בידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמת שומן של חולדות Sprague Dawley

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לבידוד וזיהוי תאי גזע מזנכימליים (MSC) שמקורם ברקמת שומן מחולדות Sprague Dawley.

Abstract

תאים מזנכימליים בוגרים חוללו מהפכה בביולוגיה המולקולרית ובביולוגיה התאית בעשורים האחרונים. הם יכולים להתמיין לסוגי תאים מיוחדים שונים, בנוסף ליכולתם הגדולה להתחדשות עצמית, הגירה והתפשטות. רקמת השומן היא אחד המקורות הפחות פולשניים והנגישים ביותר של תאים מזנכימליים. כמו כן, דווח כי יש לו תשואות גבוהות יותר בהשוואה למקורות אחרים, כמו גם תכונות אימונומודולטוריות מעולות. לאחרונה פורסמו נהלים שונים להשגת תאים מזנכימליים בוגרים ממקורות רקמה שונים וממיני בעלי חיים. לאחר הערכת הקריטריונים של מחברים מסוימים, תיקננו מתודולוגיה ישימה למטרות שונות וניתנת לשחזור בקלות. מאגר של מקטע כלי דם סטרומה (SVF) מרקמת שומן פרירנלית ואפידידימלית איפשר לנו לפתח תרביות ראשוניות עם מורפולוגיה ופונקציונליות אופטימליות. התאים נצפו דבוקים למשטח הפלסטיק במשך 24 שעות, והציגו מורפולוגיה דמוית פיברובלסט, עם הארכות ונטייה ליצור מושבות. טכניקות ציטומטריית זרימה (FC) ואימונופלואורסנציה (IF) שימשו להערכת הביטוי של סמני הממברנה CD105, CD9, CD63, CD31 ו- CD34. יכולתם של תאי גזע שמקורם בשומן (ASC) להתמיין לשושלת האדיפוגנית הוערכה גם באמצעות קוקטייל של גורמים (4 מיקרומטר אינסולין, 0.5 מילימטר 3-מתיל-איזו-בוטיל-קסנטין ו-1 מיקרומטר דקסמתזון). לאחר 48 שעות, אובדן הדרגתי של מורפולוגיה פיברובלסטואיד נצפתה, ובגיל 12 ימים, נוכחות של טיפות שומנים חיובי שמן כתמים אדום אושר. לסיכום, מוצע הליך להשגת תרביות ASC אופטימליות ותפקודיות ליישום ברפואה רגנרטיבית.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) השפיעו מאוד על הרפואה הרגנרטיבית בשל יכולתם הגבוהה להתחדשות עצמית, התפשטות, הגירה והתמיינות לשושלות תאים שונות ^1,2. כיום, מחקרים רבים מתמקדים בפוטנציאל שלהם לטיפול ואבחון של מחלות שונות.

ישנם מקורות שונים של תאים מזנכימליים: מח עצם, שרירי שלד, מי שפיר, זקיקי שיער, שליה ורקמת שומן, בין היתר. הם מתקבלים ממינים שונים, כולל בני אדם, עכברים, חולדות, כלבים וסוסים³. MSCs שמקורם במח עצם (BMSCs) שימשו במשך שנים רבות כמקור עיקרי לתאי גזע ברפואה רגנרטיבית וכחלופה לשימוש בתאי גזע עובריים⁴. עם זאת, MSCs נגזר שומן, או תאי ג....

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהתאם להנחיות המקסיקניות לטיפול בבעלי חיים, בהתבסס על המלצות האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומיות (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, מקסיקו). הפרוטוקול נבדק, אושר ונרשם על ידי ועדת האתיקה לחקר הבריאות של המכון המקסיקני דל סגורו חברתי (R-2021-785-092).

Discussion

בארבעת העשורים האחרונים מאז גילוי MSCs, כמה קבוצות של חוקרים תיארו הליכים להשגת MSCs מרקמות ומינים שונים. אחד היתרונות של שימוש בחולדות כמודל של בעלי חיים הוא התחזוקה הקלה וההתפתחות המהירה שלהן, כמו גם הקלות של קבלת MSCs מרקמת השומן. מקורות רקמה שונים תוארו לקבלת ASCs, כגון ויסצרלי, פריrenal, epididymal, ו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	HyClone	SV30078.01
Analytical balance	Sartorius	AX224
Antibody anti- CD9 (C-4)	Santa Cruz	Sc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)	Santa Cruz	Sc-7045
Antibody anti-C63	Santa Cruz	Sc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594	Santa Cruz	Sc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680	Santa Cruz	Sc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3	Novus	NB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550	Invitrogen	SA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)	RD Systems.	No. F103B
Bottle Top Filter Sterile	CORNING	10718003
Cell and Tissue Culture Flasks	BIOFIL	170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slides	SIGMA Aldrich	Z359629
Cell wells: 6 well with Lid	CORNING	25810
Centrifuge conical tubes	HeTTICH	ROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubes	Fischer Scientific	M0018242_44797
Collagen IV	Worthington	LS004186
Cryovial	SPL Life Science	43112
Culture tubes	Greiner Bio-One	191180
CytExpert 2.0	Beckman Coulter	Free version
CytoFlex LX cytometer	Beckman Coulter	FLOW-2463VID03.17
DMEM	GIBCO	31600-034
DMSO	SIGMA Aldrich	67-68-5
DraQ7 Dye	Thermo Sc.	D15106
EDTA	SIGMA Aldrich	60-00-4
Eosin yellowish	Hycel	300
Ethanol 96%	Baker	64-17-5
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-One	227261
Fetal Bovine Serum	CORNING	35-010-CV
Gelatin	SIGMA Aldrich	128111163
Gentamicin	GIBCO	15750045
Glycerin-High Purity	Herschi Trading	56-81-5
Hematoxylin	AMRESCO	0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Sc.	50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)	Aranda	SV057430
L-Glutamine	GIBCO/ Thermo Sc.	25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5		Free version
Biological Safety Cabinet Class II	NuAire	12082100801
Epifluorescent microscope	Zeiss Axiovert 100M	21.0028.001
Inverted microscope	Olympus CK40	CK40-G100
Non-essential amino acids 100X	GIBCO	11140050
Micro tubes 2 mL	Sarstedt	72695400
Micro tubes 1,5 mL	Sarstedt	72706400
Micropipettes 0.2-2 μL	Finnpipette	E97743
Micropipettes 2-20 μL	Finnpipette	F54167
Micropipettes 20-200 μL	Finnpipette	G32419
Micropipettes 100-1000 μL	Finnpipette	FJ39895
Nitrogen tank liquid	Taylor-Wharton	681-021-06
Paraformaldehyde	SIGMA Aldrich	SLBC3029V
Penicillin / Streptomycin	GIBCO/ Thermo Sc.	15140122
Petri dish Cell culture	CORNING Inc	480167
Pipet Tips	Axygen Scientific	301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)	PISA Agropecuaria	Q-7833-215
Potassium chloride	J.T.Baker	7447-40-7
Potassium Phosphate Dibasic	J.T Baker	2139900
S1 Pipette Fillers	Thermo Sc	9531
Serological pipette 5 mL	PYREX	L010005
Serological pipette 10 mL	PYREX	L010010
Sodium bicarbonate	J.T Baker	144-55-8
Sodium chloride	J.T.Baker	15368426
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	J.T Baker	7558-79-4
Sodium pyruvate	GIBCO BRL	11840-048
Syringe Filter Sterile	CORNING	431222
Spectrophotometer	PerkinElmer Lambda 25	L6020060
Titer plate shaker	LAB-LINE	1250
Transfer pipets	Samco/Thermo Sc	728NL
Trypan Blue stain	GIBCO	1198566
Trypsin From Porcine Pancreas	SIGMA Aldrich	102H0234
Tween 20	SIGMA Aldrich	9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10x	BioGenex	HK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)	Pet's Pharma	Q-7972-025