Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). אנו מספקים גם שיטות מפורטות לייצור לחץ גזירה ומתיחה כדי לחקור לחץ מכני ב- hSVECs.

Abstract

ניתוח השתלת מעקף עורקים כליליים (CABG) הוא הליך לחידוש שריר הלב האיסכמי. וריד ספנוס נשאר בשימוש כצינור CABG למרות הפטנט המופחת לטווח ארוך בהשוואה לצינורות עורקים. העלייה הפתאומית של מתח המודינמי הקשור לעורק השתל גורמת לנזק לכלי הדם, במיוחד לאנדותל, שעשוי להשפיע על הפטנט הנמוך של שתל הווריד הספנוס (SVG). במאמר זה אנו מתארים את הבידוד, האפיון וההרחבה של תאי אנדותל של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs). תאים שבודדו על ידי עיכול collagenase מציגים את המורפולוגיה הטיפוסית של אבן מרוצפת ומבטאים סמני תאי אנדותל CD31 ו- VE-cadherin. כדי להעריך את השפעת הלחץ המכאני, נעשה שימוש בפרוטוקולים במחקר זה כדי לחקור את שני הגירויים הפיזיים העיקריים, לחץ גזירה ומתיחה, על SVGs עורקיים. hSVECs מתורבתים בתא זרימה מקביל של לוחות כדי לייצר לחץ גזירה, ומראים יישור בכיוון הזרימה וביטוי מוגבר של KLF2, KLF4 ו- NOS3. hSVECs ניתן גם לתרבית בקרום סיליקון המאפשר מתיחה תאית מבוקרת המחקה מתיחה ורידית (נמוכה) ועורקית (גבוהה). תבנית F-אקטין של תאי אנדותל והפרשת תחמוצת החנקן (NO) מווסתים בהתאם על ידי מתיחה עורקית. לסיכום, אנו מציגים שיטה מפורטת לבידוד hSVECs כדי לחקור את ההשפעה של לחץ מכני המודינמי על פנוטיפ אנדותל.

Introduction

תפקוד לקוי של תאי אנדותל (EC) הוא שחקן מפתח בכשל השתלת ורידים ספניים 1,2,3,4. העלייה המתמשכת של לחץ גזירה ומתיחה מחזורית גורמת לפנוטיפ פרו-דלקתי של תאי אנדותל ורידים ספנוסיים אנושיים (hSVECs)3,4,5,6. המסלולים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם מובנים במלואם, ופרוטוקולים סטנדרטיים למחקרי מבחנה עשויים למנף את המאמצים לתובנות חדשות בתחום. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט לבידוד, אפיון והרחבה של hSVECs וכיצד לחש....

Protocol

מקטעים לא בשימוש של ורידים ספניים התקבלו מחולים שעברו ניתוח מעקפים אבי העורקים במכון הלב (InCor), בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סאו פאולו. כל האנשים נתנו הסכמה מדעת להשתתף במחקר, אשר נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית.

1. בידוד, תרבית ואפיון של תאי אנדותל ראשוניים של ורידים ספניים אנושיים (hSVECs)

  1. הכנה
    1. Autoclave זוג מלקחיים ישרים או מעוקלים ומספריים רקמות (7-8 ס"מ).
    2. מכינים ג'לטין סטרילי. יש לערבב 0.1 גרם (0.1% w/v) או 3 גרם (3% w/v) של ג'לטין עור חזירי עם 100 מ"ל מים טהורים במיוחד, autoclave במשך 15 דקות, ולאחסן ב 4 ° C. יש לחמם ל-37°C כדי לנזול לפני ציפוי הכלים והמגלשות של תרבית התא.
    3. ....

Representative Results

בדרך כלל, ECs דבק ניתן לראות 3-4 ימים לאחר החילוץ. hSVECs יוצרים בתחילה אשכולות של תאים ומציגים מורפולוגיה טיפוסית של "אבן מרוצפת" (איור 1B). הם מבטאים את סמני EC CD31 (איור 1C,D) ו-VE-cadherin (איור 1D). hSVECs יכולים להיות מופצים בקלות על צלחת תרבית תאים מט?.......

Discussion

מקטע הוורידים הספנוס צריך להיות לפחות 2 ס"מ כדי לבודד בהצלחה hSVECs. מקטעים קטנים קשים לטיפול וקושרים את קצות כלי הדם כדי לשמור על תמיסת הקולגנאז לבידוד התאים. שטח הפנים המואר המצומצם אינו מניב מספיק תאים כדי להרחיב את התרבית. כדי למזער את הסיכון של זיהום עם שאינם ECs, מניפולציה של קטע הווריד saphen.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

JEK נתמך על ידי מענקים מ- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ו- 2013/17368-0] ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ו- 309179/2013-0). AAM נתמך על ידי מענקים של Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ו- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (אוניברסלי - 407911/2021-9).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-0.02% EDTA solutionGibco25200072
15 µ slide I 0.4 Luer Ibidi80176
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571
6-wells equibiaxial loading station of 25 mm Flexcell International CorporationLS-3000B25.VJW
8-well chamber slide with removable wellThermo Fisher Scientific154453
Acetic Acid (Glacial)Millipore100063
Acrylic sheet 1 cm thickPlexiglass
Anti-CD31 antibodyAbcamab24590
Anti-CD31, FITC antibodyThermo Fisher ScientificMHCD3101
Anti-VE-cadherin antibodyCell Signaling2500
Bioflex plates collagen IFlexcell International CorporationBF3001C
Bovine serum albumin solutionSigma-AldrichA8412
Cotton suture EP 3.5 15 x 45 cmBrasutureAP524
Cyclophilin forward primerThermo Fisher ScientificCustom designed
Cyclophilin reverse primerThermo Fisher ScientificCustom designed
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD4540
EBM-2 basal mediumLonzaCC3156
EGM-2 SingleQuots supplementsLonzaCC4176
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific2657-029
Flexcell FX-5000 tension systemFlexcell International CorporationFX-5000T
Fluoromount aqueous mounting mediumSigma-AldrichF4680
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG2500
GlycerolSigma-AldrichG5516
Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11001
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11008
Heparin sodium from porcine intestinal mucosa 5000 IU/mLBlau FarmacêuticaSKU 68027
Ibidi pump system (Pump + Fluidic Unit)Ibidi10902
KLF2 forward primerThermo Fisher ScientificCustom designed
KLF2 reverse primerThermo Fisher ScientificCustom designed
KLF4 forward primerThermo Fisher ScientificCustom designed
KLF4 reverse primerThermo Fisher ScientificCustom designed
NOA 280 nitric oxide analyzerSievers InstrumentsNOA-280i-1
NOS3 forward primerThermo Fisher ScientificCustom designed
NOS3 reverse primerThermo Fisher ScientificCustom designed
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich158127
Perfusion set 15 cm, ID 1.6 mm, red, 10 mL reservoirsIbidi10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA12380
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010031
Potassium IodideSigma-Aldrich221945
QuanTitec SYBR green PCR kitQiagen204143
QuantStudio 12K flex platform Applied Biosystems4471087
RNeasy micro kit Quiagen74004
Slide glass (24 mm x 60 mm)Knittel GlassVD12460Y1D.01
Sodium nitriteSigma-Aldrich31443
SuperScript IV first-strand synthesis systemThermo Fisher Scientific18091200
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Trypan blue stain 0.4%Gibco15250-061
Type II collagenase from Clostridium histolyticumSigma-AldrichC6885

References

  1. Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
  2. Ali, M. H., Schumacker, P. T.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved