A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). אנו מספקים גם שיטות מפורטות לייצור לחץ גזירה ומתיחה כדי לחקור לחץ מכני ב- hSVECs.
ניתוח השתלת מעקף עורקים כליליים (CABG) הוא הליך לחידוש שריר הלב האיסכמי. וריד ספנוס נשאר בשימוש כצינור CABG למרות הפטנט המופחת לטווח ארוך בהשוואה לצינורות עורקים. העלייה הפתאומית של מתח המודינמי הקשור לעורק השתל גורמת לנזק לכלי הדם, במיוחד לאנדותל, שעשוי להשפיע על הפטנט הנמוך של שתל הווריד הספנוס (SVG). במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, האפיון וההרחבה של תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). תאים שבודדו על ידי עיכול collagenase מציגים את המורפולוגיה הטיפוסית של אבן מרוצפת ומבטאים סמני תאי אנדותל CD31 ו- VE-cadherin. כדי להעריך את השפעת הלחץ המכאני, נעשה שימוש בפרוטוקולים במחקר זה כדי לחקור את שני הגירויים הפיזיים העיקריים, לחץ גזירה ומתיחה, על SVGs עורקיים. hSVECs מתורבתים בתא זרימה מקביל של לוחות כדי לייצר לחץ גזירה, ומראים יישור בכיוון הזרימה וביטוי מוגבר של KLF2, KLF4 ו- NOS3. hSVECs ניתן גם לתרבית בקרום סיליקון המאפשר מתיחה תאית מבוקרת המחקה מתיחה ורידית (נמוכה) ועורקית (גבוהה). תבנית F-אקטין של תאי אנדותל והפרשת תחמוצת החנקן (NO) מווסתים בהתאם על ידי מתיחה עורקית. לסיכום, אנו מציגים שיטה מפורטת לבידוד hSVECs כדי לחקור את ההשפעה של לחץ מכני המודינמי על פנוטיפ אנדותל.
תפקוד לקוי של תאי אנדותל (EC) הוא שחקן מפתח בכשל השתלת ורידים ספניים 1,2,3,4. העלייה המתמשכת של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית גורמת לפנוטיפ פרו-דלקתי של תאי אנדותל ורידים ספנוסיים אנושיים (hSVECs)3,4,5,6. המסלולים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם מובנים במלואם, ופרוטוקולים סטנדרטיים למחקרי מבחנה עשויים למנף את המאמצים לתובנות חדשות בתחום. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד, אפיון והרחבה של hSVECs וכיצד לחש....
מקטעים לא בשימוש של ורידים ספניים התקבלו מחולים שעברו ניתוח מעקפים אבי העורקים במכון הלב (InCor), בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סאו פאולו. כל האנשים נתנו הסכמה מדעת להשתתף במחקר, אשר נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית.
1. בידוד, תרבית ואפיון של תאי אנדותל ראשוניים של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs)
בדרך כלל, ECs דבק ניתן לראות 3-4 ימים לאחר החילוץ. hSVECs יוצרים בתחילה אשכולות של תאים ומציגים מורפולוגיה טיפוסית של "אבן מרוצפת" (איור 1B). הם מבטאים את סמני EC CD31 (איור 1C,D) ו-VE-cadherin (איור 1D). hSVECs יכולים להיות מופצים בקלות על צלחת תרבית תאים מט?.......
מקטע הוורידים הספנוס צריך להיות לפחות 2 ס"מ כדי לבודד בהצלחה hSVECs. מקטעים קטנים קשים לטיפול וקושרים את קצות כלי הדם כדי לשמור על תמיסת הקולגנאז לבידוד התאים. שטח הפנים המואר המצומצם אינו מניב מספיק תאים כדי להרחיב את התרבית. כדי למזער את הסיכון של זיהום עם שאינם ECs, מניפולציה של קטע הווריד saphen.......
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
JEK נתמך על ידי מענקים מ- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ו- 2013/17368-0] ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ו- 309179/2013-0). AAM נתמך על ידי מענקים של Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (אוניברסלי - 407911/2021-9).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solution | Gibco | 25200072 | |
15 µ slide I 0.4 Luer | Ibidi | 80176 | |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25.VJW | |
8-well chamber slide with removable well | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
Acetic Acid (Glacial) | Millipore | 100063 | |
Acrylic sheet 1 cm thick | Plexiglass | ||
Anti-CD31 antibody | Abcam | ab24590 | |
Anti-CD31, FITC antibody | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
Anti-VE-cadherin antibody | Cell Signaling | 2500 | |
Bioflex plates collagen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
Bovine serum albumin solution | Sigma-Aldrich | A8412 | |
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
Cyclophilin forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
Cyclophilin reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
EBM-2 basal medium | Lonza | CC3156 | |
EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
Flexcell FX-5000 tension system | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma-Aldrich | F4680 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mL | Blau Farmacêutica | SKU 68027 | |
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit) | Ibidi | 10902 | |
KLF2 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
KLF2 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
KLF4 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
KLF4 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
NOA 280 nitric oxide analyzer | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
NOS3 forward primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
NOS3 reverse primer | Thermo Fisher Scientific | Custom designed | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirs | Ibidi | 10962 | |
Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
Potassium Iodide | Sigma-Aldrich | 221945 | |
QuanTitec SYBR green PCR kit | Qiagen | 204143 | |
QuantStudio 12K flex platform | Applied Biosystems | 4471087 | |
RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
Slide glass (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
Sodium nitrite | Sigma-Aldrich | 31443 | |
SuperScript IV first-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypan blue stain 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
Type II collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved