Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לבידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים (MSC) שמקורם ברקמת שומן מחולדות Sprague Dawley.

Abstract

תאים מזנכימליים בוגרים חוללו מהפכה בביולוגיה המולקולרית ובביולוגיה התאית בעשורים האחרונים. הם יכולים להתמיין לסוגי תאים מיוחדים שונים, בנוסף ליכולתם הגדולה להתחדשות עצמית, הגירה והתפשטות. רקמת השומן היא אחד המקורות הפחות פולשניים והנגישים ביותר של תאים מזנכימליים. כמו כן, דווח כי יש לו תשואות גבוהות יותר בהשוואה למקורות אחרים, כמו גם תכונות אימונומודולטוריות מעולות. לאחרונה פורסמו נהלים שונים להשגת תאים מזנכימליים בוגרים ממקורות רקמה שונים וממיני בעלי חיים. לאחר הערכת הקריטריונים של מחברים מסוימים, תיקננו מתודולוגיה ישימה למטרות שונות וניתנת לשחזור בקלות. מאגר של מקטע כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן פרירנלית ואפידידימלית איפשר לנו לפתח תרביות ראשוניות עם מורפולוגיה ופונקציונליות אופטימליות. התאים נצפו דבוקים למשטח הפלסטיק במשך 24 שעות, והציגו מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, עם הארכות ונטייה ליצור מושבות. טכניקות ציטומטריית זרימה (FC) ואימונופלואורסנציה (IF) שימשו להערכת הביטוי של סמני הממברנה CD105, CD9, CD63, CD31 ו- CD34. יכולתם של תאי גזע שמקורם בשומן (ASC) להתמיין לשושלת האדיפוגנית הוערכה גם באמצעות קוקטייל של גורמים (4 מיקרומטר אינסולין, 0.5 מילימטר 3-מתיל-איזו-בוטיל-קסנטין ו-1 מיקרומטר דקסמתזון). לאחר 48 שעות, אובדן הדרגתי של מורפולוגיה פיברובלסטואיד נצפתה, ובגיל 12 ימים, נוכחות של טיפות שומנים חיובי שמן כתמים אדום אושר. לסיכום, מוצע הליך להשגת תרביות ASC אופטימליות ותפקודיות ליישום ברפואה רגנרטיבית.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) השפיעו מאוד על הרפואה הרגנרטיבית בשל יכולתם הגבוהה להתחדשות עצמית, התפשטות, הגירה והתמיינות לשושלות תאים שונות 1,2. כיום, מחקרים רבים מתמקדים בפוטנציאל שלהם לטיפול ואבחון של מחלות שונות.

ישנם מקורות שונים של תאים מזנכימליים: מח עצם, שרירי שלד, מי שפיר, זקיקי שיער, שליה ורקמת שומן, בין היתר. הם מתקבלים ממינים שונים, כולל בני אדם, עכברים, חולדות, כלבים וסוסים3. MSCs שמקורם במח עצם (BMSCs) שימשו במשך שנים רבות כמקור עיקרי לתאי גזע ברפואה רגנרטיבית וכחלופה לשימוש בתאי גזע עובריים4. עם זאת, MSCs נגזר שומן, או תאי ג....

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות המקסיקניות לטיפול בבעלי חיים, בהתבסס על המלצות האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומיות (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, מקסיקו). הפרוטוקול נבדק, אושר ונרשם על ידי ועדת האתיקה לחקר הבריאות של המכון המקסיקני דל סגורו חברתי (R-2021-785-092).

Representative Results

רקמת השומן התקבלה מחולדות בוגרות של Sprague Dawley בגילאי 3-4 חודשים ומשקל גוף של 401 ± 41 גרם (ממוצע גיאומטרי ± SD). ערך ממוצע של 3.8 גרם של רקמת שומן אפידידימלית ופרירנלית התאים לניתוח של 15 מיצויים ניסיוניים. לאחר 24 שעות של תרבית, אוכלוסיות התאים נותרו דבוקות למשטח הפלסטיק והציגו מורפולוגיה הטרוגנית. ה.......

Discussion

בארבעת העשורים האחרונים מאז גילוי MSCs, כמה קבוצות של חוקרים תיארו הליכים להשגת MSCs מרקמות ומינים שונים. אחד היתרונות של שימוש בחולדות כמודל של בעלי חיים הוא התחזוקה הקלה וההתפתחות המהירה שלהן, כמו גם הקלות של קבלת MSCs מרקמת השומן. מקורות רקמה שונים תוארו לקבלת ASCs, כגון ויסצרלי, פריrenal, epididymal, ו?.......

Acknowledgements

המחברים אסירי תודה למכון המקסיקני לביטוח לאומי (IMSS) ולבית החולים לילדים של מקסיקו, פדריקו גומז (HIMFG) ולצוות Bioterio של תיאום המחקר של IMSS, על התמיכה שניתנה לביצוע פרויקט זה. אנו מודים למועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה על מלגת AOC (815290) ולאנטוניו דוארטה רייס על התמיכה הטכנית בחומר האודיו-ויזואלי.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BHyCloneSV30078.01
Analytical balanceSartoriusAX224
Antibody anti- CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Antibody anti-C63Santa CruzSc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)RD Systems.No. F103B
Bottle Top Filter SterileCORNING10718003
Cell and Tissue Culture FlasksBIOFIL170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slidesSIGMA Aldrich Z359629
Cell wells: 6 well with LidCORNING25810
Centrifuge conical tubesHeTTICHROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubesFischer ScientificM0018242_44797
Collagen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
Culture tubesGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman CoulterFree version
CytoFlex LX cytometerBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 DyeThermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosin yellowishHycel300
Ethanol 96%Baker64-17-5
Falcon tubes 15 mLGreiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mLGreiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum CORNING35-010-CV
GelatinSIGMA Aldrich128111163
GentamicinGIBCO15750045
Glycerin-High PurityHerschi Trading 56-81-5
HematoxylinAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Sc.50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)ArandaSV057430
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5Free version
Biological Safety Cabinet Class IINuAire12082100801
Epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Inverted microscope Olympus CK40CK40-G100
Non-essential amino acids 100XGIBCO11140050
Micro tubes 2 mL Sarstedt 72695400
Micro tubes 1,5 mLSarstedt 72706400
Micropipettes 0.2-2 μLFinnpipetteE97743
Micropipettes 2-20 μLFinnpipetteF54167
Micropipettes 20-200 μLFinnpipetteG32419
Micropipettes 100-1000 μLFinnpipetteFJ39895
Nitrogen tank liquidTaylor-Wharton681-021-06
ParaformaldehydeSIGMA AldrichSLBC3029V
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Cell cultureCORNING Inc480167
Pipet TipsAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Potassium chloride J.T.Baker7447-40-7
Potassium Phosphate DibasicJ.T Baker2139900
S1 Pipette FillersThermo Sc9531
Serological pipette 5 mLPYREXL010005
Serological pipette 10 mLPYREXL010010
Sodium bicarbonateJ.T Baker144-55-8
Sodium chloride J.T.Baker15368426
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousJ.T Baker7558-79-4
Sodium pyruvateGIBCO BRL11840-048
Syringe Filter SterileCORNING431222
SpectrophotometerPerkinElmer Lambda 25L6020060
Titer plate shakerLAB-LINE1250
Transfer pipetsSamco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue stainGIBCO1198566
Trypsin From Porcine PancreasSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)Pet's PharmaQ-7972-025

References

  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J.

Explore More Articles

194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved