, che assicura la separazione delle proteine associate alla tubulina con l'attività nucleosidica difosfochinasi e ATPasi 5. Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando tamponi ad alto contenuto di sale10. Fonti multiple, tra cui tessuti neurali 11,12,13,14 e non neurali15, pesci 16 (sia d'acqua dolce che marina), lieviti o varianti ricombinanti17 sovraespresse in diversi ceppi di produzione 11,12,13,14 e altre fonti 9,18 sono state utilizzate per il frazionamento e purificazione.

Il protocollo presentato utilizza la precipitazione e la cromatografia proteica per isolare la tubulina dal cervello suino in un'elevata omogeneità (Figura 1). Il vantaggio principale è una resa relativamente elevata ottenuta con la strumentazione disponibile nei laboratori attrezzati per esperimenti di biologia molecolare di routine.

Protocol

La composizione di tutte le soluzioni e la strumentazione è descritta nella Tabella dei Materiali. Tutte le soluzioni sono state preparate utilizzando sostanze chimiche di grado FPLC e filtrate attraverso un filtro da 0,22 μm prima dell'uso. Durante tutte le operazioni sono stati utilizzati dispositivi di protezione individuale, ad esempio camice da laboratorio, guanti e occhiali di sicurezza. Tutti gli strumenti erano puliti e privi di tracce di detergenti. Durante le procedure, sono state seguite le linee guida appropriate per la cura degli animali (approvate dall'istituto). Tutto il materiale biologico, compreso il tessuto cerebrale, è stato acquistato da un macello come materia prima. In nessuna fase del protocollo sono stati utilizzati animali vivi.

1. Attivazione di una colonna di fosfo-cellulosa per cromatografia rapida di proteine liquide

  1. Aggiungere 700 ml di etanolo al 50% a 15 g di resina secca di fosfocellulosa e mescolare delicatamente nel becher con un cucchiaio.
  2. Versare la sospensione in una colonna cromatografica adatta di volume appropriato (700 mL). Chiudere la colonna con pistoni dotati di fritta. Lasciare almeno il 10% di spazio vuoto per la testa.
    NOTA: È possibile utilizzare altri recipienti, ma la colonna FPLC, in combinazione con una pompa peristaltica, riduce significativamente il tempo necessario per l'attivazione della resina e le perdite di resina.
  3. Incubare su un rocker-shaker a 60 giri/min per 30 min.
  4. Lasciare depositare la resina e rimuovere l'eccesso di etanolo al 50% utilizzando la pompa peristaltica con il flusso impostato a 3 mL/min. Non lasciare asciugare la resina.
  5. Rimuovere il pistone superiore e aggiungere 300 ml di etanolo al 50%. Chiudere la colonna, agitarla brevemente e rimuovere l'etanolo in eccesso tramite una pompa peristaltica.
  6. Rimuovere l'etanolo rimasto. Aggiungere 300 ml di acqua ultrapura nella colonna, chiudere la colonna con il pistone e inclinarla fino a quando la resina non viene risospesa. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando una pompa peristaltica. Ripeti questo passaggio tre volte.
  7. Aprire la colonna nella parte superiore, aggiungere 500 mL di HCl 0,5 M, chiudere la colonna e risospendere la resina inclinandola delicatamente. Incubare su un rocker-shaker a 60 giri/min per 30 min.
    1. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando una pompa peristaltica. Aggiungere 300 mL di HCl 0,5 M, risospendere la resina e rimuovere il liquido in eccesso.
  8. Rimuovere l'HCl rimanente. Aggiungere 300 ml di acqua ultrapura nella colonna, chiudere la colonna con il pistone e inclinare fino a quando la resina non si risospensione. Rimuovere il liquido in eccesso utilizzando una pompa peristaltica. Ripeti questo passaggio tre volte.
  9. Versare i 700 mL di tampone MES (25 mM MES, 0,1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2) nella colonna e risospendere la resina inclinandola. Versare la sospensione nel becher, regolare il pH a 6,1 con 1 M di NaOH e lasciare incubare per 2 ore agitando delicatamente.
  10. Lasciare depositare la resina, decantare il liquido, aggiungere 300 ml di tampone MES, pH 6,4 e incubare per una notte a 4 °C.
  11. Decantare il liquido in eccesso, aggiungere etanolo al 96% alla concentrazione finale al 20% e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.

2. Impaccamento della colonna fosfo-cellulosica

  1. Versare 12 mL di resina attivata nella colonna cromatografica pulita con un tappo inferiore chiuso. Lascia che la resina si depositi. Il volume della resina depositata è di circa 5 mL. Rimuovere lo strato superiore di resina (circa 2-3 mm) dove potrebbero depositarsi frammenti di matrice più leggeri e rotti.
  2. Rimuovere il tappo inferiore e lasciare che la soluzione di conservazione si scarichi liberamente, goccia a goccia. Non lasciare asciugare la resina.
  3. Chiudere la colonna e collegarla al sistema FPLC. Lavare la colonna con tampone PEM (100 mM TUBI pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4) a 1 mL/min (pressione max. 1 bar) per 30 min, regolare l'altezza del pistone, capovolgere la colonna e lavare la colonna nelle stesse condizioni per i successivi 30 min nel flusso inverso.
  4. Conservare la colonna riempita con fosfocellulosa attivata a 4 °C per diversi giorni.

3. Separazione e purificazione della tubulina

NOTA: La tubulina è altamente incline alla degradazione ed è fondamentale procedere rapidamente. Tutte le soluzioni, gli strumenti e le attrezzature devono essere preparati, raffreddati o riscaldati, se necessario, in anticipo. Le procedure sono sensibili alle variazioni delle temperature consigliate. Il tessuto cerebrale deve essere processato il prima possibile dopo la dissezione, considerando la quantità di rifiuti biologici prodotti durante la purificazione. La procedura è stata ottimizzata per il rotore con sei cuvette di ultracentrifugazione da 75 mL. La quantità di tessuto processato può essere aumentata o diminuita in base all'ultracentrifuga disponibile.

  1. Trasporto di tessuti
    1. Mettere 500 g di cervelli suini appena sezionati (6-8 pezzi) in un recipiente di trasporto da 3 L e versare il tampone di trasporto ghiacciato (4,1 mM MES pH 7, 320 mM Saccharose, 1 mM EGTA) fino a quando non è completamente immerso. Lasciare riposare sul ghiaccio per 5 minuti e sostituire il tampone di trasporto con uno nuovo per facilitare la dissipazione del calore. Trasportarlo rapidamente sul ghiaccio per un'ulteriore lavorazione.
  2. Omogeneizzazione tissutale
    NOTA: L'omogeneizzazione tissutale viene effettuata su ghiaccio in una cella frigorifera. Tutti gli strumenti devono essere preraffreddati per evitare la polimerizzazione spontanea. La fonte primaria di tubulina è la materia grigia e il resto viene rimosso nei passaggi successivi.
    1. Versare 100 mL di tampone di estrazione (4,1 mM MES pH 7, 520 mM Saccharose, 1 mM EGTA, 1 mM ATP e 0,1 mM GTP) in un becher di plastica da 1 L e determinare il peso W1 (g) compreso il recipiente. ATP e GTP vengono aggiunti appena prima dell'uso.
    2. Estrarre il cervello suino dal recipiente di trasporto e rimuovere l'intero cervelletto, il grasso, i grossi pezzi di sostanza bianca, le meningi e i vasi sanguigni con le dita applicando una forza modesta. Si possono usare anche forbici o pinzette. Posizionare il cervello suino privato del tessuto indesiderato nel becher con 100 ml di tampone di estrazione freddo. Procedere fino a quando tutto il tessuto non è stato processato.
    3. Pesare il becher con il tessuto cerebrale lavorato e determinare il peso W2 (g).
    4. Aggiungere il tampone di estrazione secondo la formula, Peso del tampone di estrazione = W2 - W1 (ad esempio, per 400 g di tessuto, vengono aggiunti 300 g di ulteriore tampone di estrazione).
    5. Trasferire il tessuto cerebrale con il tampone di estrazione nel frullatore da cucina preraffreddato e lavorare in 4-8 brevi impulsi di tre secondi.
    6. Processare il tessuto parzialmente omogeneizzato con un omogeneizzatore a dispersione ad alta velocità (18.000 giri/min) per 1 minuto. Lasciare la sospensione in ghiaccio per 3-5 minuti, mescolando di tanto in tanto con un cucchiaio. Ripetere cinque volte o fino a completa omogeneizzazione.
    7. Versare in provette di ultracentrifugazione preraffreddate e centrifugare per 10 minuti, a 4 °C e 50.000 x g. Conservare il surnatante e scartare il pellet. Ripetere fino a raccogliere 430 ml di estratto chiarificato.
    8. Versare l'estratto chiarificato in provette di ultracentrifugazione preraffreddate (70 ml ciascuna) e centrifugare a 4 °C e 75.000 x g per 60 minuti. Raccogliere il surnatante e determinare il volume S1.
      NOTA: Se esiste un solo rotore, riscaldarlo a bagnomaria per la successiva fase di centrifugazione (37 °C).
  3. Prima polimerizzazione
    1. Aggiungere 10 tampone MEM (1 M MES pH 6,8, 10 mM EGTA, 10 mM MgCl2) secondo la formula V = S1/9 mL (per 585 mL di surnatante, aggiungere 65 mL di tampone MEM 10x). Mescolare bene e aggiungere glicerolo a 3,5 M e GTP a 0,1 mM di concentrazione finale. Versare la sospensione nelle provette per ultracentrifugazione (il volume del surnatante supera il volume delle provette; il resto viene scartato).
    2. Incubare le provette con il surnatante a bagnomaria per 45 minuti a 37 °C.
    3. Centrifugare i tubi per 90 minuti a 37 °C e 75.000 x g. Misurare il volume del surnatante (S2) per determinare il volume del tampone MEM, aggiungerlo ai pellet al punto 3.3.4 e quindi scartare il surnatante. Conservare il pellet dove è contenuta la tubulina polimerizzata.
    4. Preparare 0,5 x S2 volume di tampone MEM ghiacciato 1x. Aggiungere una quantità uguale di 1x tampone MEM in ciascuna provetta per ultracentrifuga con il pellet. Risospendere i pellet nel tampone MEM 1x aggiunto, trasferire le sospensioni nel cilindro graduato e determinare il volume totale.
      1. Aggiungere GTP alla concentrazione finale di 1 mM. Trasferire la sospensione in un omogeneizzatore di vetro Dounce e omogeneizzare la soluzione ogni 10 minuti circa per 45 minuti con ghiaccio. Il pistone deve essere azionato con attenzione in quanto può rompersi facilmente.
        NOTA: Nel frattempo, raffreddare il rotore in acqua con ghiaccio.
    5. Versare la soluzione omogeneizzata in provette di ultracentrifugazione preraffreddate e centrifugare a 75.000 x g e 4 °C per 60 minuti. Dopo la centrifugazione, determinare il volume del surnatante (S3).
  4. Seconda polimerizzazione
    1. Mescolare il surnatante con 0,35 x S3 mL di glicerolo e aggiungere GTP alla concentrazione finale di 1 mM. Versare il surnatante nelle provette per ultracentrifugazione e incubare per 45 minuti a 37 °C.
      NOTA: Nel frattempo, riscaldare il rotore a 37 °C nel bagnomaria.
    2. Centrifugare il surnatante polimerizzato dal passaggio 3.4.1 per 60 minuti a 75.000 x g e 37 °C. Determinare il volume del surnatante (S4).
      NOTA: Questo è un punto di arresto opzionale. Il pellet con tubulina può essere surgelato in azoto liquido e conservato a -80 °C.
    3. Lasciare scongelare lentamente i pellet congelati con ghiaccio per 30 minuti. Preparare 0,25 x S4 mL di tampone PIPES (500 mM PIPES pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP), dividere uniformemente in provette con pellet, risospendere i pellet con un cucchiaio e trasferire la soluzione in un omogeneizzatore di vetro Dounce. Omogeneizzare ogni 10 minuti con ghiaccio per 45 minuti.
      NOTA: Nel frattempo, raffreddare il rotore in acqua con ghiaccio.
    4. Versare la soluzione con tubulina depolimerizzata nelle provette di ultracentrifugazione e centrifugare per 60 minuti a 4 °C e 75.000 x g.
  5. Terza polimerizzazione
    1. Determinare il volume del surnatante (S5) e aggiungere S5/9 mL di DMSO. Versare la sospensione in provette per ultracentrifugazione e incubare per 20 minuti a 37 °C per polimerizzare.
      NOTA: Nel frattempo, riscaldare il rotore a 30 °C nel bagnomaria.
    2. Centrifugare la tubulina polimerizzata per 60 minuti a 75.000 x g e 30 °C. Determinare il volume del surnatante (S6) e conservare i pellet.
    3. Sciogliere i pellet in 0,25 x S6 mL di tampone PEM (100 mM TUBI pH 6,9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0,1 mM ATP). Utilizzare un omogeneizzatore in vetro Dounce per migliorare la solubilizzazione. Continuare ad aggiungere il tampone PEM fino a quando i pellet non sono completamente sciolti (non sono più visibili particelle opalescenti).
  6. Purificazione con cromatografia a scambio ionico
    NOTA: La cromatografia a scambio ionico inverso viene impiegata per rimuovere le proteine associate alla microtubulina. La tubolina scorre liberamente attraverso la colonna al pH dato e le proteine contaminanti vengono trattenute sulla resina fosfo-cellulosa. Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperature vicine ai 4° C o su ghiaccio. Non chiarificare l'estratto di tubulina prima della purificazione FPLC, né per filtrazione né per centrifugazione.
  7. Equilibrare l'FPLC e la colonna con il tampone PEM (100 mM PIPES pH 6.9, 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, 1 mM DTT, 0.1 mM ATP). Utilizzare almeno 10 volumi di colonna per l'equilibratura. La portata della pompa non deve superare la portata utilizzata per il riempimento della colonna (1 mL/min).
  8. Caricare lentamente la sospensione di tubulina (0,5 mL/min) sulla colonna e raccogliere la proteina non legata che scorre attraverso la resina.
  9. Aggiungere 10 μL di 100 mM GTP a ciascuna frazione di 1 mL contenente la proteina tubulina.
  10. Congelare le frazioni contenenti tubulina in azoto liquido e trasferirle immediatamente nel contenitore con azoto liquido. La tubulina può essere conservata per diversi anni in queste condizioni. La stabilità diminuisce rapidamente nell'arco di diversi mesi se la tubulina viene conservata a - 80 °C.

Representative Results

Durante le fasi di separazione e purificazione, sono stati prelevati campioni per l'elettroforesi SDS-PAGE e successivamente analizzati utilizzando la colorazione Coomassie-blue (Figura 2). 20 μL di ciascun campione sono stati miscelati con 10 μL di tampone campione Laemmli (188 mM Tris-HCl pH 6,8, 3% SDS (p/p), glicerolo 30% (v/v), 0,01 blu di bromofenolo (p/p), 15% β-mercaptoetanolo) e incubati a 95 °C per 15 min. 4 μL di ciascun campione sono stati caricati su gel SDS di acrilammide al 12,5% e separati sotto una corrente costante di 30 mA per gel in condizioni riducenti e denaturanti.

I risultati hanno confermato un aumento incrementale della concentrazione relativa di tubulina accompagnato da una riduzione delle proteine contaminanti. Inoltre, non c'è stata alcuna perdita significativa di tubulina nel lisato chiarificato nella prima centrifugazione (fase 3.2.7) rispetto all'omissione di questa fase (Figura 2A, B).

La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando tre metodi indipendenti: saggio BCA, saggio proteico Bradford e analisi densitometrica su gel SDS-PAGE19 (Figura 3). La resa complessiva di tubulina utilizzando la procedura descritta è stata di 123 mg di tubulina purificata da 250 g di tessuto neurale. Durante le misurazioni, è necessario tenere conto del fatto che l'elevata concentrazione di DTT nel tampone di conservazione ha un impatto significativo sul saggio BCA. Sia il tampone PEM che il tampone PBS, con l'aggiunta di DTT, aumentano l'assorbanza di fondo di circa 0,900 A595, il che riduce significativamente la capacità del saggio BCA (Figura 3A). L'effetto negativo della DTT è rilevabile anche dopo una diluizione dieci volte con acqua pura (dati non mostrati). Il test di Bradford non sembra essere influenzato dal buffer di conservazione (Figura 3B), come confermato dall'analisi densitometrica.

La purezza della preparazione di tubulina è stata verificata mediante analisi di spettrometria di massa presso due strutture indipendenti (VRI Brno, Repubblica Ceca; CEITEC MU Brno, Repubblica Ceca) utilizzando la ionizzazione elettrospray e MALDI-TOF. Entrambe le analisi hanno confermato la presenza di tubuline suine alfa e beta in diverse isoforme. La purezza complessiva è stata superiore al 97,07% (PSMs 1065), con le impurità più diffuse originate dalla cheratina di tipo II dell'Homo sapiens (PSMs 246, 2,24% delle impurezze) che sono state introdotte molto probabilmente durante l'isolamento della tubulina e la preparazione del campione per l'analisi MS/MS. Altre impurità composte da 322 PSM e solo albumina sierica, actina gamma e tripsinogeno originate da Sus scrofa sono state identificate con una risoluzione peptidica (0,0069%).

Negli esperimenti successivi, è stata verificata la conservazione della capacità di polimerizzazione dopo il congelamento rapido e lo stoccaggio in azoto liquido. L'aliquota di 10 mg/mL è stata rimossa dall'azoto liquido e scongelata lentamente con ghiaccio. Campioni di diverse concentrazioni (10 mg/mL, 8 mg/mL, 6 mg/mL, 4 mg/mL e 2 mg/mL) sono stati preparati diluendo le aliquote nel tampone PEM contenente DTT, ATP e GTP per l'esperimento di autoassemblaggio. Una serie di diluizioni è stata incubata a 37 °C per 60 minuti e la seconda è stata incubata su ghiaccio per 60 minuti. Entrambe le serie sono state centrifugate per 60 minuti a 21.000 x g e alla temperatura corrispondente (4 °C o 37 °C). 30 μL di surnatante sono stati rimossi e utilizzati per SDS-PAGE. Il surnatante rimanente è stato accuratamente rimosso utilizzando una pipetta e scartato. I pellet sono stati brevemente lavati aggiungendo 100 μM di tampone PEM, seguiti da una rimozione immediata con una pipetta. Successivamente, i pellet sono stati risospesi in 50 μL di tampone di caricamento SDS concentrato 1x in modo da preservare la concentrazione relativa di pellet e surnatante. A ciascun surnatante sono stati aggiunti 10 μL di tampone di caricamento SDS. Tutti i campioni sono stati analizzati utilizzando la SDS-PAGE e la colorazione Coomassie (Figura 4). Il volume di ciascun campione caricato su SDS-PAGE è stato regolato in base alla concentrazione iniziale, quindi la differenza di precipitazione dovuta alla concentrazione è più evidente. Il test di autoassemblaggio della tubulina nel tampone PEM ha confermato la capacità di formare fibre di tubulina in modo dipendente dalla temperatura.

È stato eseguito il test di assemblaggio della tubulina20,21 guidato da MAP2c che verifica la capacità della tubulina di interagire con altre proteine22. Le diluizioni seriali di MAP2c sono state preparate in cui 100 μL di aliquote di tubulina da 1 mg/mL sono stati miscelati con MAP2c alla concentrazione finale compresa tra 0 μM e 8 μM. Tutti i campioni sono stati preparati su ghiaccio diluendo in tampone PEM appena preparato con 1 mM DTT e 1 mM GTP. La tubulina è stata incubata per 15 minuti a 37 °C con diverse concentrazioni di MAP2c e centrifugata per 60 minuti a 21.000 x g e 37 °C. Il lavaggio finale del pellet è stato eseguito due volte con 100 μL di tampone PEM. L'esperimento ha confermato la capacità della tubulina preparata di subire la polimerizzazione guidata da MAP2c, poiché solo il campione senza MAP2c non formava un pellet (Figura 5).

La microscopia elettronica a trasmissione è stata ulteriormente utilizzata per confermare la presenza di filamenti di tubulina da esperimenti di co-polimerizzazione. Sospensioni di tubulina purificata precipitata con MAP2c sono state preparate per la microscopia elettronica a trasmissione mediante colorazione negativa. I campioni sono stati adsorbiti su griglie di rame rivestite di Formvar e stabilizzate al carbonio. Le griglie sono state quindi colorate negativamente con NH4MoO4 al 2% ed esaminate al microscopio elettronico con un ingrandimento di 18.000x e una tensione di accelerazione di 80 kV. La presenza di microtubuli omogenei con una chiara struttura filamentosa e dimensioni adeguate ha mostrato la capacità di formare microtubuli in conformazione nativa (Figura 6).

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Figura 1: Un diagramma schematico della separazione e della purificazione delle tubuline. Il numero tra parentesi si riferisce al passaggio del protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Separazione e purificazione della tubulina. (A) L'analisi SDS-PAGE di campioni prelevati durante la separazione della tubulina utilizzando la polimerizzazione guidata dalla temperatura (3 μL per linea). È visibile la diminuzione delle impurità con un aumento stabile dell'abbondanza relativa di tubuline (circa 50 kDa). I numeri sopra ogni riga corrispondono al numero di passaggio nel protocollo. (B) L'analisi SDS-PAGE di frazioni ottenute dopo cromatografia proteica su resina fosfo-cellulosica (4 μL per linea). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Concentrazione proteica. La serie di diluizione dell'albumina sierica bovina fino a 1 mg/mL in tampone PEM o PBS è stata confrontata con la serie di diluizione BSA contenente 0,1 ATP, 1 mM GTP, 1 mM DTT separatamente o in combinazione (0,1 mM ATP, 1 mM GTP e 1 mM DTT) nel tampone PEM o PBS. (A) Quando è stato utilizzato il test BCA, si è verificato un cambiamento significativo nello sfondo dei campioni contenenti DTT (simboli solidi). (B) Questo effetto non è stato rilevato quando le concentrazioni sono state misurate nel saggio di Bradford. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Saggio di autoassemblaggio della tubulina. L'analisi SDS-PAGE del saggio di autoassemblaggio ha confermato la capacità della tubulina immagazzinata incubata a (A) 4 °C o (B) 37 °C di polimerizzare in modo dipendente dalla temperatura in un ampio spettro di concentrazioni. (P - pellet, S - surnatante; la rispettiva concentrazione di tubulina è indicata sopra ogni coppia di linee; la quantità di ciascun campione caricato era di 10 μg). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Saggio di co-sedimentazione della tubulina. L'analisi SDS-PAGE dell'assemblaggio della tubulina MAP2c-assisted ha confermato la capacità della tubulina immagazzinata di subire polimerizzazione guidata dall'interazione con la proteina associata ai microtubuli in modo concentrazione-dipendente. La concentrazione molare di MAP2c è indicata sopra ogni riga. (P - pellet, S - surnatante). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Microscopia elettronica a trasmissione. Le microfotografie TEM hanno mostrato che la tubulina si assembla (A) in microtubuli di diametro appropriato (B) costituiti da filamenti omogenei di tubulina decorati con proteine MAP2c. La barra corrisponde a 1000 nm (A) e 200 nm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il tessuto neurale proveniente da qualsiasi fonte è un materiale eccellente per l'isolamento della tubulina poiché i dendriti e gli assoni dei neuroni sono ricchi di microtubuli (fino al 40%)23. Il tessuto cerebrale può essere ottenuto in quantità relativamente facili e sufficienti. Lo svantaggio principale potrebbe essere un livello non specificato di modifiche post-traduzionali, che possono influire sugli esperimenti successivi24,25. In caso contrario, l'unica preoccupazione è il rapido degrado del materiale di partenza, soprattutto in condizioni di caldo. Abbiamo impiegato diversi scambi di buffer di trasferimento per migliorare la dissipazione del calore prima del trasporto e il trasporto rapido per la lavorazione, che inizia il prima possibile. Il tessuto fresco viene sezionato in condizioni che ne impediscono il riscaldamento e omogeneizzato in un tampone contenente GTP e glicerolo, che stabilizza ulteriormente la tubulina26.

Nel protocollo presentato è stata introdotta la fase di chiarificazione (fase 3.2.7) del lisato grezzo. La centrifugazione prolungata prima della prima polimerizzazione è generalmente sconsigliata a causa della suscettibilità della tubulina alle modificazioni irreversibili e alle proteasi. D'altra parte, i presenti esperimenti hanno dimostrato che una breve rotazione ad alta forza G riduce i detriti e quindi aumenta il volume relativo dell'omogenato trattato senza influire significativamente sulla qualità della tubulina.

L'esatta determinazione della concentrazione proteica è essenziale per ulteriori esperimenti, soprattutto quando si studiano le interazioni con proteine leganti la tubulina o inibitori. Durante le indagini, abbiamo riscontrato differenze significative nei risultati dei saggi di concentrazione proteica. Il motivo principale era la presenza di DTT, GTP e ATP ad alte concentrazioni che interferivano con i saggi. Il test BCA è stato spostato ai limiti superiori a causa dell'elevata quantità di DTT nel buffer di conservazione, diminuendo la capacità del test. Inoltre, i massimi di assorbanza simili delle proteine e dell'ATP o GTP hanno causato incongruenze nella determinazione della concentrazione proteica utilizzando l'assorbanza a 280 nm. Lo stesso problema era evidente nelle letture del rivelatore UV FPLC. Il test più affidabile, con risultati stabili, è stato il test delle proteine di Bradford, in cui non è stata osservata alcuna influenza dei composti tampone. Tuttavia, è essenziale preparare la serie di diluizione standard delle proteine nel tampone di conservazione.

La capacità della tubulina purificata di creare disposizioni appropriate è un prerequisito per gli esperimenti successivi. La tubulina è, per natura, altamente incline alla degradazione anche nell'ambiente ricco di glicerolo-GTP, con conseguente ridotta capacità di formare filamenti omogenei. È fondamentale seguire il processo di purificazione e verificare sperimentalmente la capacità della tubulina immagazzinata di polimerizzare in filamenti regolari stabili. Diversi metodi indipendenti per verificare lo stato della tubulina sono stati introdotti in vivo e in vitro. Tra i più importanti, la spettroscopia di dicroismo circolare27, il saggio di risonanza plasmonica di superficie28, il saggio di spostamento termico29, il saggio di inibizione della polimerizzazione30, la colorazione in immunofluorescenza31,32, la coprecipitazione22,33 e l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione32 può essere menzionato. Il saggio di polimerizzazione e la coprecipitazione della tubulina utilizzati in questo protocollo sono facili da eseguire. Possono essere valutati rapidamente dai pellet presenti sul fondo del tubo o utilizzando SDS-PAGE. D'altra parte, la tubulina precipitata può essere sotto forma di aggregati. Metodi più sofisticati, come la microscopia elettronica a trasmissione, devono essere inclusi per confermare la presenza di fibre di microtubuli per il controllo di qualità.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

Lo studio è stato supportato dall'Agenzia per la Tecnologia della Repubblica Ceca (progetto nr. TN02000017 - Centro Nazionale per le Biotecnologie in Medicina Veterinaria - NaCeBiVet).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubes------Common material
10 mL tubes------Common material
50 mL tubes------Common material
ATPROTHHN35.2Analytical grade
DMSOROTHA994.2Analytical grade
Dounce glass homogenizerP-LABH244043Homogenizer
DTTROTH6908.1Analytical grade
EGTAROTH3054.3Analytical grade
EthanolPENTA70390-11001Analytical grade
GlycerolROTH6967.2Analytical grade
Graduated beakers------Common equipment
Graduated cilinders------Common equipment
GTPMERCK36051-31-7Very high quality
HClPENTA19360-11000Analytical grade
Izolated box for tissue transport------Common equipment
Kitchen blenderWaring7011HBGlass or plastic vessel
Liquid nitrogen------Common material
MES ROTH6066.4Analytical grade
MgCl2MERCK814733 Analytical grade
MgSO4PENTA43180-31000Analytical grade
NaOHPENTA15650-11000Analytical grade
Optima XPN100Beckman Coulter A94469Ultracentrifuge
Phosphocellulose columnVWRGENO786-1291Empty column
Phosphocellulose resinCreative - Biomart, incPhosphate-001CIon exchange resin
PIPESROTH9156.2Analytical grade
SaccharosePENTA24970-31000Analytical grade
Scales------Common equipment
Scissors------Common equipment
Spoons ------Plastic or glass
Ti45 rotorBeckman Coulter 339160Rotor for Ultracentrifuge
Tweezers------Common equipment
Ultra turrax IKA T18 basicIKA356 1000Laboratory dispenser
Water bath 37 °C------Stirred

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