Overvåking av stubb1-mediert pexophagy

Pattedyrceller kan snu peroksisomer gjennom Stub1-mediert pexophagy. Banen tillater potensielt cellulær kontroll av mengden og kvaliteten på peroksisomer. Under denne prosessen translokerer varmesjokkprotein 70 og ubiquitin E3-ligasen, Stub1, på peroksisomer som skal overføres for å initiere pexophagy. Stub1-ligaseaktiviteten tillater akkumulering av ubiquitin og andre autofagirelaterte moduler på målrettede peroksisomer. Forhøyede nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) i peroksisomale lumen kan aktivere Stub1-mediert pexophagy. Man kan derfor bruke fargeassistert ROS-generering for å utløse og overvåke denne banen. Denne artikkelen skisserer prosedyrene for bruk av to klasser av fargestoffer, fluorescerende proteiner og syntetiske fluoroforer, for å initiere pexophagy i pattedyrcellekulturer. Disse fargeassisterte ROS-generasjonsbaserte protokollene kan ikke bare brukes til å målrette alle peroksisomer i en cellepopulasjon globalt, men kan også tillate manipulering av individuelle peroksisomer i enkeltceller. Vi beskriver også hvordan Stub1-mediert pexophagy kan følges ved hjelp av levende cellemikroskopi.