A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע מהדק טלאי של תאים שלמים על פרוסות מוח המכילות נוירוני קיספפטין, המודולטור העיקרי של תאי הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH). על ידי הוספת ידע על פעילות נוירוני קיספפטין, כלי אלקטרופיזיולוגי זה שימש בסיס להתקדמות משמעותית בתחום הנוירואנדוקרינולוגיה במהלך 20 השנים האחרונות.
קיספפטינים חיוניים להבשלת ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדל (HPG) ולפוריות. נוירוני קיספפטין היפותלמיים הממוקמים בגרעין הפריוונטריקולרי האנטרו-ונטרלי ובגרעין הפריוונטריקולרי הרוסטרלי, כמו גם בגרעין ארקואט של ההיפותלמוס, מקרינים לנוירונים משחררי הורמונים גונדוטרופינים (GnRH), בין תאים אחרים. מחקרים קודמים הראו כי איתות קיספפטין מתרחש דרך קולטן Kiss1 (Kiss1r), מה שבסופו של דבר מעורר פעילות נוירונים GnRH. בבני אדם ובמודלים ניסיוניים של בעלי חיים, קיספפטין מספיקים לגרימת הפרשת GnRH, וכתוצאה מכך, שחרור הורמון מחלמן (LH) והורמון ממריץ זקיקים (FSH). מאחר שקיספפטינים ממלאים תפקיד חיוני בתפקודי הרבייה, חוקרים עובדים כדי להעריך כיצד הפעילות הפנימית של נוירוני קיספפטין היפותלמיים תורמת לפעולות הקשורות לרבייה ולזהות את המוליכים העצביים/נוירומודולטורים העיקריים המסוגלים לשנות תכונות אלה. טכניקת הידוק המדבקים של כל התא הפכה לכלי רב ערך לחקר פעילות נוירוני קיספפטין בתאי מכרסמים. טכניקה ניסיונית זו מאפשרת לחוקרים להקליט ולמדוד זרמים יוניים מעוררים ומעכבים ספונטניים, פוטנציאל קרום מנוחה, ירי פוטנציאלי פעולה ותכונות אלקטרופיזיולוגיות אחרות של קרום התא. במחקר הנוכחי נסקרים היבטים מכריעים של טכניקת מהדק טלאי של כל התא, הידועה כמדידות אלקטרופיזיולוגיות המגדירות נוירונים קיספפטין היפותלמיים, ודיון בסוגיות רלוונטיות לגבי הטכניקה.
הודג'קין והאקסלי ערכו את התיעוד התוך-תאי הראשון של פוטנציאל פעולה שתואר במספר מחקרים מדעיים. הקלטה זו בוצעה על אקסון הדיונון, בעל קוטר גדול (~500 מיקרומטר), המאפשר למקם מיקרואלקטרודה בתוך האקסון. עבודה זו סיפקה אפשרויות גדולות למחקר מדעי, שמאוחר יותר הגיע לשיאו ביצירת מצב מהדק מתח, ששימש לחקר הבסיס היוני של יצירת פוטנציאל פעולה 1,2,3,4,5,6,7,8. במהלך השנים, הטכניקה שופרה, והיא הפכה להיות מיושמת באופן נרח....
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של המכון למדעים ביו-רפואיים באוניברסיטת סאו פאולו ובוצעו בהתאם להנחיות האתיות שאומצו על ידי המכללה הברזילאית לניסויים בבעלי חיים.
1. הכנת פתרונות
כדי לחקור את ההשפעות האפשריות של הורמון גדילה רקומביננטי אנושי (hGH) על הפעילות של נוירוני קיספפטין היפותלמיים, ביצענו רישומי מהדק טלאי של תאים שלמים בפרוסות מוח והערכנו אם הורמון זה גורם לשינויים חריפים בפעילות של תאי עצב מסוג AVPV/PeNקיספפטין ו-ARHקיספפטין. במחקר זה נעשה שימוש בנק?.......
לפיתוח טכניקת מהדק המדבקים של התא כולו הייתה השפעה משמעותית על הקהילה המדעית, והיא נחשבה לבעלת חשיבות עליונה לפיתוח המחקר המדעי ואפשרה מספר תגליות. השפעתה על המדע הספיקה כדי להגיע לשיאה בפרס נובל לרפואה בשנת 1991, שכן תגלית זו פתחה את הדלת להבנה טובה יותר של האופן שבו תעלות יונים מתפקדות בתנ.......
אין להצהיר על ניגוד עניינים.
מחקר זה נתמך על ידי קרן המחקר של סאו פאולו [מספרי מענק FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); ועל ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finance Code 001" (HRV).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Compounds for aCSF, internal and slicing solutions | |||
ATP | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich/various | C7902 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich/various | G7021 | |
EGTA | Sigma Aldrich/various | O3777 | |
HEPES | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
KCL | Sigma Aldrich/various | P5405 | |
K-gluconate | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
KOH | Sigma Aldrich/various | P5958 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M9272 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
NaCl | Sigma Aldrich/various | S5886 | |
NaH2PO4 | Sigma Aldrich/various | S5011 | |
NaHCO3 | Sigma Aldrich/various | S5761 | |
nitric acid | Sigma Aldrich/various | 225711 | CAUTION |
Sucrose | Sigma Aldrich/various | S1888 | |
Equipments | |||
Air table | TMC | 63-534 | |
Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
Computer | various | - | |
DIGIDATA 1440 LOW-NOISE DATA ACQUISITION SYSTEM | Molecular Devices | DD1440 | |
Digital peristaltic pump | Ismatec | ISM833C | |
Faraday cage | TMC | 81-333-03 | |
Imaging Camera | Leica | DFC 365 FX | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | Roe-200 | |
Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
Microscope | Leica | DM6000 FS | |
Osteotome | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 128 | |
Recovery chamber | Warner Instruments/Harvard apparatus | - | can be made in-house |
Recording chamber | Warner Instruments | 640277 | |
Spatula | Fisher Scientific /various | FISH-14-375-10; FISH-21-401-20 | |
Vibratome | Leica | VT1000 S | |
Water Bath | Fisher Scientific /various | Isotemp | |
Software and systems | |||
AxoScope 10 software | Molecular Devices | - | Commander Software |
LAS X wide field system | Leica | - | Image acquisition and analysis |
MultiClamp 700B | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | Commander Software |
PCLAMP 10 SOFTWARE FOR WINDOWS | Molecular Devices | Pclamp 10 Standard | |
Tools | |||
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Warner Instruments | 64-1309 | |
Curved hemostatic forcep | various | - | |
cyanoacrylate glue | LOCTITE/various | - | |
Decapitation scissors | various | - | |
Filter paper | various | - | |
Glass capillaries (micropipette) | World Precision Instruments, Inc | TW150F-4 | |
Iris scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 65-66 | |
Pasteur glass pipette | Sigma Aldrich/various | CLS7095B9-1000EA | |
Petri dish | various | - | |
Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0756 | |
Razor blade for brain dissection | TED PELLA | TEDP-121-1 | |
Razor blade for the vibratome | TED PELLA | TEDP-121-9 | |
Scissors | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 71-72, 48,49; | |
silicone teat | various | - | |
Slice Anchor | Warner Instruments | 64-0246 | |
Syringe filters | Merck Millipore Ltda | SLGVR13SL | Millex-GV 0.22 μm |
Tweezers | Bonther equipamentos & Tecnologia/various | 131, 1518 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved